陳美佳 呂福通 黃 霈 趙 綺

(廣西壯族自治區(qū)生殖醫(yī)院檢驗(yàn)科優(yōu)生遺傳實(shí)驗(yàn)室，南寧市 530021，電子郵箱：48174994@qq.com)

人類染色體檢測(cè)中，經(jīng)?？梢?jiàn)到個(gè)別染色體上的微小變異，表現(xiàn)為同源染色體大小、形態(tài)或著色等方面的變異，這些變異區(qū)域一般位于遺傳上不活躍的含高度重復(fù)DNA序列的異染色質(zhì)區(qū)。9號(hào)染色體異染色質(zhì)區(qū)的改變包括9號(hào)染色體臂間倒位和次縊痕的增加或減少，其中9號(hào)染色體臂間倒位的發(fā)生率約為1%[1]。9號(hào)染色體異態(tài)性攜帶者的外貌、智力與生長(zhǎng)發(fā)育基本正常，但目前9號(hào)染色體異態(tài)性與生育結(jié)局的相關(guān)性爭(zhēng)議較多。有學(xué)者認(rèn)為9號(hào)染色體異態(tài)性屬于正常變異，不會(huì)影響生育[1-2]；也有研究表明9號(hào)染色體異態(tài)性會(huì)產(chǎn)生不良的遺傳效應(yīng)[3-4]。本文探討不孕不育或不良妊娠結(jié)局患者的9號(hào)染色體異態(tài)性類型及其與生育結(jié)局的關(guān)系，旨在為生育指導(dǎo)和遺傳咨詢、改善生育結(jié)局提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年1月至2020年12月在我院進(jìn)行遺傳咨詢并行外周血染色體檢測(cè)的8 030例不孕不育或不良妊娠結(jié)局的患者作為研究對(duì)象。其中男性6 860例，平均年齡36.5歲，女性1 170例，平均年齡31.0歲。不孕不育的診斷標(biāo)準(zhǔn)：已婚夫婦未采用避孕措施達(dá)1年以上仍未生育者。不良妊娠結(jié)局的定義：不明原因的自然流產(chǎn)、胚胎停止發(fā)育、死胎、死產(chǎn)、難產(chǎn)、胎兒畸形或胎兒發(fā)育不良等非正常妊娠結(jié)局。均由?？漆t(yī)生排除男女雙方存在生殖器官的器質(zhì)性病變，以及內(nèi)分泌疾病、免疫和感染等因素。本研究經(jīng)廣西壯族自治區(qū)生殖醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(KY-LW-2020-1號(hào))。向研究對(duì)象詳細(xì)介紹本研究的具體內(nèi)容、可能的受益和風(fēng)險(xiǎn)后，研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

1.2 試劑與儀器 外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基、秋水仙素(廣東達(dá)輝生物技術(shù)有限公司)、胰蛋白酶(Gibco公司)。Olympus CX21型顯微鏡(日本Olympus公司)、上海北昂醫(yī)療技術(shù)有限公司的醫(yī)學(xué)圖像分析識(shí)別系統(tǒng)(版本號(hào)：BEION V 4.20)。

1.3 研究方法 (1)采血與接種：常規(guī)消毒研究對(duì)象肘部的皮膚，抽取2 mL肘靜脈血至肝素鈉抗凝管中，將0.5 mL抗凝血接種至外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)瓶進(jìn)行培養(yǎng)。(2)外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)：將培養(yǎng)瓶放置在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)69～72 h。(3)細(xì)胞收集：培養(yǎng)完成前30 min加入2滴100 μg/mL的秋水仙素進(jìn)行阻斷分裂以收集中期細(xì)胞。將培養(yǎng)液放入離心管內(nèi)，1 500 r/min離心10 min，棄上清液；加入5 mL 0.075 mol/L的氯化鉀固定液，在37 ℃水浴中低滲30 min；使用2 mL甲醇：冰醋酸(3 ∶1)配置的固定液預(yù)固定5 min；1 500 r/min離心10 min，棄上清液，加入8 mL固定液后1 500 r/min離心10 min，棄上清液，再重復(fù)上述固定操作2次。(4)滴片：1 500 r/min離心10 min，棄上清液，加1～2 mL固定液，混勻制成細(xì)胞懸液，將2～3滴細(xì)胞懸液分散滴在洗凈的冰凍玻片上，自然晾干。(5)烤片：將玻片置于70 ℃～80 ℃烤箱內(nèi)烤片2.5 h。(6)G顯帶消化與染色：烤片后第2天，在37 ℃水浴箱中用0.5%的胰蛋白酶消化，放入吉姆薩染液內(nèi)染色，染色完成后取出玻片，自然晾干后即可鏡檢。(7)染色體核型分析：用染色體分析軟件(上海北昂公司，版本：V4.20)進(jìn)行染色體核型分析。每份標(biāo)本在油鏡下計(jì)數(shù)30個(gè)分裂相，分析10個(gè)染色體核型，對(duì)異常者加倍計(jì)數(shù)和核型分析，并按照《人類細(xì)胞基因組學(xué)國(guó)際命名體系》(ISCN2016)[5]的規(guī)定對(duì)結(jié)果進(jìn)行描述，有高度重復(fù)DNA序列的區(qū)域?yàn)楫惾旧|(zhì)區(qū)，染色體異常檢測(cè)結(jié)果均由2名遺傳學(xué)專家進(jìn)行分析與復(fù)核。

2 結(jié) 果

8 030例不孕不育或不良妊娠結(jié)局患者中，共檢出9號(hào)染色體異態(tài)性攜帶者118例，占1.47%。其中9號(hào)染色體臂間倒位共97例，占全部患者的1.21%，占9號(hào)染色體異態(tài)性攜帶者的82.20%，核型均為inv(9)(p12;q13)；9號(hào)染色體次縊痕增加(核型為9qh+)20例，占9號(hào)染色體異態(tài)性攜帶者的16.95%；9號(hào)染色體次縊痕減少(核型為9qh-)1例，占9號(hào)染色體異態(tài)性攜帶者的0.85%。見(jiàn)表1。

表1 不同生育結(jié)局患者的9號(hào)染色體異態(tài)性類型

3 討 論

染色體倒位是指一條染色體內(nèi)同時(shí)發(fā)生兩處斷裂而形成的3個(gè)片段，翻轉(zhuǎn)180°后重新連接形成一條重排染色體，倒位發(fā)生在長(zhǎng)臂和短臂之間稱為臂間倒位。臂間倒位以9號(hào)染色體最為常見(jiàn)[6]，9號(hào)染色體臂間倒位在國(guó)外人群中的發(fā)生率為0.95 %～1.02 %，在國(guó)內(nèi)人群中的發(fā)生率約為1%[7-8]。本研究在8 030例不孕不育或不良妊娠結(jié)局的受檢者中，檢出9號(hào)染色體異態(tài)性攜帶者共118例，檢出率為1.47%，其中9號(hào)染色體臂間倒位的檢出率最高，為1.21%，較一般人群[7-8]略高。目前有關(guān)9號(hào)染色體臂間倒位區(qū)帶的研究較多，Starke等[9]報(bào)告9號(hào)染色體臂間倒位斷裂熱點(diǎn)區(qū)域位于9p12或9q13-21.1，本研究檢出的9號(hào)染色體臂間倒位斷裂位點(diǎn)均發(fā)生在9p12與9q13之間，說(shuō)明9號(hào)染色體的這段區(qū)域易發(fā)生斷裂。有文獻(xiàn)報(bào)告9號(hào)染色體pter到q12片段上存在松弛素基因，而松弛素可影響女性卵泡的成熟過(guò)程，也影響男性的精子運(yùn)動(dòng)和穿卵能力；9號(hào)染色體臂間倒位產(chǎn)生的位置效應(yīng)可能會(huì)影響松弛素基因的表達(dá)，從而導(dǎo)致生殖障礙[7]，當(dāng)臂間倒位發(fā)生在9q12遠(yuǎn)端時(shí)對(duì)生育的影響尤其明顯[10]。本研究中有41例不孕不育患者、56例不良妊娠結(jié)局患者檢出9號(hào)染色體臂間倒位，倒位均發(fā)生在9q12的遠(yuǎn)端區(qū)域，但未檢測(cè)9號(hào)染色體臂間倒位攜帶者是否有松弛素基因表達(dá)異常，今后仍需進(jìn)一步研究。

9號(hào)染色體臂間倒位與不孕不育、不良妊娠結(jié)局的關(guān)系一直有爭(zhēng)議。有文獻(xiàn)顯示，9號(hào)染色體臂間倒位與生育結(jié)局異常沒(méi)有直接關(guān)系，屬于遺傳學(xué)多態(tài)性[1-2]。但也有學(xué)者報(bào)告，9號(hào)染色體臂間倒位在不孕不育或不良妊娠結(jié)局人群中的檢出率較高[3-4]，9號(hào)染色體臂間倒位可干擾減數(shù)分裂時(shí)同源染色體的配對(duì)或造成其他染色體的配對(duì)異常，從而引起臨床效應(yīng)[11]。9號(hào)染色體的倒位重排還可能導(dǎo)致部分基因的順序發(fā)生改變，影響基因的正常表達(dá)，表現(xiàn)為胚胎發(fā)育異常或不孕不育[7]。然而，9號(hào)染色體的臂間倒位是否對(duì)生育結(jié)局有影響，筆者認(rèn)為應(yīng)該從發(fā)生臂間倒位的區(qū)帶判斷：若9號(hào)染色體臂間倒位發(fā)生在異染色質(zhì)區(qū)內(nèi)，如9q12的次縊痕區(qū)，由于該區(qū)域?yàn)楦叨戎貜?fù)的DNA序列，不編碼主要遺傳信息，因此該區(qū)域發(fā)生的臂間倒位不屬于結(jié)構(gòu)異常，理論上對(duì)患者的表型、智力、生長(zhǎng)發(fā)育不會(huì)造成嚴(yán)重的影響。但如果9號(hào)染色體臂間倒位發(fā)生在異染色質(zhì)區(qū)外，由于這種異常屬于染色體的結(jié)構(gòu)異常，這類倒位染色體在減數(shù)分裂時(shí)形成倒位環(huán)，正常的染色體和倒位的染色體之間發(fā)生交叉互換，導(dǎo)致配子染色體上某一片段缺失或重復(fù)，此時(shí)其遺傳效應(yīng)主要取決于重復(fù)或缺失片段的長(zhǎng)短及其所含基因的致死效應(yīng)，倒位片段越短，則重復(fù)或缺失片段就越長(zhǎng)，其配子和合子正常發(fā)育的可能越小，臨床表現(xiàn)為不孕不育、流產(chǎn)、死胎等癥狀[12]。

目前，在傳統(tǒng)的細(xì)胞遺傳學(xué)層面上，一般采用G顯帶技術(shù)結(jié)合C顯帶技術(shù)對(duì)9號(hào)染色體異態(tài)性進(jìn)行分析，但該方法受細(xì)胞遺傳水平的核型分辨率及操作者人為主觀因素的影響，定位并不完全準(zhǔn)確，難以明確區(qū)分9號(hào)染色體臂間倒位是否涉及異染色質(zhì)區(qū)外。Starke等[9]發(fā)現(xiàn)9號(hào)染色體臂間倒位主要發(fā)生在9q13-21.1，國(guó)內(nèi)也有學(xué)者報(bào)告9號(hào)染色體臂間倒位片段多定位于p11及q12遠(yuǎn)端[10]，這都表明了9號(hào)染色體臂間倒位發(fā)生在異染色質(zhì)區(qū)外的情況不容忽視。采用G顯帶技術(shù)進(jìn)行分析時(shí)，對(duì)于5M以下的變異難以用肉眼判別，因此也不能完全排除9號(hào)染色體發(fā)生臂間倒位的同時(shí)斷裂位點(diǎn)周圍是否存在基因突變或微小缺失和重復(fù)等情況，需要通過(guò)基因測(cè)序等分子檢測(cè)技術(shù)進(jìn)一步鑒定，以明確9號(hào)染色體不同位點(diǎn)的斷裂及其與臨床表現(xiàn)的相關(guān)性，從而更好地進(jìn)行生育指導(dǎo)和遺傳咨詢。由此推斷，目前眾多文獻(xiàn)報(bào)告的9號(hào)染色體臂間倒位所涉及的斷裂點(diǎn)可能在異染色質(zhì)區(qū)外，應(yīng)考慮為結(jié)構(gòu)異?；蚧蜃儺?，這或可為9號(hào)染色體臂間倒位攜帶者表現(xiàn)出不同臨床癥狀的結(jié)論提供合理的解釋。

9號(hào)染色體次縊痕區(qū)為染色體長(zhǎng)臂上凹陷縮窄的異染色質(zhì)區(qū)，該區(qū)域?yàn)楦叨戎貜?fù)的非編碼DNA序列，次縊痕部位的DNA松散，容易自發(fā)和誘發(fā)斷裂，其增加或減少可導(dǎo)致次縊痕的增加或減少，從而干擾染色體的運(yùn)動(dòng)和分離，造成減數(shù)分裂過(guò)程中同源染色體配對(duì)困難或分離異常，進(jìn)而影響配子的形成，導(dǎo)致不孕不育或自然流產(chǎn)等不良生育結(jié)局[12]。此外，有研究報(bào)告次縊痕區(qū)大量重復(fù)的DNA可能會(huì)導(dǎo)致在胚胎早期調(diào)控細(xì)胞分化的基因發(fā)生異常或劑量效應(yīng)，從而造成有絲分裂錯(cuò)誤，最終導(dǎo)致不孕不育、胚胎停育或自然流產(chǎn)等臨床結(jié)局[13]。Minocherhomji等[14]研究發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性不孕不育患者的9號(hào)染色體次縊痕增加檢出率升高，提示9號(hào)染色體次縊痕增加與不孕不育有關(guān)；王桂玲等[15]報(bào)告復(fù)發(fā)性流產(chǎn)者9號(hào)染色體次縊痕增加的檢出率明顯升高，提示9號(hào)染色體異態(tài)性與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)可能存在相關(guān)性。但也有學(xué)者認(rèn)為9號(hào)染色體次縊痕的增加或減少屬于正常的染色體變異，不會(huì)導(dǎo)致不孕不育或不良妊娠結(jié)局[16]?？梢?jiàn)，對(duì)于9號(hào)染色體次縊痕增加或減少與生育結(jié)局的相關(guān)性，目前尚無(wú)統(tǒng)一定論，本研究中共檢出9號(hào)染色體次縊痕增加20例，其中17例出現(xiàn)不良妊娠結(jié)局、3例臨床表現(xiàn)為不孕不育；檢出9號(hào)染色體次縊痕減少1例，為有不良妊娠結(jié)局的患者。但由于本研究缺乏對(duì)正常生育人群9號(hào)染色體次縊痕增加或減少發(fā)生率的研究，加之9號(hào)染色體次縊痕減少的患者樣本量少，因此僅能得出次縊痕變化可能存在潛在臨床效應(yīng)的結(jié)論，今后仍需擴(kuò)大樣本進(jìn)一步研究。

綜上所述，不孕不育、不良妊娠結(jié)局患者中9號(hào)染色體異態(tài)性中臂間倒位的發(fā)生率較高，其對(duì)生育結(jié)局的影響取決于發(fā)生倒位的區(qū)帶，不能一概而論歸為正常的多態(tài)性變異。由于染色體核型分析技術(shù)的局限性，以及各實(shí)驗(yàn)室人員對(duì)斷裂位點(diǎn)的判斷不統(tǒng)一，9號(hào)染色體臂間倒位是否會(huì)引起不良的遺傳效應(yīng)，如造成不孕不育、自然流產(chǎn)、胚胎停育等，仍需要更多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)驗(yàn)證，并結(jié)合細(xì)胞與分子技術(shù)手段進(jìn)一步研究。9號(hào)染色體次縊痕增加或減少可能存在潛在的臨床效應(yīng)，也需進(jìn)一步研究證實(shí)。若能進(jìn)一步研究正常生育人群與9號(hào)染色體異態(tài)性攜帶者生殖細(xì)胞減數(shù)分裂和胚胎形成過(guò)程中染色體的變化情況，可為探討9號(hào)染色體異態(tài)性對(duì)生育結(jié)局的影響提供更多的參考。