趙 琨 ，肖云 ，楊純 ，嚴(yán)志凌 ，董敏娜 ，向柄全 ，肖茗耀

（1）昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科;2）婦瘤科，云南 昆明 650118;3）昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院急診醫(yī)學(xué)部，云南 昆明 650032）

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是肺內(nèi)外的各種病因?qū)е碌募毙缘脱跣院粑δ懿蝗C合癥，其嚴(yán)重時(shí)可發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS），大量炎癥因子的激活是ALI 發(fā)展為ARDS 的主要機(jī)制，因此，調(diào)節(jié)炎癥和凋亡可能是治療ALI 的新方案[1]。有研究[2]認(rèn)為，模式識(shí)別受體可以啟動(dòng)炎癥信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)和促炎細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-1（interleukin-1，IL-1）和 IL-6 的釋放；刺激自噬或細(xì)胞凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致ALI 向 ARDS 進(jìn)展。

調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（regulatory T cells，Treg）是一類控制體內(nèi)自身免疫反應(yīng)性的T 細(xì)胞亞群，它的抑制功能對(duì)于控制自身免疫、過(guò)敏和炎癥反應(yīng)及至關(guān)重要，在ALI 的發(fā)展過(guò)程中起到保護(hù)性作用[3?4]。IL-4 是Th2 細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，其對(duì)于Treg 介導(dǎo)的免疫抑制可能具有多種正向調(diào)節(jié)作用[5]。但對(duì)于在ALI 中IL-4 是否能夠改善患者預(yù)后，目前鮮有報(bào)道。本研究將從體外細(xì)胞水平研究在ALI 中IL-4 對(duì)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞因子分泌的作用，為臨床ALI 診療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 研究材料

人肺上皮細(xì)胞A549 細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC 細(xì)胞庫(kù)，SYBR Green qPCR Mix 2.0 試劑盒購(gòu)自廣州Genecopoeia 公司，Caspase-3 抗體購(gòu)自Abcam，Bcl-2 抗體購(gòu)自GeneTex，IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α、TNF-γ 的 ELISA 試劑盒均購(gòu)自NeoBioscience，IL-4 細(xì)胞因子購(gòu)自PeproTech。

1.2 研究方法

1.2.1 LPS 最佳干預(yù)條件測(cè)定使用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)A549 細(xì)胞72 h 后，將A549 細(xì)胞分為13 組，向培養(yǎng)基中加入LPS，使得培養(yǎng)基中LPS 濃度分別為10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、50 μg/mL，每個(gè)濃度對(duì)應(yīng)3 組A549 細(xì)胞，將上述各濃度中的3 組細(xì)胞分別在含LPS 的培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h、24 h、48 h，以未加入LPS的A549 細(xì)胞培養(yǎng)48 h 為空白對(duì)照。培養(yǎng)結(jié)束后，使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，確定LPS 的最佳干預(yù)濃度及時(shí)間。

1.2.2 IL-4 對(duì)ALI 細(xì)胞凋亡的影響選用上述最佳LPS 干預(yù)濃度及時(shí)間誘導(dǎo)A549 細(xì)胞凋亡，并將A549 細(xì)胞分為濃度控制組及時(shí)間控制組，每組各3 個(gè)亞組：濃度控制組的3 個(gè)亞組在加入LPS 的同時(shí)，分別加入0.1 μg/mL、1 μg/mL、10 μg/mL 的IL-4，與同時(shí)LPS 同時(shí)干預(yù)12 h；時(shí)間控制組的3 個(gè)亞組分別在加入LPS 前12 h、加入LPS 后6 h、加入LPS 后9 h 加入1 μg/mL 的IL-4，即IL-4 分別干預(yù)24 h、6 h、3 h；以只使用LPS 干預(yù)的A549 為對(duì)照組，不使用LPS 及IL-4干預(yù)的A549 為空白組。干預(yù)完成后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）檢測(cè)Caspase3、Bcl-2 的mRNA 的表達(dá)，蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測(cè)Caspase3、Bcl-2 的蛋白表達(dá)情況。

1.2.3 IL-4 對(duì)ALI 中各細(xì)胞因子的影響使用上一部分確定的最佳IL-4 干預(yù)濃度及時(shí)間，使用LPS 及IL-4 同時(shí)干預(yù)實(shí)驗(yàn)組A549 細(xì)胞，對(duì)照組A549 細(xì)胞僅使用LPS 干預(yù)，空白組A549 細(xì)胞則不進(jìn)行干預(yù)。干預(yù)結(jié)束后，離心取細(xì)胞培養(yǎng)上清液，酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定（ELISA）法測(cè)定各組細(xì)胞上清液中IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α、TNFγ 分泌情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 21.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，2 組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，方差分析后使用Sidak 法進(jìn)行多重比較，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LPS 最佳干預(yù)條件

通過(guò)不同濃度LPS 對(duì)A549 細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行不同時(shí)長(zhǎng)的干預(yù)，根據(jù)A549 細(xì)胞凋亡情況，LPS濃度10 μg/mL 干預(yù)時(shí)間12 h 時(shí)，A549 細(xì)胞凋亡率最高，見(jiàn)圖1。認(rèn)為此條件為L(zhǎng)PS 誘導(dǎo)A549 細(xì)胞體外ALI 的最佳干預(yù)條件。

圖1 LPS 最佳干預(yù)條件Fig.1 Optimal LPS intervention concentration

2.2 IL-4 對(duì)ALI 細(xì)胞凋亡影響的結(jié)果

使用上述LPS 濃度誘導(dǎo)A549 細(xì)胞形成ALI，作為對(duì)照組。與空白組（正常A549 細(xì)胞）相比，對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率顯著升高（1.86% vs 10.37%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。IL-4 干預(yù)組細(xì)胞凋亡率顯著低于對(duì)照組（P<0.001）。當(dāng)干預(yù)時(shí)間相同，均為12 h 時(shí)，細(xì)胞凋亡率隨IL-4 干預(yù)濃度的增加而降低（6.82% vs 3.38% vs 0.60%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；當(dāng)IL-4 濃度均為1 μg/mL 時(shí)，干預(yù)3 h 及6 h 細(xì)胞凋亡率無(wú)明顯變化（5.01% vs 4.95%），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；而干預(yù)12 h 及24 h 以后，細(xì)胞凋亡率逐漸降低（3.38%，P=0.001；2.07%，P<0.001），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)圖2、圖3。

圖2 各組細(xì)胞凋亡情況Fig.2 Apoptosis in each group

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果Fig.3 The results of apoptosis detected by flow cytometry

以β-actin 為內(nèi)參，各組Caspase-3 與Bcl-2 蛋白表達(dá)水平，見(jiàn)圖4。與空白組相比，對(duì)照組中Caspase-3 蛋白表達(dá)水平顯著升高（1.75 vs 2.00，P=0.017），Bcl-2 蛋白表達(dá)水平顯著降低（1.27 vs 0.31，P<0.001）。與對(duì)照組相比，IL-4 干預(yù)的各實(shí)驗(yàn)組Caspase-3 蛋白表達(dá)水平均下降（P=0.0122），干預(yù)時(shí)間均為12 h 時(shí)，Caspase-3 蛋白表達(dá)水平隨IL-4 濃度增加而下降（1.56 vs 0.87 vs 0.31）；當(dāng)IL-4 濃度均為1 μg/mL 時(shí)，干預(yù)6 h 及12 h 時(shí)Caspase-3 蛋白表達(dá)水平降至最低（0.86 vs 0.87，P>0.05），干預(yù)24 h 后表達(dá)水平回升（0.87 vs 1.17，P>0.05）。IL-4 干預(yù)各組的Bcl-2蛋白表達(dá)水平均高于對(duì)照組（P<0.001），干預(yù)時(shí)間均為12 h 時(shí)，IL-4 濃度為1 μg/mL 時(shí)，Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著高于0.1 μg/mL（0.51 vs 1.36，P<0.001），但I(xiàn)L-4 濃度升高到10 μg/mL 以后，Bcl-2 蛋白表達(dá)也未明顯升高（1.36 vs 1.41，P>0.05）；干預(yù)濃度均為1 μg/mL 時(shí)，IL-4 干預(yù)12 h后的Bcl-2 蛋白表達(dá)水平明顯上升（0.54 vs 1.36，P<0.001），但繼續(xù)干預(yù)至24 h 后，Bcl-2 蛋白表達(dá)水平也未繼續(xù)升高（1.36 vs 1.27，P>0.05）。qPCR 驗(yàn)證Caspase3、Bcl-2 mRNA 表達(dá)情況的結(jié)果與其蛋白表達(dá)結(jié)果一致，以GAPDH 為內(nèi)參，各組Caspase-3 與Bcl-2 mRNA 表達(dá)水平，見(jiàn)圖5。

圖4 各組Caspase3、Bcl-2 蛋白表達(dá)情況Fig.4 Expression of Caspase3 and Bcl-2 proteins in each group

圖5 各組Caspase3、Bcl-2 mRNA 表達(dá)情況Fig.5 mRNA expression of Caspase3 and Bcl-2 in each group

2.3 IL-4 對(duì)ALI 中各細(xì)胞因子影響的結(jié)果

雖然IL-4 降低ALI 細(xì)胞細(xì)胞凋亡、抑制Caspase3 表達(dá)的效果隨濃度和作用時(shí)間逐漸加強(qiáng)，但其促進(jìn)Bcl-2 表達(dá)的效果在IL-4 濃度為1 μg/mL，作用12 h 時(shí)達(dá)到高點(diǎn)，因此后續(xù)研究均在此條件下進(jìn)行。與空白組（正常A549 細(xì)胞）相比，對(duì)照組（ALI）IL-1、IL-6、TNF-α、TNF-γ分泌顯著增多，IL-10 分泌降低（P<0.05）；經(jīng)1 μg/mL。的IL-4 干預(yù)12 h 后，實(shí)驗(yàn)組IL-1、IL-6、TNF-α、TNF-γ 分泌顯著降低，低于對(duì)照組（P<0.05）；而實(shí)驗(yàn)組IL-10 分泌增加，高于對(duì)照組（P<0.05）。各組細(xì)胞因子分泌濃度見(jiàn)表1、圖6。

圖6 各組細(xì)胞因子分泌情況Fig.6 Secretion of cytokines in each group

表1 各組細(xì)胞因子分泌情況（pg/mL）Tab.1 Secretion of cytokines in each group（pg/mL）

3 討論

ALI 是肺內(nèi)外的各種病因?qū)е碌募毙缘脱跣院粑δ懿蝗C合癥，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，治療效果不佳，平均病死率高達(dá)50%以上[6]，研究認(rèn)為炎癥與抗炎反應(yīng)的平衡被打破是導(dǎo)致肺部炎性損傷的主要原因之一[1]。當(dāng)肺部受到肺內(nèi)外的各種病因因素影響時(shí)，中性粒細(xì)胞通過(guò)肺泡巨噬細(xì)胞和其他肺細(xì)胞類型產(chǎn)生的趨化信號(hào)募集到肺泡腔內(nèi)部，釋放蛋白酶、氧自由基、花生四烯酸代謝產(chǎn)物等損傷肺泡毛細(xì)血管內(nèi)膜[7?8]。急性肺損傷的進(jìn)展過(guò)程中炎癥和抗炎反應(yīng)持續(xù)發(fā)生，促炎癥細(xì)胞因子，例如 IL-1、IL -6、TNF-α、TNF-γ等是引發(fā)肺部炎癥反應(yīng)的主要介質(zhì)。其他炎癥分子如趨化因子，巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等則促進(jìn)肺部炎癥的進(jìn)展[9]。

Tregs 是存在于正常人體內(nèi)的一種具有負(fù)向調(diào)節(jié)免疫功能特征T 細(xì)胞亞群，其在維持免疫穩(wěn)態(tài)中具有重要意義[10]。當(dāng)Treg 細(xì)胞受到抗原特異性刺激活化時(shí)，能夠通過(guò)分泌抑制性細(xì)胞因子IL-10，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）等細(xì)胞因子介導(dǎo)免疫抑制，防止機(jī)體發(fā)生過(guò)度的免疫反應(yīng)[11]。Garibaldi[3]等的研究證實(shí)，Treg 能夠通過(guò)抑制LPS 損傷后肺纖維細(xì)胞募集，從而減輕急性肺損傷過(guò)程中的肺纖維化。而在ALI 炎癥修復(fù)期，肺泡內(nèi) Treg 細(xì)胞數(shù)量明顯增多。臨床觀察也證實(shí)了肺泡 Treg 細(xì)胞較多的ALI 患者死亡率降低[4]。因此，Treg 可能能夠減輕ALI 患者的炎癥反應(yīng)，加強(qiáng) ALI 修復(fù)期的修復(fù)作用。

抗炎細(xì)胞因子IL-4 主要由CD4+T 細(xì)胞產(chǎn)生的，具有多種生物學(xué)活性，對(duì)B 細(xì)胞、T 細(xì)胞、肥大細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞都具有免疫調(diào)節(jié)作用[12]。研究表明，在IL-4 敲除的小鼠 ALI 模型中，其發(fā)病進(jìn)展及炎癥反應(yīng)遠(yuǎn)高于ALI 正常小鼠模型，這表明IL-4 在ALI 過(guò)程中扮演重要角色[13?14]。Wehrmann F[15]等研究發(fā)現(xiàn)，γδ T 細(xì)胞可防止LPS 誘導(dǎo)的肺損傷，但抗 IL-4 阻斷抗體可以逆轉(zhuǎn)這種保護(hù)作用。但目前對(duì)IL-4 在ALI 中的作用機(jī)制尚無(wú)定論。本研究結(jié)果顯示，與ALI 模型組相比，IL-4 干預(yù)的各組ALI 細(xì)胞的凋亡率顯著降低，說(shuō)明IL-4 對(duì)ALI 具有保護(hù)作用。除此之外，筆者還發(fā)現(xiàn)IL-4 濃度及其作用時(shí)間呈正相關(guān)。在本研究中，筆者也觀察到IL-4 處理后Caspase-3 表達(dá)下調(diào)及Bcl-2 表達(dá)上調(diào)。Caspase-3 是細(xì)胞凋亡過(guò)程中最主要的終末剪切酶，其可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而Caspase-3 的作用可以被Bcl-2 阻斷；Bcl-2 可以抑制由多種細(xì)胞毒因素所引起的細(xì)胞死亡，其過(guò)度表達(dá)能增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)多數(shù)細(xì)胞毒素的抵抗性。因此，筆者認(rèn)為IL-4 在ALI 的發(fā)生發(fā)展中是保護(hù)性因素，其可以通過(guò)上調(diào)Bcl-2 表達(dá)，從而降低肺上皮細(xì)胞的凋亡，并改善其預(yù)后。

本研究檢測(cè)了經(jīng)IL-4 處理后相關(guān)炎性細(xì)胞因子的變化情況，結(jié)果顯示，ALI 時(shí)促炎因子IL-1、IL-6、TNF-α、TNF-γ 分泌顯著升高，而抗炎細(xì)胞因子IL-10 在ALI 組分泌顯著降低，該結(jié)論與以往ALI 相關(guān)研究一致。而通過(guò)IL-4 干預(yù)后，實(shí)驗(yàn)組的IL-1、IL-6、TNF-α、TNF-γ 分泌顯著降低，其中TNF-α、TNF-γ 甚至可低于正常A549 細(xì)胞，且IL-10 分泌增加。Wehrmann F等[15]認(rèn)為γδT 細(xì)胞可能通過(guò)調(diào)節(jié)肺中的TNFα 水平來(lái)限制巨噬細(xì)胞的擴(kuò)增，進(jìn)而抑制肺損傷。而Farivar 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在缺血再灌注肺損傷模型中，IL-4 與IL-10 可以協(xié)同降低IL-1β 和TNF-α 的水平，以達(dá)到減輕肺損傷的作用。有學(xué)者認(rèn)為[17]，受損肺泡中的活化巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和潛在的上皮細(xì)胞可以產(chǎn)生IL-6，后者可通過(guò)介導(dǎo)炎癥反應(yīng)導(dǎo)致肺損傷。上述結(jié)論均支持本研究的結(jié)果，因此筆者推斷，IL-4 可能通過(guò)多種途徑抑制ALI 發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的過(guò)度免疫反應(yīng)，從而發(fā)揮其保護(hù)性作用。Pace L 等[18]的研究發(fā)現(xiàn)，IL-4 可促進(jìn)Treg 細(xì)胞增殖，且Treg 細(xì)胞的免疫抑制能力增強(qiáng)。筆者推斷其可能的機(jī)制：IL-4 可阻止叉頭翼螺旋轉(zhuǎn)錄因子3（Forkhead Box P3，F(xiàn)oxp3）表達(dá)下調(diào)，而Foxp3 是Treg 細(xì)胞的特異標(biāo)志物，并對(duì)其增殖和功能發(fā)揮起決定性作用。因而通過(guò)維持Foxp3 的表達(dá)，增強(qiáng)了Treg 細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)功能[19?20]。

在ALI 的發(fā)生發(fā)展中，炎癥及抗炎反應(yīng)占據(jù)核心地位，涉及多種復(fù)雜調(diào)節(jié)機(jī)制。本研究闡明急性肺損傷中IL-4 可能刺激相關(guān)炎性因子發(fā)揮正向調(diào)節(jié)作用，從而緩解急性肺損傷。但本研究目前僅限于體外實(shí)驗(yàn)，其具體機(jī)制尚未完全闡明，仍需要后續(xù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及基因、信號(hào)通路層面的研究驗(yàn)證筆者的猜想。以期通過(guò)分子學(xué)的角度進(jìn)行干預(yù)治療，提高急性肺損傷的治愈率。