鄭怡雯 周永佳 羅夢秋 劉金夢 梁嬋嬋 王巧真 陳燕春 王箐

(濰坊醫(yī)學院 1臨床醫(yī)學院，山東 濰坊 261053；2神經疾病與再生修復實驗室；3基礎醫(yī)學院人體解剖學教研室)

肌萎縮側索硬化癥(ALS)是一種慢性進行性神經系統(tǒng)變性疾病，病變主要累及脊髓、大腦皮質等部位的神經元，表現(xiàn)為進行性的肌力下降和肌萎縮，最后導致呼吸循環(huán)系統(tǒng)器官衰竭而死亡〔1〕。ALS發(fā)病機制復雜，目前無有效治療方法。Bar家族同源域因子(Barx)2，可調控細胞黏附分子表達，影響細胞在不同環(huán)境中的分化，在細胞黏附和細胞重構中發(fā)揮重要作用〔2〕。有研究表明Barx2是胚胎和成人成肌細胞的新標志物，是人出生后生長和修復所必需的指標〔3〕。有相關報道發(fā)現(xiàn)Barx2參與調控Wnt/β-catenin信號傳導途徑〔2,4〕。軸向抑制蛋白(Axin)2是一種主要的支架蛋白，是Wnt/β-catenin信號通路的負調節(jié)因子〔5,6〕。Wnt/β-catenin信號傳導途徑在ALS發(fā)病中發(fā)揮重要作用，該信號傳導途徑異常與ALS發(fā)病緊密相關〔7〕。但目前關于Barx2和Axin2在ALS轉基因小鼠脊髓內的表達變化尚未闡明。本研究選用SOD1-G93A基因突變的ALS轉基因小鼠，應用分子生物學和形態(tài)學等方法檢測Barx2和Axin2在ALS小鼠脊髓內的表達情況，探討其與ALS發(fā)病的關系。

1 材料和方法

1.1實驗動物 野生型(WT)及突變型超氧化物歧化酶(SOD)1-G93A轉基因小鼠即ALS轉基因小鼠，購自Jackson實驗室(合格證編號為3100079226)。參照Chen等〔7,8〕方法嚴格按轉基因鼠飼養(yǎng)條件進行飼養(yǎng)，將4周齡小鼠剪尾約0.5 cm，進行DNA檢測，基因擴增檢測鑒別ALS小鼠和WT小鼠。將33只成年ALS小鼠按照不同發(fā)病時期分為早(95 d)、中(108 d)、晚(122 d)期ALS組各11只，并且每組配以同窩WT小鼠作為對比參照，分別為早(95 d)、中(108 d)、晚(122 d)期WT組各11只。

1.2實驗試劑及主要儀器 小鼠源抗體Barx2購自Santa Cruz Blotechnology公司，兔源抗體Axin2購自Arigo Biolaboratories公司，小鼠源性和兔源性β微管蛋白(β-tubulin)Ⅲ抗體分別購自R&D公司和Abcam公司；小鼠源性 GAPDH 抗體購自Proteintech Group公司。羊抗兔辣根過氧化物酶(HRP)酶標二抗、羊抗小鼠HRP酶標二抗、驢抗小鼠Alexa fluor 488及羊抗兔Cy3熒光二抗試劑均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。Western印跡增強型化學發(fā)光液購自Thermo Fisher Scientific公司，聚偏氟乙烯(PVDF)膜購自Millipore公司。Barx2、Axin2和內參照β-actin引物均購自Samgon Biotech公司。反轉錄試劑盒購自Toyobo公司。

1.3標本制備 按照前期實驗方法取發(fā)病不同時期ALS轉基因小鼠和WT小鼠脊髓〔7,8〕，其中一部分組織研磨提取RNA用于反轉錄(RT)-聚合酶鏈反應(PCR)，一部分組織超聲震碎提取蛋白用于Western印跡檢測；部分ALS小鼠和WT小鼠心臟灌注固定后制備脊髓冰凍切片，用于免疫熒光技術檢測。

1.4RT-PCR檢測 參照文獻〔7〕實驗方法提取RNA和反轉錄cDNA。引物序列為：Barx2：上游GATGGTCCTTAAAGGTGGACAG，下游TGGGCTCC-TGGGTATCACAG；β-actin：上游GAGCTACGAGCTGCCTGACG，下游CCTAGAAGCATTTGCGGTGG；Axin2：上游ATGAGTAGCGCCGTGTTAGTG，下游GGG-CATAGGTTTGGTGGACT；以cDNA為模版分別進行Barx2基因和Axin2基因擴增，用β-actin作為內參照。反應體系如下：2×Master Mix 10 μl，目的基因上、下游引物各0.5 μl，β-actin內參照基因上、下游引物各0.5 μl，cDNA 模板1 μl，用無菌水加至總體積為20 μl。在PCR儀中94℃ 3 min預變性，94℃ 30 s變性、58℃ 30 s退火和72℃ 30 s 延伸依次循環(huán)30次，最后1個循環(huán)延伸72℃ 3 min后冷卻至4℃。瓊脂糖凝膠電泳，將RT-PCR所得圖像應用IPP6.0軟件測量分析。

1.5Western印跡檢測 參照文獻〔7〕實驗方法提取脊髓組織并進行電泳和轉膜。將完成轉膜后的PVDF膜放置在5%脫脂牛奶內進行抗原封閉2 h，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗PVDF膜，裁膜后孵育一抗：小鼠Barx2(1∶500)，小鼠GAPDH(1∶2 000)，兔 Axin2(1∶1 000)。其余步驟參照Chen等〔8〕實驗方法將結果應用IPP6.0軟件分析Barx2、Axin2蛋白和內參照GAPDH蛋白的相對表達水平。

1.6免疫熒光標記 將冰凍切片晾干，PBS沖洗后滴加0.3% Triton X-100，置于暗盒內常溫放置10～15 min。PBS沖洗，滴加正常羊血清封閉抗原，37℃孵育30 min；取出后甩掉羊血清，分別滴加稀釋好的兔 Axin2(1∶80)與小鼠β-tubulinⅢ(1∶200)混合一抗工作液及小鼠Barx2(1∶100)與兔β-tubulinⅢ(1∶100)混合一抗工作液，置于暗盒中4℃過夜。次日，PBS中漂洗后滴加驢抗小鼠Alexa fluor 488(1∶400)和羊抗兔Cy3(1∶400)混合二抗，37℃ 孵育40 min，PBS清洗，甩干；Hoechst33258標記細胞核，37℃溫箱中孵育15 min后，PBS沖洗。滴加熒光防淬滅劑，封片，應用Olympus 熒光顯微鏡觀察并拍照記錄。

1.7統(tǒng)計學處理 采用SPSS20.0軟件進行獨立樣本t檢驗。

2 結 果

2.1各組脊髓內Barx2 mRNA及蛋白表達比較 RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，與早、中、晚期WT組(100.2±9.8、98.3±8.3、97.7±15.1)相比，早、中、晚期ALS組脊髓內Barx2 mRNA表達水平(39.3±5.5、54.9±5.3、67.7±4.2)均明顯下降(P<0.05)。Western印跡結果顯示，與早、中、晚期WT組(106.1±12.2、97.2±15.6、91.0±11.6)相比，早、中、晚期ALS組Barx2蛋白表達水平(66.6±10.4、32.8±5.1、65.1±8.4)均顯著下降(P<0.05)，見圖1、圖2。免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)，在晚期ALS組及WT組脊髓中均可檢測到 Barx2陽性細胞，且與β-tubulinⅢ標記的神經元共表達，陽性細胞集中在灰質前角，該處是病變損害所在部位。與晚期WT組相比，晚期ALS組脊髓中Barx2免疫陽性減弱，與Western印跡檢測結果一致，見圖3。

1～6：早期WT組，早期ALS組，中期WT組，中期ALS組，晚期WT組，晚期ALS組；圖2、4、5同圖1 RT-PCR檢測脊髓中Barx2 mRNA表達

圖2 Western印跡檢測各組脊髓中Barx2蛋白水平表達

2.2各組脊髓內Axin2 mRNA及蛋白表達比較 RT-PCR檢測結果表明，與早、中、晚期WT組(91.5±14.9、102.0±2.7、100.3±10.0)相比，早、中、晚期ALS組脊髓中Axin2 mRNA表達(24.9±3.9、71.0±13.2、68.7±8.3)明顯降低(P<0.05)。Western印跡檢測結果表明，與早、中、晚期WT組(78.3±6.3、86.2±8.8、76.7±2.9)相比，早、中、晚期ALS組Axin2蛋白表達(47.0±2.7、34.0±6.4、34.2±0.8)顯著下降(P<0.05)，見圖4、圖5。免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)，在晚期ALS組及WT組脊髓中陽性細胞集中在灰質前角，Axin2陽性細胞均與β-tubulinⅢ標記的神經元共表達。ALS組脊髓內Axin2免疫陽性反應較WT組減弱，與Western印跡檢測結果一致，見圖6。

圖3 免疫熒光檢測晚期WT及ALS組脊髓中Barx2的表達(×200)

圖4 RT-PCR檢測各組脊髓中Axin2 mRNA表達

圖5 Western印跡檢測各組脊髓中Axin2蛋白表達

圖6 免疫熒光檢測晚期WT及ALS組脊髓中Axin2的表達(×200)

3 討 論

ALS是一種影響上、下運動神經元的退行性疾病，發(fā)病機制復雜，涉及多種信號通路與多種調控因子，至今仍沒有很好的治療方法，進一步探討ALS的發(fā)病機制與病變中的改變對于其治療尤為重要。

Barx2是Bar類的一種新的同源盒基因，在發(fā)育過程中表達于神經和顱面結構中。有絲分裂后神經元所在的外套層、底板和背根神經節(jié)中，Barx2顯著表達〔9〕。在中樞神經系統(tǒng)發(fā)育的過程中Barx2表現(xiàn)出與黏附分子(CAM)表達模式重疊的動態(tài)表達，參與轉錄調控神經細胞(N)-CAM啟動子的區(qū)域〔10〕。有研究表明，Barx2和轉錄因子(Pax)6與HPD(L1基因調控區(qū)域中的一種DNA元素)特異結合在激活N-CAML1表達有重要作用，HPD通過同源域蛋白和Pax蛋白調控神經組織L1的表達，其中HPD核內的ATTA序列是與同源域蛋白Barx2結合所必需的〔11〕，提示Barx2在神經的再生與發(fā)育中發(fā)揮重要作用。同時，Chen等〔4〕發(fā)現(xiàn)Barx2能抑制細胞增殖、遷移，并通過有氧糖酵解抑制Wnt/β-catenin信號傳導途徑。Zhuang等〔12〕發(fā)現(xiàn)Barx2是Wnt信號通路效應復合物新的組分，其在Wnt信號通路調控中的拮抗作用可能有助于介導成肌細胞從增殖向分化轉變。干擾Barx2基因能導致Wnt靶基因表達異常。有研究〔7〕證實，經典Wnt信號通路即Wnt/β-catenin信號途徑與ALS發(fā)病密切相關，在ALS發(fā)病過程中，Wnt信號通路被激活。本研究中Barx2降低導致其對Wnt信號通路拮抗作用減弱，與以往研究〔7〕結果相一致。

Axin2已經被公認為是抑制糖原合酶激酶(GSK)3β介導的Snail1降解的負調控因子，是E-鈣黏蛋白的轉錄抑制因子，Axin2還可通過β-catenin降解來阻止Wnt信號傳導〔13〕。Wnt/β-catenin信號傳導由3種多蛋白復合物控制，其中第一個被發(fā)現(xiàn)的是β-catenin破壞復合物，其核心成分包括Axin支架蛋白、腫瘤抑制基因(APC)和2種絲氨酸蘇氨酸激酶〔GSK3和酪蛋白激酶(CK)1〕，該復合物在沒有Wnt信號的情況下具有活性，可磷酸化β-catenin的N-末端中的特定殘基，標記該Wnt效應子專用于泛素化和蛋白酶體降解，這確定了信號傳導途徑的關閉狀態(tài)〔14〕。以往研究〔15〕發(fā)現(xiàn)CK1ε在ALS轉基因小鼠大腦皮層中隨病程進展而升高，表明CK1ε與ALS發(fā)病有密切聯(lián)系，推測同為復合物核心成分的Axin2可能在ALS中也有重要作用。本研究結果表明ALS小鼠脊髓中Axin2表達下調，減弱了對Wnt信號通路的負反饋調節(jié)從而達到對Wnt信號通路的激活作用。

有研究〔16〕表明，Barx2可通過與轉錄因子(TCF)/β-catenin復合物的相互作用促進Axin2表達，終止對Wnt信號的應答。本研究結果顯示，在ALS轉基因小鼠的發(fā)病過程中，Barx2和Axin2表達均下調，推測Barx2可能通過調控Axin2影響Wnt信號通路傳導參與ALS發(fā)病，但是Barx2和Axin2的關系及通過何種方式調控Wnt信號通路影響病變過程有待于繼續(xù)深入研究，詳細的機制也有待于通過離體實驗進一步闡明。