趙 斌 ，段元鵬 ，張國(guó)穎 ，畢城偉 ，楊李波 ，施致裕 ，楊 勇 ，張建朋 ，高 婷

（1）云南省腫瘤醫(yī)院泌尿外科，云南 昆明 650118;2）云南財(cái)經(jīng)大學(xué)校醫(yī)院，云南 昆明 650021）

前列腺癌是全球男性中最常見(jiàn)的癌癥之一[1]，轉(zhuǎn)移性前列腺癌的5 a 生存率僅為31%，且復(fù)發(fā)及晚期前列腺癌通常被認(rèn)為是無(wú)法治愈的[2]。在世界較發(fā)達(dá)地區(qū)，前列腺癌的發(fā)病率最高[3]，相比之下，亞洲男性的發(fā)病率低于全球水平，但前列腺癌仍然是影響男性健康的一個(gè)重大醫(yī)學(xué)問(wèn)題。因此，闡明前列腺癌的基因機(jī)制，尋找新的診斷和治療的生物標(biāo)志物至關(guān)重要。

CircRNA 是一類(lèi)內(nèi)源性非編碼RNA，源自前體mRNA 反向剪接，其通過(guò)3' 和5' 端反向剪接形成共價(jià)閉合結(jié)構(gòu)。近年來(lái)，在各種生物體中已鑒定出數(shù)以千計(jì)的circRNA，并發(fā)現(xiàn)他們?cè)谠S多疾病中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，尤其是癌癥，circRNA可以參與癌證的諸多病理生理過(guò)程，包括細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡[4-6]。然而，目前有關(guān)circRNA 在前列腺癌中的報(bào)道較少。Wen 等[7]發(fā)現(xiàn)circRNA EZH2 與膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲相關(guān)。但circRNA EZH2 在前列腺癌中的作用和機(jī)制尚不清楚。

微小RNA（miRNA）是一類(lèi)長(zhǎng)度約22 個(gè)核苷酸的非編碼小RNA，在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖和凋亡以及腫瘤發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。MiR-30c-5p 是多種惡性腫瘤進(jìn)展的關(guān)鍵調(diào)控基因，在非小細(xì)胞肺癌[8]、大腸癌[9]、胰腺癌[10]等疾病中均有報(bào)道。CircRNA 和miRNA 的相互作用在癌癥發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。本研究旨在為解釋circRNA EZH2 調(diào)控miR-30c-5p 在前列腺癌中的作用機(jī)制提供理論依據(jù)，同時(shí)將為前列腺癌的診斷和治療提供新的生物標(biāo)志物和靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系及主要試劑

人前列腺癌細(xì)胞系LNCaP（貨號(hào)CL-0143）、人正常前列腺上皮細(xì)胞RWPE1（貨號(hào)CL-0200）、人胚腎細(xì)胞HEK-293（貨號(hào)CL-0001）購(gòu)自武漢Procell 公司；RPMI1640 培養(yǎng)基、青鏈霉素雙抗、谷氨酰胺、胎牛血清、胰酶均購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；CCK-8 試劑盒購(gòu)自上海東仁化學(xué)公司，劃痕插件購(gòu)自德國(guó)IBIDI 公司；riboFECT? CP 轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自廣州銳博生物公司；circRNA EZH2 的siRNA（si-circRNA EZH2）、siRNA 陰性對(duì)照（si-NC）、miR-30c-5p inhibitors 序列由廣州銳博生物公司合成；Trizol 試劑盒購(gòu)自美國(guó) Life technologies 公司，F(xiàn)astKing RT Kit （With gDNase）FastKing cDNA 第一鏈合成試劑盒購(gòu)自北京天根公司，ECL 顯影液購(gòu)自美國(guó)Millipore 公司；RIPA 裂解液、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒、SDSPAGE 蛋白上樣緩沖液均購(gòu)自碧云天；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒、JAK1、PI3K 抗體購(gòu)自英國(guó)abcam 公司；GAPDH 抗體、HRP 標(biāo)記的IgG二抗購(gòu)自美國(guó)CST 公司。熒光素酶載體購(gòu)自上海海吉浩格生物科技有限公司；Lipofectamine?3000、購(gòu)自美國(guó)Thermo 公司；RNase R 購(gòu)自廣州吉賽公司。

1.2 生物信息學(xué)分析

在癌癥基因組圖譜（TCGA）[11]數(shù)據(jù)庫(kù)（https://portal.gdc.cancer.gov/）中獲取數(shù)據(jù)對(duì)前列腺癌旁和腫瘤組織中的circRNA EZH2 表達(dá)差異進(jìn)行分析，中位數(shù)作為閾值區(qū)分高低表達(dá)。用Kaplan-Meier曲線檢測(cè)circRNA EZH2 與前列腺癌進(jìn)展的時(shí)間相關(guān)性，起點(diǎn)事件為手術(shù)切除；終點(diǎn)事件為死亡；刪失數(shù)據(jù)為失訪、死于其他疾病、觀察結(jié)束時(shí)病人尚存活。Logrank 法檢驗(yàn)及單因素預(yù)后分析，Cox 風(fēng)險(xiǎn)比例模型多因素預(yù)后分析。用starBase v2.0 篩選下游靶基因。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

用含10% FBS、1%雙抗和1%谷氨酰胺的RPMI 1640 培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)LNCaP 細(xì)胞。待細(xì)胞匯合度達(dá)80%時(shí)，將細(xì)胞接種至6 孔培養(yǎng)板，每孔接種5×104個(gè)細(xì)胞，過(guò)夜培養(yǎng)。細(xì)胞分為：對(duì)照組、陰性對(duì)照組、si-circRNA EZH2 組、si-circRNA EZH2 和miR-30c-5p inhibitors 聯(lián)合應(yīng)用組。參照riboFECT?CP 轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前，對(duì)照組更換為無(wú)雙抗的RPMI 1640 培養(yǎng)基；陰性對(duì)照組更換為含si-NC（50 nM）的RPMI 1640 培養(yǎng)基；sicircRNA EZH2 組更換為含si-circRNA EZH2（50 nM）的RPMI 1640 培養(yǎng)基；si-circRNA EZH2和miR-30c-5p inhibitors 聯(lián)合應(yīng)用組更換為含sicircRNA EZH2（50 nM）和miR-30c-5p inhibitors的RPMI 1640 培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.4 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

接種LNCaP 細(xì)胞至96 孔板內(nèi)，另接種3 孔LNCaP 細(xì)胞正常培養(yǎng)作為CCK-8 對(duì)照組，每孔接種2 500 個(gè)細(xì)胞，每組3 個(gè)孔重復(fù)。RPMI1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后，每孔加入10 μLCCK-8試劑，在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h 后，于酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度。

1.5 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力

接種LNCaP 細(xì)胞至IBIDI 插件內(nèi)，每孔接種5×104個(gè)細(xì)胞，使用RPMI 1640 培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待匯合度達(dá)80%時(shí)，移除劃痕插件，于0 h 和24 h 時(shí)間點(diǎn)觀察劃痕寬度，在倒置顯微鏡下拍攝記錄。

1.6 RT-qPCR 檢測(cè)細(xì)胞中相關(guān) circRNA、miRNA 及JAK1 的mRNA 表達(dá)水平

按照TRIZOL 法提取LNCaP 細(xì)胞中的總RNA，測(cè)量RNA 濃度后，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 第一條鏈。根據(jù)qPCR 試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)cDNA 進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)體系為10 μL，反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，共進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。以GAPDH 作為circRNA EZH2 和JAK1的內(nèi)參，以U6 作為miR-30c-5p 的內(nèi)參，運(yùn)用2-ΔΔCt法進(jìn)行定量分析。

表1 RT-qPCR 所需引物序列Tab.1 Primer sequences

1.7 Western blot 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞中JAK1 和PI3K 的表達(dá)水平

JAK1 信號(hào)在癌癥中常被激活[12]，于是筆者檢測(cè)了circRNA EZH2 對(duì)其是否有調(diào)控。加入RIPA 裂解液和蛋白酶抑制劑，從LNCaP 細(xì)胞中提取總蛋白，用BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒進(jìn)行定量。樣品中的蛋白采用SDS-PAGE 分離并濕轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，BSA 封閉后加入JAK1（1∶1 000）和PI3K（1∶1 000）一抗，在4 ℃下孵育過(guò)夜。二抗（1∶2 000）室溫孵育1 h，使用ECL 顯影液曝光。使用Image J 軟件測(cè)定灰度值。

1.8 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

將circRNA EZH2 的野生型（WT）或突變型（MUT）3’-UTR 克隆到pGL3 啟動(dòng)子熒光素酶載體。按照制造商說(shuō)明，使用Lipofectamine?3000用miR-30c-5p mimic 和circRNA EZH2 或其突變體轉(zhuǎn)染HEK-293 細(xì)胞。48 h 后通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)熒光素酶活性。

1.9 RNase R 處理

總RNA（2 μg）在37 ℃下與3 U/mg RNase R共同孵育15 min。qRT-PCR 檢測(cè)circRNA EZH2的表達(dá)。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

通過(guò) Graph-Pad Prism 9 軟件（GraphPad Software，San Diego，CA） 進(jìn)行 Kolmogorov-Smirnov 檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的正態(tài)性。正態(tài)分布的連續(xù)性變量均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，并通過(guò)Graph-Pad Prism 9 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。組間比較采用單因素方差分析，如有差異進(jìn)一步用Tukey's 檢測(cè)兩兩比較，P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 circRNA EZH2 在前列腺癌中高表達(dá)

首先通過(guò)TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)評(píng)估了circRNA EZH2 在499 例前列腺癌腫瘤樣本和52 例癌旁組織中的表達(dá)，腫瘤樣本中位數(shù)為2.504，癌旁組織中位數(shù)為1.483，發(fā)現(xiàn)circRNA EZH2 在前列腺癌組織中顯著高表達(dá)（P＜ 0.01，圖1A）。此外，對(duì)TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中的前列腺癌樣本進(jìn)行Kaplan-Meier 分析結(jié)果顯示，前列腺癌患者中，circRNA EZH2 表達(dá)水平較高的患者（250 例）相較于circRNA EZH2 表達(dá)水平較低的患者（249 例）生存率更低（圖1B）。RT-qPCR 結(jié)果顯示，circRNA EZH2 在前列腺癌LNCaP 細(xì)胞中的表達(dá)較人前列腺上皮細(xì)胞RWPE1 中更高（P＜ 0.001，圖1C）。這些數(shù)據(jù)表明circRNA EZH2 在前列腺中過(guò)表達(dá)，并且circRNA EZH2 高表達(dá)與前列腺癌的進(jìn)展和不良預(yù)后相關(guān)。

圖1 CircRNA EZH2 在前列腺癌中高表達(dá)Fig.1 circRNA EZH2 in prostate cancer

2.2 CircRNA EZH2 環(huán)狀結(jié)構(gòu)的驗(yàn)證

通過(guò)RNase R 酶切實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了circRNA EZH2 具有高度保守的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，線性EZH2 被RNase R 酶切，而circRNA EZH2 沒(méi)有被酶切（P＜ 0.001），見(jiàn)圖2。

圖2 qRT-PCR 檢測(cè)LNCaP 細(xì)胞總RNA 經(jīng)RNase R處理后circRNA EZH2 及線性EZH2 的表達(dá)Fig.2 qRT-PCR detected the expression of circRNA EZH2 and linear EZH2 after RNase treatment total RNA from LNCaP cells

2.3 敲降circRNA EZH2 抑制前列腺癌細(xì)胞增殖和遷移

在LNCaP 細(xì)胞中通過(guò)轉(zhuǎn)染si-circRNA EZH2成功下調(diào)circRNA EZH2 的表達(dá)，且轉(zhuǎn)染si-NC未改變circRNA EZH2 的表達(dá)（P＜ 0.000 1，圖3A）。CCK-8 檢測(cè)表明，轉(zhuǎn)染si-circRNA EZH2 可抑制LNCaP 細(xì)胞的增殖（P＜ 0.000 1，圖3B），使其生長(zhǎng)密度降低（圖3D）。此外，劃痕實(shí)驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)染si-circRNA EZH2 后，LNCaP 細(xì)胞的遷移明顯減弱（P＜ 0.000 1，圖3C、3E）。以上數(shù)據(jù)表明，circRNA EZH2 促進(jìn)LNCaP 細(xì)胞的增殖和遷移。

圖3 CircRNA EZH2 對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖和遷移的影響Fig.3 The effects of circRNA EZH2 on proliferation and migration of prostate cancer cells

2.4 circRNA EZH2 靶向調(diào)控miR-30c-5p

通過(guò)CircBase、StarBase 等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)circRNA EZH2 具有hsa-miR-30c-5p 結(jié)合位點(diǎn)，推測(cè)circRNA EZH2 可能與miR-30c-5p 有相互作用（圖4A）。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示，miR-30c-5p 顯著降低了WT-circRNA EZH2 的熒光素酶活性（P＜ 0.000 1，圖4B）。通過(guò)RT-qPCR實(shí)驗(yàn)對(duì)miR-30c-5p 抑制劑效果進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示與對(duì)照組和過(guò)表達(dá)組相比，miR-30c-5p 抑制劑顯著降低了miR-30c-5p 的表達(dá)（P＜ 0.001，圖4C）。RT-qPCR 實(shí)驗(yàn)顯示，在轉(zhuǎn)染si-circRNA EZH2 的LNCaP 細(xì)胞中miR-30c-5p 表達(dá)顯著上調(diào)，轉(zhuǎn)染si-circRNA EZH2 和miR-30c-5p 抑制劑后，miR-30c-5p 的表達(dá)與僅轉(zhuǎn)染si-circRNA EZH2 組相比明顯降低（P＜0.000 1，圖4D）。而circRNA EZH2 的表達(dá)受miR-30c-5p 抑制劑影響不明顯（P＜ 0.000 1，圖4E），猜測(cè)miR-30c-5p 可能是circRNA EZH2 的下游靶基因。

圖4 CircRNA EZH2 靶向miR-30c-5pFig.4 CircRNA EZH2 targeted miR-30c-5p

2.5 circRNA EZH2/miR-30c-5p 軸調(diào)控前列腺癌細(xì)胞增殖和遷移

CCK-8（P＜ 0.000 1，圖5A）和細(xì)胞培養(yǎng)顯微鏡觀察（圖5B）顯示，miR-30c-5p 抑制劑的加入下調(diào)了轉(zhuǎn)染si-circRNA EZH2 對(duì)LNCaP 細(xì)胞增殖的抑制，且細(xì)胞增殖能力恢復(fù)至較control 組和si-NC 組無(wú)顯著差異。此外，LNCaP 細(xì)胞的遷移能力也在抑制miR-30c-5p后恢復(fù)（P＜ 0.000 1，圖5C、5D）。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明circRNA EZH2可以通過(guò)調(diào)控miR-30c-5p 的表達(dá)來(lái)調(diào)控LNCaP細(xì)胞增殖和遷移。

圖5 CircRNA EZH2 調(diào)控miR-30c-5p 軸對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖和遷移的影響Fig.5 CircRNA EZH2 regulated cell proliferation and migration via miR-30c-5p in prostate cancer cell

2.6 circRNA EZH2 調(diào)控JAK1 和PI3K 信號(hào)通路

RT-qPCR 結(jié)果顯示（P＜ 0.000 1，圖6A），sicircRNA EZH2 的轉(zhuǎn)染使JAK1 的表達(dá)顯著下調(diào)，而si-circRNA EZH2 轉(zhuǎn)染后加入miR-30c-5p 抑制劑使JAK1 的表達(dá)相較于僅轉(zhuǎn)染si-circRNA EZH2 組顯著上調(diào)，Western blot 實(shí)驗(yàn)也得到同樣的結(jié)果（P＜ 0.000 1，圖6B、6C）。Western blot 結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染si-circRNA EZH2 后PI3K 的表達(dá)下調(diào)，而同時(shí)轉(zhuǎn)染si-circRNA EZH2 和miR-30c-5p 抑制劑后PI3K 的表達(dá)水平高于僅轉(zhuǎn)染sicircRNA EZH2 組（P＜ 0.005，圖6B、6D）。這表明PI3K 信號(hào)與circRNA EZH2 的高表達(dá)正相關(guān)，且受miR-30c-5p 的負(fù)調(diào)控。

圖6 CircRNA EZH2 對(duì)JAK1 和PI3K 的調(diào)控Fig.6 CircRNA EZH2 regulated JAK1 and PI3K

3 討論

CircRNA 豐富而保守，而且與大多數(shù)其他線性RNA 相比，circRNA 更加穩(wěn)定，因此circRNA可作為有效的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。目前關(guān)于circRNA EZH2 的研究較少，在已有報(bào)道中，circRNA EZH2 能通過(guò)NF-κB 通路調(diào)節(jié)豬腸上皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[13]；circRNA EZH2 在膠質(zhì)瘤中可作為miR-1 265 的海綿調(diào)控DDAH1 和CBX3 的表達(dá)[14]。因此，circRNA EZH2 的失調(diào)可能在調(diào)節(jié)人類(lèi)癌癥的進(jìn)展中起重要作用。本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)circRNA EZH2 在前列腺癌組織中高表達(dá)，并證明circRNA EZH2 在前列腺癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)且與癌癥發(fā)展相關(guān)。Kaplan-Meier 分析表明，circRNA EZH2 過(guò)表達(dá)與前列腺癌患者的生存率降低顯著相關(guān)。功能缺失實(shí)驗(yàn)表明，circRNA EZH2在前列腺癌細(xì)胞中促進(jìn)其增殖和遷移。在機(jī)制上，circRNA EZH2 通過(guò)調(diào)控miR-30c-5p 來(lái)調(diào)控JAK1 的表達(dá)并激活PI3K 信號(hào)通路。這些發(fā)現(xiàn)為了解circRNA EZH2 在前列腺癌進(jìn)展中的致癌作用提供了見(jiàn)解，并表明circRNA EZH2 可能是前列腺癌預(yù)后和治療的生物標(biāo)志物。

已經(jīng)證明，circRNA 可以和miRNA 相互作用，以發(fā)揮生物學(xué)功能。筆者的結(jié)果證明，circRNA EZH2 能夠調(diào)控miR-30c-5p 的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控下游基因JAK1 的表達(dá)，促進(jìn)前列腺癌生長(zhǎng)。JAK1是Janus 激酶家族成員之一，在多種類(lèi)型的細(xì)胞中表達(dá)。它在許多腫瘤，包括前列腺癌的發(fā)展中有重要作用，并在轉(zhuǎn)移性癌癥進(jìn)展中起關(guān)鍵作用[12]。在筆者的實(shí)驗(yàn)中，沉默circRNA EZH2 能下調(diào)JAK1的mRNA 和蛋白表達(dá)，這表明circRNA EZH2 可能作為一種JAK1 抑制劑在前列腺癌的治療中發(fā)揮作用。

本研究本研究的另一個(gè)重要發(fā)現(xiàn)是circRNA EZH2 可以激活磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）信號(hào)。PI3K 的信號(hào)傳導(dǎo)與人類(lèi)腫瘤進(jìn)展、腫瘤微血管密度增加以及癌細(xì)胞的趨化性和侵襲潛力顯著相關(guān)，PI3K 的突變?cè)诔Ｒ?jiàn)的人類(lèi)癌癥中經(jīng)常發(fā)生[15]，被認(rèn)為是癌癥治療的關(guān)鍵靶點(diǎn)之一。筆者推測(cè)circRNA EZH2 在前列腺癌中的調(diào)控作用可能與PI3K 信號(hào)有關(guān)，并在LNCaP 細(xì)胞中檢測(cè)了circRNA EZH2 是否對(duì)PI3K 信號(hào)有影響。PI3K 信號(hào)通路在許多癌癥的發(fā)展中起著關(guān)鍵作用，在前列腺癌中也經(jīng)常被異常激活，尤其是在轉(zhuǎn)移性前列腺癌中[16]。PI3K 信號(hào)的過(guò)度激活促進(jìn)了前列腺癌的增殖，轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。例如，miR-133a-3p 下調(diào)激活的PI3K 信號(hào)能促進(jìn)前列腺癌骨轉(zhuǎn)移[17]。雄激素剝奪療法是治療前列腺癌的一種主要方法，然而，大多數(shù)患者會(huì)對(duì)雄激素剝奪產(chǎn)生抵抗力，從而導(dǎo)致腫瘤持續(xù)生長(zhǎng)，患者死亡率上升[18]。PI3K 信號(hào)通路的激活能夠重新連接雄激素受體的信號(hào)傳導(dǎo)，從而減少腫瘤對(duì)雄激素的需求，以促進(jìn)前列腺癌生長(zhǎng)[19]。筆者發(fā)現(xiàn)circRNA EZH2 的抑制下調(diào)了PI3K 信號(hào)的表達(dá)，相反的是，miR-30c-5p 的抑制激活了PI3K 信號(hào)。這些結(jié)果闡明了circRNA EZH2 可作為PI3K 通路的調(diào)節(jié)劑，并可作為干預(yù)前列腺癌的潛在靶標(biāo)。

總而言之，本研究發(fā)現(xiàn)circRNA EZH2 在前列腺癌組織中上調(diào)，并有助于前列腺癌進(jìn)展。circRNA EZH2 的缺失可影響miR-30c-p 的功能，下調(diào)JAK1 表達(dá)并干擾PI3K 信號(hào)通路，從而抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖和遷移。綜上，circRNA EZH2 可能作為前列腺癌過(guò)程中的致癌基因，為前列腺癌的診斷和治療提供潛在靶標(biāo)。