韓曉鷗，余波，劉順鑫，曹忠波

(遼寧省疾病預(yù)防控制中心，遼寧省環(huán)境與人群健康監(jiān)測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng) 110005)

尿液是人體日常生成且排泄量最大的代謝液體，包含大量人體代謝和疾病相關(guān)信息。尿液分析檢測(cè)是對(duì)多種疾病診斷和職業(yè)中毒與職業(yè)病防護(hù)臨床基礎(chǔ)檢驗(yàn)的重要內(nèi)容。

鈣、鎂、磷是人體內(nèi)重要的礦物元素。鈣參與人體骨骼構(gòu)成、血液凝固、肌肉收縮、神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)等生理功能[1]。鎂是鈣拮抗劑。磷及其化合物進(jìn)入人體后，在體內(nèi)被分解為無機(jī)磷，主要通過腎臟隨尿液排出體外。檢測(cè)人體內(nèi)鈣、鎂、磷代謝情況對(duì)多種疾病診斷治療、職業(yè)危害及防護(hù)具有重要意義[2]。鈣、鎂、磷測(cè)定方法主要有絡(luò)合滴定法[3]、電極法[4-6]和原子吸收光譜法[7-11]等，上述方法操作復(fù)雜，受干擾因素較多，容易導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果失準(zhǔn)[12]。氟是人體所必需的微量元素之一，人體中氟的含量偏低或偏高均有一定危害，正常成年人每日需攝入1～2 mg 的氟，當(dāng)氟的攝入量超過4～5 mg 時(shí)，會(huì)導(dǎo)致氟在體內(nèi)蓄積。生產(chǎn)環(huán)境中氟及氟化物主要經(jīng)呼吸道和皮膚進(jìn)入體內(nèi)，貯存在骨、軟骨和牙齒中，少部分貯存在腎及脾內(nèi)，體內(nèi)過量的氟化物有85%左右通過尿液排出，故尿液中氟化物含量的高低是診斷氟化物中毒的重要參考指標(biāo)之一[13]。目前尿液中氟的檢測(cè)方法主要有離子選擇電極法[14]和離子色譜法[15-16]。

筆者建立了固相萃取-離子色譜法測(cè)定尿液中的鈣、鎂、氟、磷(以磷酸根計(jì))離子，該方法操作簡(jiǎn)單，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，可用于人尿液中鈣、鎂、氟、磷離子濃度的檢測(cè)，對(duì)于了解人體代謝規(guī)律具有重要意義。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

離子色譜儀：ICS5000+型，美國(guó)熱電公司。

臺(tái)式冷凍離心機(jī)：Sorvall ST 16R 型，美國(guó)熱電公司。

超純水機(jī)：MILLI-Q Gradient 型，美國(guó)密理博公司。

低溫冰箱：BCD-256WDGK 型，控溫范圍為-25～10 ℃，控溫精度為1 ℃，中國(guó)海爾集團(tuán)。

固相萃取小柱：(1) C18柱(500 mg/3 mL)；(2) C18柱(500 mg/6 mL)，美國(guó)熱電公司。

甲醇：色譜純，美國(guó)費(fèi)希爾公司。

鈣離子、鎂離子、氟離子標(biāo)準(zhǔn)溶液：質(zhì)量濃度均為1 000 mg/L，編號(hào)分別為GBW(E) 080118、GBW(E) 080126、GBW(E) 080549，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院。

磷酸根離子標(biāo)準(zhǔn)溶液：500 mg/L，編號(hào)為BW2015-1000-20，壇墨質(zhì)檢-標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心。

實(shí)驗(yàn)用水為超純水，由MILLI-Q Gradient 型超純水機(jī)制備。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 氟、磷酸根離子檢測(cè)

保護(hù)柱：AG15 柱(50 mm×4 mm，美國(guó)熱電公司)；分析色譜柱：AS15 柱(250 mm×4 mm，美國(guó)熱電公司)；抑制器：AERS500 型陰離子抑制器4 mm；檢測(cè)器：電導(dǎo)檢測(cè)器；進(jìn)樣體積：100 μL；淋洗液：KOH 溶液，流量為1.0 mL/min；洗脫方式：梯度洗脫，洗脫程序見表1。

表1 梯度淋洗程序

1.2.2 鈣、鎂離子檢測(cè)

保護(hù)柱：CG12 柱(50 mm×4 mm，美國(guó)熱電公司)；分析色譜柱：CS12A 柱(250 mm×4 mm，美國(guó)熱電公司)；檢測(cè)器：電導(dǎo)檢測(cè)器；抑制器：CERS500型陽(yáng)離子抑制器4 mm；淋洗液：20 mmol/L 甲基磺酸溶液，流量為1.0 mL/min；抑制電流：59 mA；進(jìn)樣體積：25 μL；淋洗方式：等度淋洗。

1.3 溶液配制

鈣、鎂離子標(biāo)準(zhǔn)使用液：100.0 mg/L，準(zhǔn)確吸取鈣、鎂離子標(biāo)準(zhǔn)溶液各1 mL，分別置于10 mL 容量瓶中，用超純水定容至標(biāo)線，混勻。

氟離子標(biāo)準(zhǔn)使用液：1.0 mg/L，準(zhǔn)確吸取氟離子標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 mL，置于100 mL 容量瓶中，用超純水定容至標(biāo)線，混勻。

磷酸根離子標(biāo)準(zhǔn)使用液：100.0 mg/L，準(zhǔn)確吸取磷酸根離子標(biāo)準(zhǔn)溶液20 mL 于100 mL 容量瓶中，用超純水定容至標(biāo)線，混勻。

氟、磷酸根離子系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別吸取氟離子標(biāo)準(zhǔn)使用液0.25、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL，磷酸根離子標(biāo)準(zhǔn)使用液1.25、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、50.0 mL，置于7 只100 mL 容量瓶中，用超純水定容至標(biāo)線，混勻，配制成氟離子的質(zhì)量濃度分別為0.002 5、0.005、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/L，磷酸根離子的質(zhì)量濃度分別為1.25、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、50.0 mg/L 的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

鈣、鎂離子系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別吸取0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、10.0 mL 鈣、鎂離子標(biāo)準(zhǔn)使用液，置于7 只100 mL 容量瓶中，用超純水定容至標(biāo)線，混勻，配制成鈣、鎂離子的質(zhì)量濃度均分別為0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、10.0 mg/L 的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

加標(biāo)樣品溶液：吸取一定量的尿液樣品，置于100 mL 容量瓶中，分別加入100 μL 鈣、鎂離子標(biāo)準(zhǔn)溶液，5 μL 氟離子標(biāo)準(zhǔn)使用液，500 μL 磷酸根離子標(biāo)準(zhǔn)溶液，用超純水定容至標(biāo)線，混勻，配制成低質(zhì)量濃度加標(biāo)樣品溶液；吸取一定量的尿液樣品，置于100 mL 容量瓶中，分別加入400 μL 鈣、鎂離子標(biāo)準(zhǔn)溶液，20 μL 氟離子標(biāo)準(zhǔn)使用液，2 000 μL磷酸根離子標(biāo)準(zhǔn)溶液，用超純水定容至標(biāo)線，混勻，配制成中質(zhì)量濃度加標(biāo)樣品溶液；吸取一定量的尿液樣品，置于100 mL 容量瓶中，分別加入800 μL鈣、鎂離子標(biāo)準(zhǔn)溶液，40 μL 氟離子標(biāo)準(zhǔn)溶液，8 000 μL 磷酸根離子標(biāo)準(zhǔn)溶液，用超純水定容至標(biāo)線，混勻，配制成高質(zhì)量濃度加標(biāo)樣品溶液。高、中、低3種質(zhì)量濃度的加標(biāo)樣品溶液中鈣、鎂、氟、磷酸根離子的質(zhì)量濃度見表2。

表2 加標(biāo)樣品溶液中鈣、鎂、氟、磷酸根離子的質(zhì)量濃度 mg/L

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 樣品采集和保存

用聚丙烯材質(zhì)采樣瓶分別采集女性尿液和男性尿液各30 份，于-20 ℃冰箱中存放，48 h 內(nèi)測(cè)定，若于-70 ℃冷凍保存，可保存一個(gè)月。

1.4.2 樣品處理

從冰箱中取出尿液樣品，常溫下使其充分解凍，混勻。準(zhǔn)確吸取2 mL 尿液樣品于15 mL 離心管中，以5 000 r/min 轉(zhuǎn)速于-4 ℃下離心10 min，取1 mL 上清液，用超純水稀釋至30 倍，備用。在固相萃取小柱中加入2 mL 甲醇和2 mL 超純水進(jìn)行活化。準(zhǔn)確吸取6 mL 稀釋后的尿液樣品，加入活化處理后的固相萃取小柱中，棄去濾液。再吸取3.0 mL 稀釋后的尿液樣品加入上述固相萃取小柱中，使樣品在重力作用下自然通過小柱，收集濾液，經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾后測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件優(yōu)化

2.1.1 色譜柱選擇

色譜柱類型、淋洗液濃度和淋洗液流量對(duì)4 種待測(cè)離子的分離效果具有重要影響。在測(cè)定氟、磷酸根離子時(shí)，根據(jù)現(xiàn)有陰離子柱的工作原理和適用范圍，分別考察AS19 和AS15 兩種型號(hào)色譜柱的分離效果。結(jié)果表明，AS19 柱不能實(shí)現(xiàn)氟離子、磷酸根離子與尿液樣品中其它雜質(zhì)的完全分離；而AS15 色譜柱能夠?qū)崿F(xiàn)氟離子、磷酸根離子與尿液樣品中其它雜質(zhì)的完全分離，因此選擇AS15 色譜柱為分離柱、AG15 色譜柱為保護(hù)柱測(cè)定氟、磷酸根兩種陰離子。在測(cè)定鈣、鎂離子時(shí)，選擇CS12A 色譜柱為分離柱、CG12 色譜柱為保護(hù)柱，可以實(shí)現(xiàn)基線分離，可用于測(cè)定鈣、鎂離子。

2.1.2 淋洗方式選擇

在測(cè)定氟、磷酸根離子時(shí)，以KOH 溶液為淋洗液，分別考察等度洗脫和梯度淋洗時(shí)氟、磷酸根離子的分離效果。結(jié)果表明，采用等度洗脫時(shí)，氟離子與樣品中其它雜質(zhì)色譜峰的分離度均小于1，磷酸根與樣品中其它雜質(zhì)色譜峰的分離度均小于1.5，因此使用等度洗脫時(shí)，氟、磷酸根與樣品中其它雜質(zhì)不能有效分離；采用梯度洗脫時(shí)，調(diào)節(jié)KOH 溶液濃度，采用如下淋洗程序：0～10.1 min 時(shí)KOH 溶液濃度為4 mmol/L，10.1～13.2 min 時(shí)KOH 溶液濃度為50 mmol/L，13.2～30 min 時(shí)KOH 溶液濃度為50 mmol/L，30～40 min 時(shí)KOH 溶液濃度為4 mmol/L，流量為1.0 mL/min，氟離子與其它雜質(zhì)的分離度為1.2，磷酸根與其它雜質(zhì)的分離度為1.3，均小于1.5；改變KOH 溶液濃度，經(jīng)優(yōu)化，采用表1 淋洗程序，氟離子與其它雜質(zhì)的分離度為6.2，磷酸根與其它雜質(zhì)的分離度為2.0，均大于1.5，分離效果良好。

在測(cè)定鈣、鎂離子時(shí)，以20 mmol/L 甲基磺酸溶液為淋洗液，選擇CS12A 色譜柱，采用等度淋洗模式即可使鈣、鎂離子與尿液中其它雜質(zhì)的分離度達(dá)到3.07，實(shí)現(xiàn)完全分離。

2.2 樣品處理方法

尿液成分復(fù)雜，其中含有蛋白質(zhì)等有機(jī)物，以及陰、陽(yáng)離子等人體代謝物質(zhì)，是基質(zhì)復(fù)雜的生物樣品。測(cè)定尿液中離子含量的樣品處理方法有直接稀釋法和固相萃取法。直接稀釋法樣品中的有機(jī)代謝物質(zhì)成分會(huì)滯留在離子色譜柱上，導(dǎo)致柱效降低或者直接損壞分離柱，從而影響色譜柱的使用壽命，因此選擇固相萃取柱對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理。

由于分離柱為離子色譜柱，淋洗液為水溶液，選擇C18非極性色譜柱進(jìn)行萃取，可有效去除雜質(zhì)。按照1.4.2 方法，分別選擇6 mL、3 mL 兩種規(guī)格的C18固相小柱對(duì)高、中、低3 種質(zhì)量濃度的加標(biāo)樣品溶液進(jìn)行萃取，在1.2 儀器工作條件下分別平行測(cè)定6 次，計(jì)算測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表3。由表3 可知，采用兩種規(guī)格的C18固相萃取小柱萃取時(shí)，4 種離子測(cè)定結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于6%，但6 mL 小柱萃取時(shí)間短，為節(jié)約實(shí)驗(yàn)時(shí)間，選擇6 mL C18固相小柱為樣品處理萃取柱。

表3 不同固相萃取小柱萃取加標(biāo)樣品溶液時(shí)測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6) %

2.3 色譜圖

在優(yōu)化的色譜條件下，氟、磷酸根離子混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和鈣、鎂離子混合標(biāo)準(zhǔn)溶液以及加標(biāo)樣品溶液色譜圖如圖1～4 所示。由圖1～4 可以看出，各組分之間分離效果良好，均達(dá)到基線分離，氟、磷酸根、鈣、鎂離子的分離度均大于1.5，可以用于定量測(cè)定。

圖1 氟、磷酸根離子混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

圖2 鈣、鎂離子混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

圖3 加標(biāo)樣品溶液色譜圖(氟、磷酸根離子)

圖4 加標(biāo)樣品溶液色譜圖(鈣、鎂離子)

2.4 線性方程與檢出限

在1.2 儀器工作條件下，分別對(duì)1.3 中的鈣、鎂離子系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和氟、磷酸根離子系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測(cè)定，以目標(biāo)物質(zhì)的質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，以色譜峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，計(jì)算線性方程和相關(guān)系數(shù)。在1.2 儀器工作條件下，對(duì)試劑空白進(jìn)行11 次連續(xù)測(cè)定，以3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差作為方法檢出限。4 種離子的質(zhì)量濃度線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限見表4。由表4 可知，4 種離子的質(zhì)量濃度與色譜峰面積線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.999 2～0.999 9，可以通過外標(biāo)法定量。

表4 質(zhì)量濃度線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限

2.5 加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)

取高、中、低3 種質(zhì)量濃度的加標(biāo)樣品溶液，按1.4.2 樣品處理方法分別平行處理6 份，在1.2 儀器工作條件下進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表5。由表5 可知，3 種質(zhì)量濃度水平加標(biāo)樣品的回收率為86.0%～99.5%，測(cè)定結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.12%～5.50%，表明該方法測(cè)量準(zhǔn)確度、精密度均較高，滿足分析要求。

表5 加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)結(jié)果

續(xù)表5

2.6 樣品的穩(wěn)定性

選擇高質(zhì)量濃度水平的加標(biāo)樣品，分別置于4、-20、-70 ℃冰箱中放置24 h，在1.2 儀器工作條件下進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表6。由表6 可知，不同保存溫度對(duì)尿液樣品中鈣、鎂、氟、磷(以磷酸根計(jì)) 4 種離子測(cè)定結(jié)果均有影響，隨保存溫度的降低，其影響變小。

表6 不同保存溫度時(shí)4 種離子質(zhì)量濃度測(cè)定結(jié)果 mg/L

選擇高質(zhì)量濃度水平的加標(biāo)樣品，置于-70 ℃冰箱中，分別放置1、14、30、35 d，在1.2 儀器工作條件下進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表7。由表7 可知，在-70 ℃溫度下，不同保存時(shí)間對(duì)尿樣中鈣、鎂、氟、磷(以磷酸根計(jì)) 4 種離子測(cè)定結(jié)果均有影響，當(dāng)保存時(shí)間超過30 d 時(shí)，測(cè)定結(jié)果明顯偏小，因此尿液樣品采集后應(yīng)盡快檢測(cè)或在-70℃下冷凍保存1 個(gè)月內(nèi)測(cè)定。

表7 70 ℃下不同保存時(shí)間時(shí)4 種離子質(zhì)量濃度測(cè)定結(jié)果 mg/L

3 結(jié)語(yǔ)

建立了固相萃取-離子色譜法測(cè)定人尿液中鈣、鎂兩種陽(yáng)離子和氟、磷酸根兩種陰離子。尿液樣品經(jīng)固相萃取小柱C18去除雜質(zhì)，經(jīng)離子柱分離，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。該方法操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、選擇性好、結(jié)果準(zhǔn)確，滿足測(cè)定要求，可用于人尿液中鈣、鎂、氟、磷離子的檢測(cè)。