柳菁菁 施松善 張彬鋒* Maeng Yoo Jae

1. 樂金生活健康化妝品研發(fā)(上海)有限公司，上海 200233；2. 上海中醫(yī)藥大學，上海 201203

胡桐淚,又名胡桐律，梧桐淚，梧桐律[1]，為楊柳科植物胡楊Populuseuphratica的樹脂，主要分布于我國新疆、內蒙古、甘肅、青海等地。胡桐淚是一種少用中藥和維吾爾族用藥，味苦、咸，性寒，主治牙痛、咽喉腫痛[2]。《本草綱目》中記載其 “今治口齒家多用，為最要之物”[3]；《海藥本草》記載其“主風疳齒，牙疼痛，骨槽風勞”[4]。胡桐淚主要有兩種常見性狀，一種外觀呈不規(guī)則的顆粒狀小塊或小薄片狀，多相互黏結成疏松的團塊，表面棕黃色至棕色，具角質樣光澤，質脆易碎，習稱新式胡桐淚；另有一種樹脂入土時間較長，呈大小不等的塊狀或粉末狀，土黃色，質重而實，習稱老式胡桐淚[5]。兩種胡桐淚均為胡楊樹脂流入土中留存多年而形成，區(qū)別在于樹脂入土時間長短不同，但目前對兩種胡桐淚藥材現(xiàn)代研究及臨床區(qū)別的認識卻十分有限。文獻檢索結果[6-7]顯示，胡桐淚的成分研究主要集中在萜類等化合物方面，而對其中的大分子多糖類的研究尚未見報道，故對市場上實際流通的商品胡桐淚藥材中的多糖進行研究，以期為胡桐淚藥材系統(tǒng)質量評價和在化妝品中的應用提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 ME104電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；DHG-9030A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)；JP-300C高速多功能粉碎機(永康市久品工貿有限公司)；HWS-26電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科學儀器有限公司)；N-1300D-WB旋轉蒸發(fā)儀(日本東京理化器械株式會社)；Milli-Q超純水儀；Spark多功能酶標儀(瑞士TECAN公司)；Bruker Avance Ⅲ HD 600 MHz核磁共振波譜儀；Agilent 1100型高效液相色譜儀(美國Agilent)帶示差檢測器(RID)；色譜柱為Shodex KS-805、KS-804串聯(lián)柱。

1.2 試藥 葡萄糖(D-Glc)、半乳糖(D-Gal)、阿拉伯糖(L-Ara)、甘露糖(D-Man)、木糖(D-Xyl)、鼠李糖(L-Rha)等單糖標準品購自美國Sigma-Aldrich公司；不同分子量的葡聚糖標準品購自Shodex SHOWA DENKO公司。苯酚、濃硫酸、乙醇均為分析純試劑，購自國藥集團上海試劑有限公司;重水購自Damas-Beta公司;馬來酸購自北京百靈威科技有限公司。

1.3 實驗藥材 實驗樣品共10批，購自中藥材市場，經(jīng)上海中醫(yī)藥大學吳立宏教授鑒定，按外觀分為新式胡桐淚HT1-HT4和老式胡桐淚HT5-HT10。實驗標本存放于樂金生活健康化妝品研發(fā)(上海)有限公司本草研究Team實驗室。樣品信息見表1 。

表1 胡桐淚藥材收集信息表

2 方法

2.1 胡桐淚多糖含量測定

2.1.1 對照品溶液的制備 取葡萄糖對照品約 10 mg，精密稱定，加去離子水溶解并定容至 100 mL，搖勻，即得。標準葡萄糖濃度為101.2 μg/mL。

2.1.2 供試品溶液的制備 取胡桐淚粉末(過四號篩)約0.5 g，精密稱定，置100 mL圓底燒瓶中，加入80%乙醇50 mL回流1 h取出，放冷，濾過，棄去濾液，殘渣用80%乙醇50 mL洗滌5次后晾干。殘渣于100 mL圓底燒瓶中，精密加水 50 mL，稱定重量，回流提取 1 h，取出，放冷，用水補足損失的重量，混勻，濾過。精密量取濾液 40 mL，加水定容至 50 mL，混勻，即得。

2.1.3 標準曲線的繪制 精密量取對照品溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.5、0.8、1.0 mL于具塞試管中，分別加水補足至2.0 mL，精密加入6%苯酚溶液1.0 mL，渦旋后勻速加入98%濃硫酸 5.0 mL，混勻，靜置至室溫。在490 nm波長下測定吸光度，以葡萄糖的質量數(shù)y為縱坐標，吸光度x為橫坐標繪制回歸曲線(如圖1所示)，得回歸方程為y=216.93x-17.546(相關系數(shù)R2=0.9994，線性范圍為0～202.4 μg)。計算結果表明，在實驗條件下所得回歸方程線性關系良好。

圖1 葡萄糖標準曲線圖

2.1.4 樣品含量測定 取2.1.2項下的供試品溶液0.2 mL，加水稀釋至2 mL，照2.1.3項下方法測定吸光度，依標準曲線方程計算出供試品溶液中含葡萄糖的量(多糖含量以無水葡萄糖計)。

2.1.5 樣品水分含量測定 取胡桐淚藥材粉末約 2 g，精密稱定，照中國藥典2020版四部[8]通則0832水分測定法第二法(烘干法)測定，結果見表2。

表2 苯酚-硫酸法測定胡桐淚樣品多糖含量結果(按干燥品計算)

2.1.6 方法學考察 ①精密度試驗：取胡桐淚樣品約0.5 g，精密稱定，按2.1.2項下方法制備供試品溶液，按2.1.3項下方法連續(xù)測定6次，記錄吸光度值，計算吸光度值的RSD為0.84%，表明儀器精密度良好； ②重復性試驗：取HT4樣品6份，每份約0.5 g，精密稱定，按2.1.2項下方法制備供試品溶液，按2.1.3項下方法測定吸光度值，并計算多糖含量，6份平均含量為5.97%，RSD為2.66%，表明重復性良好；③穩(wěn)定性試驗: 對同一供試品溶液，分別于30、40、50、60、90 min 測定吸光度，計算吸光度值的RSD為1.16%，表明供試品溶液在90 min內穩(wěn)定； ④加樣回收率試驗:取HT4樣品6份，每份約0.25 g，精密稱定，分別加入無水葡萄糖對照品約 14.8 mg，按2.1.2項下方法制備供試品溶液，按2.1.3項下方法測定吸光度，計算含量和回收率，結果如表3。

表3 加樣回收率試驗結果

2.2 糖組成分析方法

2.2.1 標準單糖圖譜測定步驟 ①分別取單糖標準品(葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、木糖、鼠李糖、巖藻糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸)1～2 mg，各加入72%的硫酸20 μL，重水200 μL，濃硫酸10 μL和內標溶液10 μL，混勻，轉移入3 mm核磁管中； ②于600 MHz核磁共振儀上，設定采樣溫度20 ℃，測定氫譜，放大水峰區(qū)域，準確測量水峰中心頻率，精確到0.1 Hz； ③另測一個氫譜，脈沖程序改為zgcppr，D1設為 10 s，掃描次數(shù)16次， O1值設為前述水峰精確頻率值，采集實驗數(shù)據(jù)； ④圖譜以馬來酸峰(6.4734 ppm)為參照校準化學位移； ⑤分別記錄分析每種單糖所有構型的H1α和H1β，記錄化學位移值δ、計算耦合常數(shù)J以及各單糖α-和β-構型端基氫的積分面積，計算不同構型的比例。所收集的10個樣品均未檢出巖藻糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸，其余6個標準單糖異頭碳上端基氫信號區(qū)域(約4.50～5.40 ppm)重疊模式圖譜和種類歸屬如圖2所示，數(shù)據(jù)歸屬詳見表4。

圖2 實驗條件下6種標準單糖端基氫區(qū)域的核磁共振氫譜圖

表4 標準糖及樣品在實驗條件硫酸重水溶液中端基氫的化學位移值(δ)、峰形、耦合常數(shù)(J)及不同構型的比例

2.2.2 樣品溶液制備與氫譜測定步驟 ①稱取多糖樣品2～3 mg，加72%硫酸20 μL，混勻，室溫靜置過夜；② 加重水200 μL，混勻；③ 轉入5 mL安瓿瓶中，封口，100 ℃水解4～5 h； ④取出，放冷至室溫，加濃硫酸10 μL，內標溶液10 μL，混勻；⑤ 離心，取上清液200 μL轉入3 mm核磁管中；后續(xù)測定同2.2.1項下②～⑤步驟。將樣品數(shù)據(jù)與標準糖數(shù)據(jù)比對，確定單糖種類并計算各單糖之間的相對比例以其各自H1總峰面積之比計算即為摩爾比。

2.3 HPGPC分析方法 采用不同標準葡聚糖分子量的對數(shù)值與保留時間制作標準曲線，根據(jù)總多糖樣品中各峰的保留時間與標準曲線對照，采用GPC軟件自動計算其分子量。分別選取新式樣品和老式樣品多糖含量較高的代表性樣品HT1和HT6制備總多糖溶液，分別進樣20 μL至Aglient 1100型高效液相色譜儀，色譜柱Shodex KS-805、KS-804串聯(lián)柱，流動相為0.22 μm濾膜過濾過的0.2 mol/L NaCl水溶液，流速為0.8 mL/min，柱溫為40 ℃，檢測器為示差檢測器，記錄圖譜，計算各峰分子量。

3 結果

3.1 胡桐淚樣品總多糖的含量測定結果 取2.1.2項下供試品溶液，按2.1.4項下方法計算胡桐淚樣品中的總多糖含量(以葡萄糖計)。結果見表3。 新式胡桐淚樣品HT1多糖含量較高，為9.49%；老式胡桐淚樣品中HT6多糖含量較高，為2.39%。表5實驗結果顯示，新式胡桐淚中的多糖含量均值明顯高于老式胡桐淚。

表5 不同性狀胡桐淚樣品多糖含量平均值比較

3.2 單糖組成分析結果 按2.2項下方法步驟，分別測定標準單糖和各樣品的氫譜(如圖3所示)。HT7和H10兩個樣品不含多糖，未做分析。通過與標準糖譜圖比對測定值(見表4)，鑒定出8個樣品HT1、HT2、HT3、HT4、HT5、HT6、HT8和HT9中均含有較高含量的半乳糖和阿拉伯糖，及少量的木糖、鼠李糖和甘露糖；其中，HT5、HT8、HT9樣品中檢測出了較高含量的葡萄糖。利用峰面積歸一化法測定了各單糖組分的相對摩爾比。見表6。

圖3 實驗條件下標準糖及胡桐淚多糖樣品端基氫區(qū)域的核磁共振氫譜圖

表6 峰面積歸一化法計算樣品中各單糖組分的摩爾比 (%)

3.3 HPGPC分析結果 按2.3項下的方法對新式和老式胡桐淚的代表性樣品HT1和HT6總多糖的分子量與分子量分布進行了測定。色譜圖如圖4所示，分子量計算結果見表7。

圖4 胡桐淚樣品多糖的HPGCP圖譜

表7 不同性狀的2種代表性胡桐淚樣品總多糖的平均分子量及分布系數(shù)測定結果

4 討論

實驗結果表明，新式胡桐淚中多糖含量明顯高于老式胡桐淚，且多糖分子量及分子量分布差異較大。推測可能與老式藥材入土時間較長有關，隨著時間的推移受土壤中微生物的作用而降解，從而多糖含量較低?；趦煞N類型胡桐淚的這些差異，以及其明顯的外觀區(qū)別，建議分開使用。胡桐淚總多糖的糖組成分析結果表明，不同產(chǎn)地不同性狀胡桐淚樣品的糖組成相似，主要由阿拉伯糖和半乳糖組成，且含量比例接近1∶1,推測胡桐淚中的多糖可能主要為AG型果膠多糖(阿拉伯半乳聚糖)。10份市場流通中的胡桐淚樣品中，HT5、HT8、HT9樣品糖組成較其他樣品稍有差異，均檢測出葡萄糖成分，推測是產(chǎn)地原因造成的差異。

文獻報道糖組成的測定方法主要有薄層色譜法、紙色譜法、液相色譜法、氣相色譜法、核磁共振氫譜法[9-10]等。與其他幾種色譜法相比，實驗采用的核磁共振氫譜法在數(shù)分鐘內即可完成采樣分析，與相同條件下的單糖標準品譜圖對照即可明確鑒定所含單糖種類，對各單糖特征峰積分即可獲得不同單糖的組成比例，而在水解液中加入一定量的內標物質，即可對每一種單糖進行絕對定量。