陸歡，尚曉冬，王小艷，王春暉，劉建輝，陳晚朱，王瑞娟*，徐寧*

（1.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，農(nóng)業(yè)部應(yīng)用真菌資源與利用重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，國家食用菌工程技術(shù)研究中心，上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201403）

（2.湖南省食用菌研究所，湖南長沙 410013）

（3.南京財經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇南京 210023）

（4.茶陵縣興農(nóng)食用菌種植農(nóng)民專業(yè)合作社，湖南茶陵 412400）

大球蓋菇（Stropharia rugoso-annulata），分類學(xué)地位為真菌界，擔(dān)子菌門，層菌綱，傘菌目，球蓋菇科，球蓋菇屬[1]。大球蓋菇是在美國首先發(fā)現(xiàn)并報道，主要分布于歐洲、北美洲、亞洲等地，在我國云南、西藏、四川、吉林等地都發(fā)現(xiàn)有野生大球蓋菇分布，現(xiàn)已在全國大范圍內(nèi)推廣栽培。大球蓋菇色澤鮮明，肉質(zhì)嫩滑，菌柄清香脆甜，烘干后有濃郁的香氣。大球蓋菇中還富含蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、多種微量元素和膳食纖維，具有低糖、低脂肪等特點(diǎn)[2-4]，具有很高的食藥用價值。

產(chǎn)量、品質(zhì)和顏色等是食用菌生產(chǎn)上的主要農(nóng)藝性狀，近年來揮發(fā)性風(fēng)味成分也成為了重要的農(nóng)藝性狀之一。據(jù)報道食用菌中含有的醇類化合物，如1-辛烯-3-醇（蘑菇醇）是食用菌典型的風(fēng)味物質(zhì)，具有濃烈的蘑菇風(fēng)味[5]；橙花叔醇具有弱的甜清柔美的橙花氣息，還帶有像玫瑰、鈴蘭和蘋果花的氣息；辛醇具有蘑菇香、奶制品香、青香、辛香、薄荷香[6]。酮類化合物有特殊的香氣，3-辛烯-2-酮具有強(qiáng)烈的青香和蔬菜香，兼有水果味[7]。微量醛類化合物可使香氣更加醇厚，其中苯甲醛和苯乙醛是食用菌主要揮發(fā)性成分[8]，辛醛具有似甜橙、油脂、蜂蜜香氣[9]。酯類化合物具有各種果實(shí)香味。吡嗪類化合物具有芳香的炒食烤香氣味[10]，呋喃類化合物具有豆香、果香、青香及類似蔬菜的香韻[11]，2-戊基呋喃具有烘烤香味[12]。頂空固相微萃取和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（HS-SPME-GC-MS）已廣泛應(yīng)用于食品中[13]，相較于有機(jī)溶劑萃取法和水蒸氣蒸餾法，該方法具有更好的準(zhǔn)確度、精確度和重復(fù)性，且在食用菌揮發(fā)性成分方面應(yīng)用也非常廣泛。已在羊肚菌[14]、真姬菇[15]、金針菇[16]、赤芝[17]、香菇[18]、雙孢蘑菇[19]、姬松茸[20]、灰樹花[21]、桑黃[22]、竹蓀[23]和草菇[24]等品種上都有相關(guān)報道。

近年來，國內(nèi)外學(xué)者在大球蓋菇野生資源馴化、栽培技術(shù)、液體菌種、多糖提取、營養(yǎng)成分和酶活等方面開展了大量研究[25-36]，但少見其活性成分的研究報道。大球蓋菇柄粗菌蓋薄，本研究第一次通過頂空固相微萃取法結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法分析比較了大球蓋菇菌蓋和菌柄中的揮發(fā)性物質(zhì)，旨在探明大球蓋菇特征香氣成分，及為今后大球蓋菇品質(zhì)育種提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 試驗(yàn)材料

大球蓋菇新鮮子實(shí)體由湖南省食用菌研究所提供。

1.1.2 主要試劑

甲醇、乙腈（色譜純），美國Fisher 公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

GC/MS Solution 色譜工作站和NIST.17 質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，日本島津公司；GC/MS-QP2010 型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，日本島津公司；固相微萃取儀、Stableflex 固相微萃取纖維頭、頂空萃取瓶，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；Scientz 冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；CG001 型廚房干磨機(jī)，深圳市德爾有限公司；PL203 電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.2 樣品制備

參考徐寧等[37]方法對大球蓋菇子實(shí)體樣品進(jìn)行預(yù)處理。將大球蓋菇鮮品置于烘干機(jī)中低溫烘干，再將菌蓋和菌柄分開分別經(jīng)超微粉碎機(jī)粉碎后過100 目篩，放入冷凍干燥機(jī)中48 h 后制得干燥樣品，置于避光陰涼處密封保存。準(zhǔn)確稱取菌蓋和菌柄各0.1 g 置于10 mL頂空萃取瓶中，使之均勻分布在瓶底并蓋上瓶蓋后用封口膜密封。將萃取瓶置于固相微萃取裝置中固定恒溫70 ℃預(yù)熱30 min，開啟磁力攪拌（400 r/min），將萃取進(jìn)樣手柄插入頂空樣品瓶中，推出萃取纖維頭萃取40 min，縮回萃取纖維頭，取出萃取手柄，插入至氣相色譜系統(tǒng)進(jìn)樣口。

1.3 GC-MS 條件

根據(jù)徐寧等[37]方法對大球蓋菇進(jìn)行GC-MS 分析。CD-WAX 色譜柱（30.0 m×0.25 μm，0.25 mm，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）；柱內(nèi)溫度為60 ℃；進(jìn)樣口溫度240 ℃；進(jìn)樣方式：無分流；載氣高純He（含有量99.99%）；載氣氣體體積流速0.98 mL/min；程序升溫條件為初始溫度60 ℃，保持3 min，以3 ℃/min升至140 ℃，保持3 min，再以5 ℃/min 升至210 ℃，保持5 min，分析檢測時間共50 min。電子轟擊離子源：EI 源；離子源溫度：150 ℃，接口溫度：280 ℃；電子能量：70 eV；質(zhì)核比掃描范圍：35～350m/z。

1.4 數(shù)據(jù)處理

對GC-MS 的總離子流圖中的各峰經(jīng)NIST 譜庫進(jìn)行對所出峰的質(zhì)譜圖進(jìn)行檢索比對，確定揮發(fā)性化學(xué)成分的種類，并通過峰面積歸一化法計算各化合物的相對百分含量。每組實(shí)驗(yàn)做三個平行，樣品中揮發(fā)性化合物含量以平均值形式表示。采用JMP16 系統(tǒng)對大球蓋菇菌蓋和菌柄所含揮發(fā)性成分分別進(jìn)行PCA 分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 大球蓋菇子實(shí)體菌蓋和菌柄中主要揮發(fā)性化合物

大球蓋菇子實(shí)體菌蓋和菌柄的揮發(fā)性成分GC-MS總離子見圖1。由表1 可知，從大球蓋菇子實(shí)體的菌蓋和菌柄中鑒定出的揮發(fā)性化合物成分組成種類及其含量存在差異。從大球蓋菇菌蓋中共鑒定出50 個揮發(fā)性化合物，主要包括11 種醇類，8 種酯類、5 種烷類、4種醛類、4 種酮類、3 種酰胺類、2 種酸類、2 種糖類、1 種醚類、1 種炔類、1 種吡啶類、1 種胺類、1 種嗎啉類、6 種其他類化合物。菌蓋中醇類化合物占整個揮發(fā)性化合物總比例的22%，其次為酯類、烷類化合物，分別占16%、10%；醛類、酮類、酰胺類、糖類和酸類化合物分別占8%、8%、6%、4%和4%。醛類化合物主要為雙(2-甲基烯丙基)乙縮醛和十一醛，相對百分含量分別為2.25%和2.09%；酰胺類化合物主要為N-(4-環(huán)辛烯-1-基)乙酰胺，相對百分含量分別為2.92%；糖類化合物為2,4:3,5-二亞乙-l-木糖和1,2-O-亞異丙基-3-O-甲磺?；?5-O-甲氧羰基-D-呋喃木糖，相對百分含量分別為3.19%和1.36%；酸類化合物為6-羥甲基-三環(huán)十二烷基醋酸和2-(羥基亞氨基)-己酸，相對百分含量分別為0.67%和0.24%；醚類化合物為十六烷基丙基醚，相對百分含量為2.56%；炔類化合物為1-十五炔，相對百分含量為1.67%；吡啶類化合物為4-甲磺?；?3-硝基吡啶，相對百分含量為3.36%；胺類化合物為(1S,2S)-(+)-1,2-環(huán)己二胺，相對百分含量為1.42%；嗎啉類化合物為4-[4-(1,2,4-惡二唑-3-基)-1,2,5-惡二唑-3-基]嗎啉，相對百分含量為3.78%；其他化合物中2,2-二甲基-4,5-二(1-丙烯基)-1,3-二氧戊環(huán)、環(huán)氧呋隆和4-氨基-N2-(4-吡啶亞甲基)-呋咱-3-甲酰肼等相對百分含量較高，相對百分含量分別為2.39%、2.20%和1.93%。

從大球蓋菇菌柄也共鑒定出50 種揮發(fā)性物化合物，包括11 種醇類，10 種酯類、6 種酮類、4 種烷類、4 種胺類、3 種酸類、2 種烯烴類、1 種醛類、1 種糖類、1 種咪唑類、1 種萘類、1 種呋喃類、1 種噻吩類、4 種其他類化合物。醇類化合物占揮發(fā)性化合物總比例22%，其次為酯類、酮類化合物，分別占20%、12%；胺類、烷類、酸類和烯烴類化合物分別占8%、8%、6%和4%。胺類化合物主要為2,3-二甲氧基芐胺和(3,5-二甲基-1H-吡唑-1-甲基)-噻唑-2-胺，相對百分含量分別為3.13%和2.30%；酸類化合物為1-叔丁基-1-苯基-環(huán)己甲酸、甲基-4-丁基-2-氧代四氫-3-呋喃羧酸和2-羥基-6-甲基-3-環(huán)己烯-1-羧酸，相對百分含量分別為2.20%、2.20%和1.55%；烯烴類化合物為1,2-順-1,5-反式-2,5-二羥基-4-甲基-1-(1-羥基-1-異丙基)-3-環(huán)己烯和6-乙氧基-9-硫代雙環(huán)[3.3.1]-2-壬烯，相對百分含量分別為2.12%和1.96%；醛類化合物為2-丁基-2-庚烯醛，相對百分含量為1.71%；糖類化合物為環(huán)1,2:3,5-雙(甲基硼酸)-α-D-呋喃木糖，相對百分含量為1.17%；咪唑類化合物為N,N′-硫羰基二咪唑，相對百分含量為1.47%；萘類化合物為(2α,3β,4α,8α)-2,3-二甲氧基十氫萘，相對百分含量為1.45%；呋喃類化合物為四氫-2,2-二甲基-5-(1-甲基乙基)-呋喃，相對百分含量為1.43%；噻吩類化合物為3-甲基-4-(苯硫基)-2-丙烯基-2,5-二氫噻吩，相對百分含量為2.89%；其他化合物中三環(huán)[5.1.0.0(3,5)]辛烷-2,6-二酮-1,3,4,5,7,8-六甲基-立體異構(gòu)體和(E)-1-羥基-2,2-二甲基-2,5-二氫-1H-咪唑-4-甲醛肟等相對百分含量較高，相對百分含量分別為2.79%和2.01%。菌柄與菌蓋中所檢測出的化合物中醇類和酯類含量最高，酯類化合物具有水果的芳香味，酮類也具有果香味，大球蓋菇鮮子實(shí)體具有清香味，可能是由于含有大量酯類和酮類化合物而成。

2.2 大球蓋菇子實(shí)體菌蓋和菌柄中主要揮發(fā)性化合物的比較

大球蓋菇含有食用菌中大部分揮發(fā)性物質(zhì)，醇類是主要呈香物質(zhì)，酯類具有水果的芳香味，酮類化合物一般具有花香和果香風(fēng)味，醛類化合物具有特殊的香氣，多為花香及果香氣味，較高碳位數(shù)的具有柑橘皮的香味，但所含特征性風(fēng)味物質(zhì)不一樣。大球蓋菇菌蓋和菌柄所含揮發(fā)性化合物成分對比見圖2。

2.2.1 醇類化合物的比較和分析

醇類化合物也是構(gòu)成大球蓋菇菌蓋和菌柄揮發(fā)性成分的主要組成成分之一，大球蓋菇菌蓋和菌柄都鑒定出11 種醇類化合物，分別約占總揮發(fā)性成分的22%。順式-1-環(huán)戊烯-3,4-二醇和4-哌啶醇是構(gòu)成大球蓋菇菌蓋醇類化合物的主要成分，相對百分含量分別為3.79%和2.66%；3,4-二羥基-2-甲基吡啶-5-甲醇和2-(2,5-二甲基環(huán)戊基)-1-丙醇是構(gòu)成大球蓋菇菌柄醇類化合物的主要成分，相對百分含量分別為3.13%和2.62%。

2.2.2 酯類化合物的比較和分析

酯類化合物主要通過醇和酸的酯化反應(yīng)產(chǎn)生。酯類化合物約占大球蓋菇揮發(fā)性總化合物數(shù)量的18%。大球蓋菇菌蓋和菌柄分別鑒定出8 種和10 種酯類化合物，分別占總揮發(fā)性成分的16%和22%。馬來酸二乙基己酯和(2-乙基己基)亞磷酸三酯是構(gòu)成大球蓋菇菌蓋酯類化合物的主要成分，相對百分含量分別為6.84%和2.76%；3-甲基丁基-2-十三炔-1-富馬酸酯和(8E)-10-甲基-8-十四烯酯是構(gòu)成大球蓋菇菌柄酯類化合物的主要成分，相對百分含量分別為1.66%和1.53%。

2.2.3 酮類化合物的比較和分析

酮類化合物約占大球蓋菇揮發(fā)性總化合物數(shù)量的10%。大球蓋菇菌蓋和菌柄分別鑒定出6 種和4 種酮類化合物，分別占總揮發(fā)性成分的12%和8%。3,3-二甲基-1-(1-氧雜螺[4.5]癸-2-基)-2-丁酮和8-羥基-2,2,8-三甲基-5,9-癸二烯酮是構(gòu)成大球蓋菇菌蓋酮類化合物的主要成分，相對百分含量分別為2.24%和1.86%；3-壬烯-2-酮和麝香酮是構(gòu)成大球蓋菇菌柄酮類化合物的主要成分，相對百分含量分別為3.16%和2.95%。

2.2.4 烴類化合物的比較和分析

烴類化合物包括烯烴類、烷烴類和芳香烴類化合物，也是構(gòu)成大球蓋菇揮發(fā)性成分主要組成之一。大球蓋菇菌蓋和菌柄分別鑒定出5 種和4 種烷烴類化合物，分別占總揮發(fā)性成分的10%和8%；大球蓋菇菌蓋還鑒定出1種炔烴類化合物，菌柄鑒定出2種烯烴類化合物，分別占總揮發(fā)性成分的2%和4%。[2-(戊氧基)乙基]環(huán)己烷和1R-乙酰氨基-2,3-順式-環(huán)氧-4-順式-甲酰氧-環(huán)己烷是構(gòu)成大球蓋菇菌蓋烷烴類化合物的主要成分，相對百分含量分別為2.75%和1.72%；1-溴-5-甲基己烷和2,6,10,14-四甲基-7-(3-甲基-4-亞戊烯基)十五烷大球蓋菇菌柄烷烴類化合物的主要成分，相對百分含量分別為2.40%和1.78%。

食用菌的揮發(fā)性成分主要包括八碳揮發(fā)性化合物和含硫化合物，還包括醇類、酯類、酸類和酮類等化合物，如1-辛烯-3-醇，1-辛烯-4-醇和3-辛烯-2-醇是大部分食用菌主要揮發(fā)性成分之一。陳萬超等[18]對香菇的揮發(fā)性成鑒定可知，香菇揮發(fā)性成分主要包括八碳化合物、含硫化合物、醛類、醇類、酸類、酮類、吡啶和呋喃化合物，1-辛烯-3-醇、3-甲基-1-丁醇、3-辛酮、2-甲基-1-丁醇、2-乙基己醇、二甲基四硫、二甲基三硫、二甲基二硫、1,2,4-三硫戊烷等為主要特征性風(fēng)味物質(zhì)。余昌霞等[24]對草菇所含揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行了分析，草菇揮發(fā)性成分主要是芳香族、烯烴類、醛類化合物，其次是醇類化合物、酮類化合物，特征揮發(fā)性物質(zhì)為異戊醛、己醛、1-辛烯-3-醇、甲硫醇、2-戊基呋喃、二甲基硫醚等，二甲基硫醚是產(chǎn)生美拉德反應(yīng)的成分之一。張憲臣等[20]對姬松茸揮發(fā)性成分研究發(fā)現(xiàn)，含有酯類、醛類、醇類、酚類、烯烴類、酮類、酸類、呋喃類和含氮雜環(huán)化合物等為揮發(fā)性物質(zhì)，苯甲醛、己酸甲酯、丁酸甲酯、異戊酸甲酯、異戊酸、3-乙基-2,5-甲基吡嗪為主要特征性風(fēng)味物質(zhì)，且吡嗪類化合物具有低閾值、留香時間長等特點(diǎn)，具有明顯焦香與谷物的香烤風(fēng)味。張福生等[14]對羊肚菌揮發(fā)性成分研究發(fā)現(xiàn)，醛類、酮類、酯類、酸類、醇類、雜環(huán)類和烴類化合物為主要揮發(fā)性成分，其中醇類、醛類和酮類化合物占總揮發(fā)性化合物含量的60%～80%；2-甲基丙醛、3-甲基丁醛、2-甲基丁醛、正己醛、1-辛烯-3-醇、薄荷酮為主要特征性風(fēng)味物質(zhì)。本研究通過HS-SPME-GC-MS 對大球蓋菇菌蓋和菌柄的揮發(fā)性成分鑒定，結(jié)果可知大球蓋菇的主要揮發(fā)性成分是醇類、酯類、酮類和醛類化合物，醇類化合物是主要呈香物質(zhì)，酯類化合物具有水果的芳香味，酮類化合物一般具有花香和果香風(fēng)味，醛類化合物具有特殊的香氣，多為花香及果香氣味，較高碳位數(shù)的具有柑橘皮的香味，其中3,4-二羥基-2-甲基吡啶-5-甲醇、4-哌啶醇、馬來酸二乙基己酯、環(huán)己烷和3-壬烯-2-酮為主要揮發(fā)性成分。

2.3 大球蓋菇子實(shí)體菌蓋和菌柄的PCA 分析

對表1 中大球蓋菇所含的揮發(fā)性成分進(jìn)行PCA 分析，見圖3。大球蓋菇子實(shí)體所含的揮發(fā)性物質(zhì)中，菌蓋和菌柄第1主成分解釋所有變量方差分別為54.3%和61.3%，第2 主成分解釋所有變量方差分別為45.7%和38.7%。由圖3 可知，在大球蓋菇菌蓋中，大部分揮發(fā)性成分聚集在第二象限和第四象限。在PCA1 上馬來酸二乙基得分最高，亞磷酸十三烷酯得分最低；在PCA2上4-哌啶醇得分較高，1,4-二異丙基環(huán)己烷得分較低。在大球蓋菇菌柄中，在PCA1 上3,4-二羥基-2-甲基吡啶-5-甲醇得分最高，硬脂醇乙酸酯得分最低；在PCA2上3-壬烯-2-酮得分較高，1,4-二異丙基環(huán)己烷得分較低。通過PCA 可了解大球蓋菇所含不同揮發(fā)性成分之間的相關(guān)性，根據(jù)PCA 的基本原則，物質(zhì)在得分圖上距離越接近說明物質(zhì)組分及含量的相似度越高。由此可知，菌蓋揮發(fā)性成分在第二和第四象限聚集分布，菌柄揮發(fā)性成分在每個象限呈分散分布，說明大球蓋菇菌蓋和菌柄在揮發(fā)性成分組成上具有明顯差異。

3 結(jié)論

本研究通過HS-SPME-GC-MS 技術(shù)分析了大球蓋菇子實(shí)體菌蓋和菌柄的揮發(fā)性成分。鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大球蓋菇總共鑒定出100 和揮發(fā)性化合物，其中菌蓋和菌柄都分別鑒定出50 個揮發(fā)性化合物，菌蓋和菌柄的PCA 的結(jié)果說明了揮發(fā)性成分和含量上存在明顯差異。其中醇類、酯類、烷類和酮類化合物相對百分含量較高，說明醇類和酯類是大球蓋菇的主要特征性風(fēng)味物質(zhì)，3,4-二羥基-2-甲基吡啶-5-甲醇、4-哌啶醇和馬來酸二乙基己酯相對百分含量最高。但此次研究有些食用菌特征風(fēng)味物質(zhì)未檢出，可能與大球蓋菇的品種、種植采收方式及樣品處理方式有關(guān)。如1-辛烯-3-醇（蘑菇醇），可能是由于醇類物質(zhì)容易分泌于胞外，在采收后的保藏運(yùn)輸和干制過程導(dǎo)致了流失而致。本研究通過對大球蓋菇不同部位的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行研究，明確了不同部位的主體揮發(fā)性物質(zhì)，這些成分如何影響大球蓋菇風(fēng)味形成還需進(jìn)一步研究確認(rèn)，但對建立大球蓋菇特征風(fēng)味指紋圖譜，并以風(fēng)味為育種過程中考察的重要農(nóng)藝性狀之一，對定向選育大球蓋菇新品種具有重要意義。