李 波，鄭樹城，曾偉偉，王 慶，李瑩瑩，尹紀元，王雅慧，呂月鳳，石存斌，趙志英，姜志勇，王英英

(1．上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命科學(xué)學(xué)院，上海，201306；2．中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁用藥物創(chuàng)制重點實驗室，廣東省水產(chǎn)動物免疫技術(shù)重點實驗室，廣州，510385；3.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院，動物分子設(shè)計與精準育種重點實驗室，普通高校動物分子設(shè)計與精準育種重點實驗室，生命科學(xué)與工程學(xué)院，廣東佛山，440605； 4.廈門大學(xué)海洋與地球?qū)W院， 福建廈門， 361100；5.海南省海洋與漁業(yè)科學(xué)院，?？冢?71126；6.廣東省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，廣州，510030)

多聚免疫球蛋白受體是一種Ⅰ型跨膜糖蛋白，能夠轉(zhuǎn)運分泌型抗體抑制病原微生物黏附和入侵。哺乳動物的多聚免疫球蛋白(polymeric immunoglobulin,pIg)R分子由胞質(zhì)區(qū)，胞外配體結(jié)合區(qū)和跨膜區(qū)三部分構(gòu)成，其中胞外配體結(jié)合區(qū)含有5個免疫球蛋白樣功能結(jié)構(gòu)域(ILD1～ILD5)，其中ILD1是與pIg結(jié)合的重要結(jié)構(gòu)域，與其它脊椎動物中ILD的數(shù)量不同，魚類pIgR分子只發(fā)現(xiàn)有對應(yīng)哺乳動物ILD1和ILD5的兩個免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域。

目前pIgR的免疫學(xué)功能研究主要集中在粘膜上皮細胞中pIg的調(diào)節(jié)、與配體的結(jié)合以及對pIg的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運等方面。在魚類研究上則主要涉及pIgR在病原感染過程中的調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，泥鰍()、鯽()、鯉()、斑馬魚()、草魚()以及大菱鲆()等魚類感染細菌后的pIgR表達水平相較健康的魚體具有顯著性差異。虹鱒()以及海鱸()體內(nèi)的pIgR通過與其共生菌和病原菌相結(jié)合而發(fā)揮抑制病原菌增殖的作用，表明pIgR在維持微生物群落以及抵御黏膜表面病原菌入侵方面發(fā)揮著重要作用。白斑綜合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)利用pIgR作為感染日本囊對蝦()的細胞表面受體，其胞外部分能夠與WSSV的VP24互作，胞內(nèi)部分則與鈣調(diào)素作用募集網(wǎng)格蛋白和AP-2復(fù)合物促進WSSV的侵入。

本研究通過PCR技術(shù)對羅非魚pIgR基因R完整的開放閱讀框序列進行擴增，預(yù)測了羅非魚pIgR的蛋白結(jié)構(gòu)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，檢測羅非魚感染羅非魚湖病毒(TiLV)后脾、腎以及皮膚組織中pIgR表達的變化，構(gòu)建了重組真核表達載體pEGFP-R并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至羅非魚腦細胞(TiB)中，初步研究了羅非魚pIgR對TiLV增殖的影響， 為羅非魚的抗病毒免疫研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料方法

1.1 實驗材料

實驗采用的健康羅非魚，平均體重(20±5) g，采購自廣東省某養(yǎng)殖場，暫養(yǎng)于120 cm×50 cm×60 cm的玻璃魚缸中，水溫維持在(28±1)℃且持續(xù)曝氣充氧，定時定量投喂。表達載體pEGFP-N1和克隆宿主5購自北京天根生物科技有限公司；TiB由珠江水產(chǎn)研究所魚病室建立并保存； TiLV-2017A由Sven.M.Bergennman博士(德國動物健康研究院) 贈送；限制性內(nèi)切酶EcoRI和KpnI、15 000 DNA marker、反轉(zhuǎn)錄試劑盒等購于寶生物工程有限公司；RNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒購自O(shè)mega生物技術(shù)有限公司；熒光定量試劑盒購自艾克瑞生物工程有限公司。

1.2 總RNA的提取以及cDNA的合成

取健康羅非魚18尾。15尾用于攻毒，每尾腹腔注射200 μL濃度約為10copies/μL的TiLV，剩余3尾注射相同體積PBS作為對照。攻毒組在注射后的12、24、48、72、96 h參照文獻[4]分別取三尾魚的脾臟、腎臟、皮膚等組織進行后續(xù)研究。使用Total RNA Kit I從收集的樣品中提取總RNA。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳和NANODROP 2000分光光度計確定RNA質(zhì)量與濃度。參照PrimeScriptRT Reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 OnpIgR基因的克隆

根據(jù)NCBI上提供的pIgR參考序列(GenBank:MK061423.1)，設(shè)計R基因ORF序列特異性擴增引物。引物名稱及序列如表1所示。 以1.2步驟中獲得的cDNA為模板使用高保真酶Prime STAR MAX，按照50 μL反應(yīng)體系配制反應(yīng)液，即Prime STAR MAX 25 μL，R-EcoRI-F，R-KpnI-R各1 μL，cDNA 2 μL，無酶水21 μL；反應(yīng)條件為98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，經(jīng)35次循環(huán)后獲得ORF全長。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的凝膠電泳鑒定后，在1 023 bp左右出現(xiàn)單一的目的條帶，采用Gel Extraction Kit(廣州飛揚生物工程有限公司，中國)對PCR產(chǎn)物進行純化。將純化產(chǎn)物連接至pMD18T載體，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細胞內(nèi)，使用氨芐抗性平板進行篩選，經(jīng)PCR檢測陽性后，送生工生物工程股份有限公司測序。

表1 引物信息Tab.1 Primers information

1.4 OnpIgR生物信息學(xué)分析

采用SMART在線服務(wù)器(https://smart.embl-heidelberg.de/smart/set_mode.cgi?NORMAL=1)預(yù)測R的結(jié)構(gòu)域。通過I-tasser在線服務(wù)器(https://zhanggroup.org/I-TASSER/)預(yù)測R的三維結(jié)構(gòu)。使用Cluster-X2.0程序進行多物種pIgR氨基酸序列比對，使用MEGA-X軟件進行系統(tǒng)發(fā)生和進化分析，采用鄰位相連法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.5 定量分析TiLV感染后組織中pIgR的表達變化

根據(jù)得到的ORF序列設(shè)計了實時熒光定量引物(q-pIgR-F/q-pIgR-R)，以β-actin(Tia-β-actin-F/ Tia-β-actin-R)作為內(nèi)參基因(序列見表1)，按照SYBR Green Premix ProHS qPCR Kit 說明書對1.2步驟中所取各組織中的pIgR進行定量分析。最后根據(jù)所測得的Ct值，采用2法計算pIgR基因的相對表達量。

1.6 真核表達載體的構(gòu)建

使用限制性內(nèi)切酶EcoRI和KpnI對擴增獲得的R基因以及pEGFP-N1載體進行酶切，反應(yīng)條件為37 ℃，1 h。使用Thermo Fisher 的T4連接酶對酶切產(chǎn)物進行連接，連接條件為22 ℃ 10 min。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化后，涂布于卡那霉素抗性平板上篩選鑒定，陽性克隆經(jīng)PCR以及酶切鑒定后送測序。序列正確的質(zhì)粒命名為pEGFP-R。使用Omega公司的無內(nèi)毒素的質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒pEGFP-R，測定質(zhì)粒濃度后-20 ℃保存。

1.7 Western Blot鑒定

將狀態(tài)良好的TiB細胞經(jīng)胰酶消化處理后，用含10% 胎牛血清(FBS)的M199培養(yǎng)基制備成含有1×10個/mL的細胞懸液，分別吸取2.5 mL的細胞懸液接種到六孔板的三個孔中，待細胞單層覆蓋到80%～90%左右的時候，分別向其中的兩孔中轉(zhuǎn)染2 μg的重組質(zhì)粒pEGFP-R以及pEGFP-N1空載，剩下一孔不做轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染方法參照Lipo-fectamine2000(Invitrogen,USA)的說明書進行。轉(zhuǎn)染36 h后，棄上清，加入200 μL 1× SDS緩沖液收取細胞樣到1.5 mL的離心管中，混勻后煮沸5 min，12 000離心1 min獲得上清。蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(NC膜)上進行Western blot分析。5%脫脂奶室溫下封閉1 h，將商品化GFP兔抗按照1∶4 000倍稀釋后室溫孵育2 h，加入二抗(1∶4 000稀釋)室溫孵育2 h，加入顯色液顯色，拍照記錄。

1.8 TiB細胞中OnpIgR過表達對TiLV增殖的影響

將狀態(tài)良好的TiB細胞于轉(zhuǎn)染前24 h接種到底面積為25 cm的6個細胞培養(yǎng)瓶中，平均分為2組。 每一組參照Lipofectamine2000說明書步驟分別轉(zhuǎn)染50 μg的pEGFP-N1質(zhì)粒和pEGFP-R過表達質(zhì)粒，每組設(shè)置三個平行。并在轉(zhuǎn)染后的36 h時棄掉培養(yǎng)液，用HBSS清洗兩遍，分別加入濃度約為10copies/μL 的TiLV病毒液各1 mL，在28 ℃的培養(yǎng)箱中孵育1.5 h，之后棄掉病毒液，補加5 mL的含5%FBS的M199培養(yǎng)基，繼續(xù)放入28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在病毒感染后的48 h和72 h收樣。分別對-1基因，-8和-10基因進行定量檢測。

1.9 數(shù)據(jù)分析

使用GraphPad Prism 8 軟件對實驗組與對照組的數(shù)據(jù)按照tests方法進行顯著性差異分析，>005表示差異不顯著，<005表示差異顯著，<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 羅非魚pIgR分子特征

通過PCR擴增的基因經(jīng)測序比對后，確認為羅非魚pIgR 完整ORF 序列。結(jié)構(gòu)域預(yù)測顯示，羅非魚pIgR蛋白的第1～20個氨基酸構(gòu)成一個信號肽，第25～130以及第137～229個氨基酸分別構(gòu)成兩個Ig樣結(jié)構(gòu)域(圖1-A)；同源建模結(jié)果顯示，pIgR蛋白整體呈扭曲的“L”型，主要由反平行β片層和無規(guī)卷曲組成(圖1-B)；進化樹分析顯示，pIgR主要分為哺乳類，兩棲類和鳥類，以及硬骨魚類三個亞群。其中羅非魚pIgR與同屬于鱸形目()的大口黑鱸()以及斜帶石斑魚()的pIgR最為接近(圖2)。

圖1 羅非魚pIgR蛋白結(jié)構(gòu)域與三維結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.1 Prediction of tilapia pIgR protein domain and 3D structureA結(jié)構(gòu)域預(yù)測：紅色區(qū)域為信號肽，綠色區(qū)域為Ig樣結(jié)構(gòu)域，紫色區(qū)域為低復(fù)雜度區(qū)；B：三維結(jié)構(gòu)預(yù)測

圖2 不同物種pIgR蛋白序列系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of different species pIgR amino acids sequences

2.2 羅非魚pIgR時相表達模式分析

羅非魚在感染TiLV后，皮膚、脾臟以及腎臟三個組織器官中pIgR的表達量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，感染后24 h皮膚中pIgR的表達量達到最高值(圖3-B)；在脾臟和腎臟中則是48 h時表達量達到最高值隨后開始下降(圖3-A、3-C)。

圖3 不同組織中的時相表達Fig.3 pIgR expression in different tissues at post infectionA：pIgR在脾臟中的時相；B：pIgR在皮膚中的時相；C：pIgR在腎臟中的時相;*表示差異存在顯著性(P<0.05)，圖5同。

2.3 重組真核表達載體構(gòu)建與鑒定

結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染pEGFP-R在55～70 kDa的位置出現(xiàn)與預(yù)期大小相符的融合蛋白條帶(圖4)，表明重組真核表達質(zhì)粒pEGFP-R可以在細胞內(nèi)正確表達出目的蛋白。

圖4 Western-blot鑒定重組質(zhì)粒pEGFP-OnpIgR體外表達情況Fig.4 Expression of recombinant plasmid pEGFP-OnpIgR in vitroM為蛋白Marker；1為轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒細胞樣；2為轉(zhuǎn)染pEGFP-n1空載細胞樣；3為空白TiB細胞樣

2.4 pIgR過表達對TiLV增殖的影響

圖5結(jié)果顯示，與對照組細胞相比，在過表達pIgR的細胞中TiLV感染后48 h和72 h的-8和-10片段的mRNA水平均明顯上調(diào)，病毒拷貝數(shù)也顯著增多，表明pIgR顯著促進了TiLV的增殖。

圖5 pIgR過表達對TiLV增殖的影響Fig.5 Effect of pIgR overexpression on TilV proliferation

3 討論

本研究成功克隆了羅非魚pIgR 完整ORF序列，長度為1 023 bp，蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測顯示羅非魚pIgR蛋白具有一個信號肽，兩個Ig樣結(jié)構(gòu)域，同源建模結(jié)果顯示，pIgR蛋白整體呈扭曲的“L”型，主要由反平行β片層和無規(guī)卷曲組成，與相關(guān)報道中的魚類pIgR結(jié)構(gòu)一致，表明羅非魚的pIgR具備結(jié)合和轉(zhuǎn)運多聚免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)；系統(tǒng)進化樹結(jié)果顯示，硬骨魚類pIgR聚為一支，兩棲類和鳥類的聚為一支，哺乳類的聚為一支，且羅非魚pIgR與同屬于鱸形目的大口黑鱸以及斜帶石斑魚的pIgR聚為一個分支，而同屬于鯉科魚類的草魚、鯉魚以及斑馬魚又聚為一個分支，表明pIgR具有一定的種屬性差異。RT-qPCR定量結(jié)果顯示，感染TiLV后羅非魚皮膚、脾臟以及腎臟器官中pIgR的表達量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，感染后24 h皮膚中表達量達到最高值，隨后開始下降；在脾臟和腎臟中則是48 h時達到最高值隨后開始下降。表明羅非魚受到外界刺激時，相對于中樞免疫器官而言，粘液相關(guān)免疫組織能夠更早地做出免疫反應(yīng)。成功構(gòu)建了羅非魚pIgR過表達受體，并在TiB細胞中進行pIgR過表達后顯著促進了TiLV的增殖。與NIU等的發(fā)現(xiàn)，WSSV能夠利用pIgR促進自身增殖；在LLC-PK1細胞上過表達也能夠促進豬流行性腹瀉病毒(PEDV)增殖等研究結(jié)果一致，初步表明TiLV也可能利用pIgR促進自身感染。

目前關(guān)于魚類pIgR 的研究大多涉及對病原菌的響應(yīng)和表達模式分析。如pIgR在斜帶石斑魚、牙鲆()、大菱鲆和鯉魚等硬骨魚類組織中均有表達，且在胃、腸道、鰓和皮膚等粘液相關(guān)組織中的表達量較高。通過實時熒光定量檢測發(fā)現(xiàn)菌液浸泡處理后的鯉魚腸道中的pIgR表達量呈先上升后下降的趨勢。斑馬魚在感染海豚鏈球菌后，pIgR表達水平也呈現(xiàn)穩(wěn)定上升趨勢，但是感染烏鱧彈狀病毒(SHRV)后的斑馬魚pIgR表達水平則穩(wěn)定下降。表明病毒刺激引起的pIgR表達變化與細菌刺激引起的變化存在著差異，具體原因有待后續(xù)進一步研究證明。草魚浸泡感染柱狀黃桿菌后，pIgR mRNA水平也迅速顯著上升，隨后逐漸下降到對照水平，并且在草魚的皮膚中pIgR mRNA的增長最早，幅度最大，且其在皮膚中的應(yīng)答反應(yīng)比在腸或鰓中更快。除了病原菌，有報道表明泥鰍在感染了白點蟲之后，其脾臟、腎臟、鰓和皮膚中的pIgR表達量也顯著升高。盡管對多種不同硬骨魚類pIgR在應(yīng)對病原菌或寄生蟲感染響應(yīng)的表達模式有了初步的了解，并提示其在黏膜免疫過程中發(fā)揮重要的作用，但其潛在的分子機制仍有待進一步闡明。

除了黏膜免疫上的功能，pIgR作為細胞表面分子受體也常被部分病毒劫持作為入侵的靶點。之前的研究已發(fā)現(xiàn)多種病毒包括RNA 病毒和DNA病毒將pIgR作為病毒入侵的受體進入細胞。如pIgR過表達的宿主細胞感染PEDV之后，PEDV的N蛋白、病毒滴度以及病毒mRNA均顯著增加，表明pIgR促進了PEDV在宿主細胞內(nèi)的增殖。王會英等發(fā)現(xiàn)，EPC細胞中干擾素的特異性表達能夠靶向抑制傳染性造血器官壞死病毒的增殖。而pIgR表達量的降低能夠?qū)е翴FN-γ表達水平的上升，從而減低鼠諾如病毒(MNV)的滴度，在pIgR敲降小鼠中，病毒的急性感染也出現(xiàn)減緩。以上研究均表明pIgR在影響病毒入侵過程中發(fā)揮著重要作用。而關(guān)于水生動物pIgR及病毒的研究，目前較為清晰的是日本囊對蝦pIgR(MjpIgR)與WSSV之間的互作，該病毒可通過與MjpIgR結(jié)合后經(jīng)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞方式進入細胞完成自身增殖。本研究發(fā)現(xiàn)羅非魚pIgR過表達后也促進了TiLV的增殖，TiLV是否也是利用pIgR通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞進入細胞將在后續(xù)的研究中進一步闡明。

作為水生動物新發(fā)病毒，TiLV的病原學(xué)及致病機理仍不清楚，本研究對羅非魚pIgR的生物學(xué)特性及對TiLV的增值影響作用進行了初步研究，為后續(xù)TiLV致病機制的研究、抗TiLV藥物的研發(fā)和抗TiLV苗種的培育具有一定的借鑒意義。