劉 德，閆卉果，董智玲，羅 輝，2，葉 華，2 ，何文平，2

(1.西南大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，重慶，402460；2.淡水魚類資源與生殖發(fā)育教育部重點實驗室，重慶，402460；3.內(nèi)江市東興區(qū)漁業(yè)發(fā)展中心，四川內(nèi)江，641100)

多鱗白甲魚()屬硬骨魚綱(Osteichthyes)鯉形目(Cypriniformes)鯉科(Cyprinidae)鲃亞科(Barbinae)突吻魚屬()，俗稱石口魚、錢魚、赤鱗魚，被稱為水中“活化石”。多鱗白甲魚市場價格昂貴，是山區(qū)漁業(yè)中頗受青睞的經(jīng)濟魚類，主要分布在嘉陵江、漢江中上游，淮河、海河上游，是我國現(xiàn)存鲃亞科魚類中分布記錄緯度最高的魚類。由于受水質(zhì)污染、過度捕撈、氣候變化等因素的影響，多鱗白甲魚野生資源匱乏，目前已被列為國家二級保護動物。

目前多鱗白甲魚人工養(yǎng)殖苗種主要來源于天然水域，而捕撈的苗種無法滿足大規(guī)模養(yǎng)殖的需求，因此亟待解決多鱗白甲魚苗種規(guī)?；庇募夹g(shù)難題。本研究通過觀察多鱗白甲魚胚胎和仔稚魚發(fā)育過程，描述該魚胚胎和仔稚魚發(fā)育特征和時序，以期為其人工繁殖和苗種培育技術(shù)建立提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 親魚來源

2015年3月，在重慶市巫山縣大寧河采集多鱗白甲魚，成功培育至性腺成熟。繁殖用雌性親魚腹部飽滿，生殖孔紅腫，擠壓腹部時卵粒從生殖孔流出，在陽光照射下，背鰭具五彩色橫斑紋；雄魚顏色比雌魚暗淡，吻部有明顯珠星，雄性親魚腹部被擠壓后，泄殖孔流出乳白色精液。

1.2 授精與孵化

2019年3月，從2 000尾親魚中篩選出3～5齡雌魚60尾，雄魚120尾，通過人工干法授精得到受精卵。用羽毛將受精卵平鋪在提前清洗、消毒的自制孵化箱內(nèi)，孵化箱用高15 cm的木質(zhì)框架制成，釘在孵化箱底部的篩網(wǎng)規(guī)格為60目，孵化箱規(guī)格為40 cm × 80 cm。之后放在直徑2 m的圓形孵化池中，采用微流水刺激進行孵化，水深1.5 m，受精卵孵化水溫為(17.2±0.5)℃，水體溶氧為7.3～8.4 mg/L，pH 7.0～7.5。

1.3 觀察與取樣

從孵化箱中隨機選擇30～50個胚胎用ZSA0850體式顯微鏡連續(xù)觀察胚胎發(fā)育，并用Canon PowerShot G11數(shù)碼相機進行顯微拍照，最后利用Photoshop CS5.0對拍攝的胚胎發(fā)育照片進行修剪編排。

從出現(xiàn)初孵仔魚開始，隨機取樣50尾，使用Olympus sz61解剖鏡和ZSA0850體式顯微鏡連續(xù)觀察仔、稚魚發(fā)育，并用Canon PowerShot G11數(shù)碼相機進行顯微拍照記錄。

胚胎發(fā)育所需積溫計算：胚胎發(fā)育各時期的積溫時長=平均水溫(℃)×此階段胚胎發(fā)育所用時間(h)。

2 結(jié)果與分析

2.1 多鱗白甲魚胚胎發(fā)育

多鱗白甲魚的發(fā)育過程分為受精卵形成、卵裂、囊胚、原腸胚、神經(jīng)胚、器官形成和出膜共7個階段25個時期(表1，圖Ⅰ)。在水溫為(17.2±0.5) ℃的條件下，多鱗白甲魚胚胎耗時147 h 30 min出膜，有效積溫達到2 582.56 ℃·h。

表1 多鱗白甲魚胚胎發(fā)育時序Tab.1 Time sequence of embryonic development of V.macrolepis

2.1.1 受精卵及胚盤形成

多鱗白甲魚的受精卵為卵圓形，呈金黃色或白色，粘性，卵徑為(2.46 ± 0.12 )mm，卵膜吸水后直徑膨脹到(2.87±0.36) mm，見圖1-B。受精1 h48 min后，動物極在受精卵的上端，植物極在下端，可見受精卵的細胞質(zhì)緩慢聚集向動物極，動物極由此出現(xiàn)明顯的放射狀黑斑，隆起形成胚盤，此階段為胚盤形成期，如圖1-C所示。

2.1.2 卵裂期

受精卵第一次分裂開始于受精后3 h 38 min，在胚盤的中心出現(xiàn)了不斷加深的裂溝，最終發(fā)展成縱向溝，將胚盤分成兩個同樣大的細胞，進入2細胞期，如圖1-D所示。受精后4 h 15 min，出現(xiàn)第二次分裂，第二次分裂與第一次分裂面呈垂直的十字形，兩次分裂后，產(chǎn)生4個大小近似的細胞，該階段為4細胞期，如圖1-E所示。第三次分裂發(fā)生在受精后5 h 2 min，分裂溝與第一次分裂面平行，形成了8個同樣大的細胞，呈兩排分布，見圖1-F。第四次分裂在受精后5 h 23 min開始，有兩條分裂溝出現(xiàn)，形成16個細胞，見圖1-G。第五次分裂在受精后6 h 13 min，細胞大小有著略微的差別，邊緣的細胞稍大一些且規(guī)則相連，形成32個細胞，如圖1-H所示。多細胞期在受精后7 h 38 min，細胞經(jīng)過數(shù)次分裂后，細胞之間的界限分明但排列并不規(guī)則，如圖1-I所示。

2.1.3 囊胚期

受精后9 h 32 min，胚盤細胞體積越變越小，受精卵的一端高度隆起，囊胚形成，如圖1-J所示。受精后19 h 20 min，囊胚層較早期底，這一時期被稱為囊胚中期，如圖1-K所示。受精后22 h 2 min，囊胚變得更加扁平，細胞向下擴張，并開始向卵黃下包，胚胎進入囊胚晚期，如圖1-L所示。

2.1.4 原腸胚期

原腸胚早期在受精后33 h 15 min，囊胚細胞沿卵黃向下擴張至1/2處，如圖1-M所示。原腸胚中期在受精后39 h 7 min，胚層繼續(xù)下包至1/2～2/3處，如圖1-N所示。原腸胚晚期在受精后45 h 19 min，后胚盾開始顯現(xiàn)，胚層下包卵黃囊約3/4處，見圖1-O。

2.1.5 神經(jīng)胚期

神經(jīng)胚期在受精后50 h 24 min，胚層繼續(xù)下包，胚體背部變厚并形成一條神經(jīng)索，如圖1-P所示。胚孔封閉期在受精后43 h 37 min，隨著胚盤下包擴張，胚孔漸漸消失，如圖1-Q所示。

2.1.6 器官形成期

肌節(jié)出現(xiàn)期在受精后56 h，在胚胎中心產(chǎn)生2-3對肌節(jié)，可看到胚體雛形，如圖1-R所示。眼囊期在受精后60 h 39 min，胚體頭兩側(cè)向外凸起，從而形成一對較大的視泡，如圖1-S所示。尾芽出現(xiàn)在受精后65 h 48 min，此時卵黃開始變小，胚胎的尾部突出，進入尾芽期，見圖1-T。肌肉效應(yīng)期在受精后73 h 21 min，此時胚體繼續(xù)發(fā)育，頭部變大，可觀察到胚體中部，胚體頻繁扭動，頻率9～10次/min，見圖1-U。耳石出現(xiàn)期在受精后82 h 42 min，可見眼囊后方有兩個透明晶體耳石，見圖1-V。心臟跳動期在受精后95 h 55 min，心臟開始有節(jié)奏地跳動，心跳次數(shù)為35～40次/min，如圖1-W所示。出膜前期在受精后103 h 31 min，腦部前、中、后三部分也可清晰分辨，如圖1-X所示。

2.1.7 出膜階段

受精后96 h，胚胎持續(xù)劇烈擺動，心臟跳動速度變快，在尾巴擺動的幫助下，仔魚開始出膜；受精后147 h 30 min，一半仔魚出膜，至受精后156 h全部仔魚出膜。魚苗剛出膜時沒有游泳能力，全身透明，背部紋絡(luò)清晰可見，腹部下有一個橢圓形的卵黃囊，心率114～128次/min，體長(8.86±0.52)mm，如圖1-Y所示。

圖1 多鱗白甲魚的胚胎發(fā)育

A.成熟卵；B.受精卵；C.胚盤隆起；D.2細胞期；E.4細胞期；F.8細胞期；G.16細胞期；H.32細胞期；I.多細胞期；J.囊胚早期；K.囊胚中期；L.囊胚晚期；M.原腸早期；N.原腸中期；O.原腸晚期；P.神經(jīng)胚期；Q.胚孔封閉期；R.體節(jié)出現(xiàn)期；S.眼基出現(xiàn)期；T.尾芽期；U.肌肉效應(yīng)期；V.耳石出現(xiàn)期；W.心臟

跳動期；X.出膜前期；Y.出膜

2.2 多鱗白甲魚仔魚發(fā)育

多鱗白甲魚仔魚的生長和發(fā)育特征詳見圖2。初孵仔魚全長(8.86 ± 0.52)mm。整個魚體呈白色或金黃色，全身無色素。仔魚頭部與卵黃囊緊密相接的地方可見黑色的耳石，下端為不斷跳動的心臟，心率128次/min。魚體前下方有一個圓球狀的卵黃囊，約占魚體整個長度的2/5，內(nèi)含有大量卵黃；后端為長條狀，占總長度的3/5。2 d仔魚，眼出現(xiàn)黑色素，頭部上方有少量星狀黑色素斑點，星狀斑點順著蔓延至背部并且逐漸減少；心臟沿卵黃囊下端開始變紅形成血液，最后一節(jié)尾椎骨向上微微翹起。3 d仔魚，眼囊內(nèi)的黑色素增加，圍心腔擴大，卵黃囊上有淡紅色的血絡(luò)分布一直蔓延到肛門處，卵黃囊顯著變小，變成棒槌形。4 d仔魚，體表和背鰭原基處黑色素增加。5 d仔魚，黑色素向腹部蔓延，胸鰭舒展開來，為扇形，卵黃減小呈細條狀，運動能力變強。尾部出現(xiàn)扇形透明狀的尾鰭原基。6 d仔魚，卵黃囊消失，進入外源性營養(yǎng)階段，顯微鏡下可以看到明顯的肛突。7 d仔魚，體表黑色素增加且變得集中，尾鰭黑色素呈輻射型分布，向鰭條演變。8 d仔魚，第一鰾室出現(xiàn)，鰾室附近黑色素極多，連成線狀同時在腹部出現(xiàn)黑色素，卵黃繼續(xù)減少，魚體分布血管呈網(wǎng)狀；尾椎微上翹，背鰭分化，可短時平游。10 d仔魚，出現(xiàn)條雛形尾鰭，腸道已經(jīng)貫通。15 d仔魚消化系統(tǒng)進一步完善。20 d仔魚，出現(xiàn)背鰭鰭條，腹部鰭褶延伸至胸鰭后緣，臀鰭開始分化。21 d仔魚，黑色素遍布整個魚體，第二鰾室出現(xiàn)，尾鰭開始分叉。34 d魚體開始出現(xiàn)第一枚鱗片，進入稚魚期。70 d魚體鱗片已發(fā)育完全，各鰭也已長成，魚體顏色和體型接近于成魚，進入幼魚階段。

圖2 多鱗白甲魚仔稚魚發(fā)育Fig.2 The larvae and juvenile development of V.macrolepis

3 討論

3.1 多鱗白甲魚胚胎發(fā)育特點

多鱗白甲魚的卵為粘性、沉性，其成熟卵類似于細鱗裂腹魚()，與其他魚類胚胎發(fā)育特點比較具體見表2。卵徑比尖裸鯉()、哲羅鮭()小，比黑斑狗魚()、胭脂魚()、桂華鯪()和歐洲舌齒鱸()大，多鱗白甲魚受精卵與同為鲃亞科的厚唇裸唇魚()和云南光唇魚()相比，都是大型卵。盡管如此，具有低溫繁殖習性的多鱗白甲魚的卵徑較一些棲息于熱帶或亞熱帶的魚類要大，這可能是多鱗白甲魚適應(yīng)低溫環(huán)境的一種繁殖策略：在較低溫度條件下，孵化期長、代謝率低，對大卵有利。同時，較大卵徑意味著含有更多的能量和營養(yǎng)物質(zhì)，有利于應(yīng)對繁殖季節(jié)水溫低、餌料生物匱乏的惡劣條件。成熟受精卵的大小對早期發(fā)育有重要意義，一般而言卵黃較大，儲存的營養(yǎng)物質(zhì)越多，對器官分化和胚胎發(fā)育越有利，而較小的卵死亡率更高，但卵徑越大，胚胎發(fā)育有效積溫越高，胚胎發(fā)育越慢。與其他魚類相比，多鱗白甲魚的受精卵偏大，理論上會導(dǎo)致整個胚胎發(fā)育過程時間偏長，但由于本實驗中使用的水溫較高，從而使多鱗白甲魚胚胎發(fā)育時間甚至低于卵徑較小的魚類。

表2 多鱗白甲魚與其他魚類胚胎發(fā)育特點比較Tab.2 Comparison of embryonic development characteristics between V.macrolepis and other fishes

3.2 多鱗白甲魚胚胎發(fā)育對水溫的要求

魚類在進化過程中，對生活環(huán)境也表現(xiàn)出適應(yīng)性，一定積溫下才能保證仔魚正常出膜和成活。在(17.2±0.5)℃下，多鱗白甲魚胚胎發(fā)育歷時147 h 30 min，積溫2 537.82 ℃·h時70%出膜，胚胎發(fā)育的積溫比川陜哲羅鮭()6 292.50 ℃·h、黑斑狗魚()4 511.50 ℃·h和尖裸鯉2 737.52 ℃·h等冷水性魚類低，但比歐洲舌齒鱸()2 302.00 ℃·h、厚唇裸唇魚1 962.00 ℃·h和桂華鯪()1 000.00 ℃·h高。這與郭文學(xué)等的研究結(jié)論相同，即較高溫度下繁殖的溫水性魚類的胚胎發(fā)育時間比較低溫度下繁殖的冷水性和亞冷水性魚類要短。而多鱗白甲魚作為孵化率較低的亞冷水性魚類，較低溫度雖使其孵化時間延長，但同時也抑制了某些細菌類病害或傳染病的發(fā)生提高了其孵化率。

3.3 多鱗白甲魚仔稚魚發(fā)育特征分析

殷名稱指出，卵的大小和初孵仔魚大小密切相關(guān)，個體大的仔魚生長迅速，存活率高。同時，大卵黃可為仔魚提供更多的營養(yǎng)物質(zhì)，延長內(nèi)外營養(yǎng)源轉(zhuǎn)化時間，以提高野外生存的成活率。多鱗白甲魚初孵仔魚全長(8.86±0.52)mm，大于小裂腹魚()(7.5 mm)、松潘裸鯉()(8.0 mm)、云南裂腹魚()(8.0 mm)和塔里木裂腹魚()(7.0～8.0 mm)，與青海湖裸鯉()(8.9 mm)接近，比尖裸鯉(10.27 mm)和拉薩裂腹魚()(10.71±0.28) mm小。

營養(yǎng)轉(zhuǎn)化是魚類在早期發(fā)育過程中生命活動最敏感的時期，也稱為種苗人工繁育的開口期。多鱗白甲魚6 d時卵黃囊基本消失，進入外源性營養(yǎng)階段，比塔里木裂腹魚(5 d)長，比尖裸鯉(20 d)和四川裂腹魚()(18 d)短。魚類仔魚的營養(yǎng)轉(zhuǎn)化有兩種方式，一種為營養(yǎng)由內(nèi)源性直接轉(zhuǎn)化為外源性，即在卵黃消失完全之后開口攝食；內(nèi)源性營養(yǎng)就越充足，仔魚處于內(nèi)源性營養(yǎng)及混合營養(yǎng)階段的時間就越長，這對仔魚建立初次攝食、提高存活率具有重要的意義。另一種是混合性營養(yǎng)，即仔魚在還有剩余的卵黃物質(zhì)即開口攝食。仔魚卵黃囊內(nèi)的卵黃不能滿足多鱗白甲魚正?；顒拥哪芰啃枨?，因此在混合營養(yǎng)期階段，也就是孵出3～5 d時必須及時補充足夠的營養(yǎng)來源以滿足多鱗白甲魚生長發(fā)育需要。

多鱗白甲魚仔魚外源性營養(yǎng)階段開始于6日齡，仔魚初次攝食的數(shù)量和質(zhì)量也是影響仔魚存活的關(guān)鍵所在，隨著日齡的增加及消化器官的不斷完善，仔魚對營養(yǎng)的需求不斷增加，因此，在早期培育過程中適當調(diào)整餌料的投喂次數(shù)、每次投喂量，再加上適時分池處理將有利于提高魚苗成活率。