楊合霖，張 穎，王念民，徐 偉，呂偉華

(1．上海海洋大學(xué)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江省冷水性魚類種質(zhì)資源及增養(yǎng)殖重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150070)

鱘隸屬于硬骨魚綱(Osteichthyes)鱘形目(Acipenseriformes)，是現(xiàn)存起源最早的脊椎動(dòng)物之一，具有極高的科研價(jià)值。鱘魚籽營養(yǎng)豐富，制成的魚子醬價(jià)格昂貴，素有“黑色黃金”之稱。中國的鱘魚產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅猛，鱘魚養(yǎng)殖產(chǎn)量和魚子醬產(chǎn)量世界領(lǐng)先，20世紀(jì)90年代初至今，中國的鱘魚養(yǎng)殖品種不斷增多，其中 “鱘龍1號”(♀×)為中國第一個(gè)自主選育獲得的雜交鱘新品種，相比其他鱘科魚類，該品種兼具個(gè)體大、生長快與性腺發(fā)育早等優(yōu)勢。

1 材料方法

1.1 試驗(yàn)材料

“鱘龍1號”幼魚(簡稱雜交鱘)采集于中國水產(chǎn)科學(xué)研究院北京房山鱘魚工程繁育中心，并于黑龍江水產(chǎn)研究所呼蘭基地進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)魚約為30日齡，體長為(133.17±16.75) mm，體重為(12.43±3.99) g。本試驗(yàn)設(shè)置了1個(gè)對照組(C)與1個(gè)脅迫組(T)，每組設(shè)三個(gè)平行。對照組為自來水，實(shí)際測定堿度為3.13 ～ 3.20 mmol/L，脅迫組為自來水添加99%純度的食用小蘇打(哈爾濱市呼蘭區(qū)三鑫制堿廠)的穩(wěn)定溶解液，實(shí)際測定堿度為14.4 ～16.67 mmol/L，每個(gè)養(yǎng)殖缸養(yǎng)殖15尾，共90尾。

試驗(yàn)前于自來水中馴養(yǎng)2周，養(yǎng)殖水溫為17～21 ℃，溶氧量大于6 mg/L，日投喂2次(天邦鱘魚顆粒配合飼料)，日投餌率為1%～1.5%。試驗(yàn)開始后每2日更換相同堿度新水，持續(xù)增氧曝氣，并保持水質(zhì)清潔。于試驗(yàn)第30天，采集鰓組織，保存于Bouin′s固定液，并于24 h后轉(zhuǎn)入70%酒精中保存，每個(gè)平行各取3尾備用。另取鰓裝入凍存管后用液氮臨時(shí)保存，于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，每個(gè)平行各取5尾混合為一個(gè)重復(fù)，每組共采3個(gè)重復(fù)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 鰓的石蠟切片制作與觀察

將鰓修成小塊(3 mm×3 mm×3 mm)，分別置于70%、80%、90%、95%和100%(2次)的酒精中進(jìn)行梯度脫水，并置于二甲苯 ∶酒精(1 ∶1)、二甲苯(2次)中梯度脫去酒精，再置于二甲苯 ∶石蠟(1 ∶1)、軟蠟和硬蠟除去二甲苯，進(jìn)行石蠟包埋；用MICROM HM 200切片機(jī)切片，切片厚度為4 μm；將獲得的切片置于二甲苯、二甲苯 ∶酒精(1 ∶1)、100%酒精、90%酒精、80%酒精和清水，逐步除去組織內(nèi)的石蠟、二甲苯和酒精，并進(jìn)行蘇木精·伊紅(H·E)染色；染色后的切片逐步置于70%酒精、80%酒精、90%酒精、100%酒精、二甲苯 ∶酒精(1∶1)、二甲苯(2次)；采用中性樹膠封片，并用Leica DMI 6000B拍照觀察。

1.2.2 RNA提取及RNA-seq測序

利用 RNA easy Lipid Tissue Mini Kit(QIAGEN，Germany)提取總RNA。利用nanodrop 8000儀器檢測各RNA樣品的純度和濃度，并通過瓊脂糖凝膠電泳極檢測RNA的完整性。RNA-seq測序委托上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司(上海)完成，利用 Illumina HiseqTM 2500平臺進(jìn)行高通量測序。

1.2.3 測序數(shù)據(jù)分析

測序數(shù)據(jù)去除接頭、重復(fù)及低質(zhì)量數(shù)據(jù)后，利用Trinity軟件將數(shù)據(jù)全部混合拼接獲得Unigene，并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄注釋及表達(dá)量的計(jì)算。利用 DESeq 進(jìn)行基因的差異表達(dá)分析，并進(jìn)行聚類分析。使用DEseq2 方法進(jìn)行差異基因檢測，<0.05視為差異表達(dá)。利用GO數(shù)據(jù)庫對差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋和富集，運(yùn)用KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行通路分析，F(xiàn)DR≤0.01和Fold Change≥2視為顯著富集。使用Cytoscape軟件構(gòu)建代謝通路互作網(wǎng)絡(luò)。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示。為保證試驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性，組織顯微結(jié)構(gòu)設(shè)3個(gè)生物重復(fù)，轉(zhuǎn)錄組測序設(shè)3個(gè)生物重復(fù)，5尾魚混為一個(gè)重復(fù)。用SPSS 22進(jìn)行單因素方差分析和Duncan多重比較，顯著性水平設(shè)為<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 鰓組織結(jié)構(gòu)的病理變化分析

鰓組織切片觀察顯示，對照組的鰓小片為扁平囊狀，細(xì)長，呈梳狀排列，鰓小片由單層上皮細(xì)胞、毛細(xì)血管和柱狀支持細(xì)胞組成，上皮細(xì)胞呈扁平狀，核梭形，柱狀支持細(xì)胞核大而圓，與基膜相連，鰓絲及鰓小片中含有氯細(xì)胞，少量分布(圖1-a)。與對照組相比，脅迫組的鰓絲與鰓小片發(fā)生腫脹，鰓絲血管壁上有大量扁平細(xì)胞與柱細(xì)胞增生，泌氯細(xì)胞數(shù)量增加，鰓小片發(fā)生卷曲、融合，鰓上細(xì)胞脫落、游離(圖1-b)。顯微結(jié)構(gòu)測量結(jié)果顯示，脅迫組的氯細(xì)胞略有膨大，與對照組差異不顯著，鰓小片寬度和鰓小片間距顯著增大，差異顯著(<0.05)(表1)。

圖1 雜交鱘幼魚對照組與脅迫組的鰓絲組織切片(H·E)Fig.1 Tissue section of gill filament of juvenile hybrid sturgeon of control group and stress group(H·E)“a”為對照組；“b”為脅迫組；BC： 血細(xì)胞；CSC：氯細(xì)胞；GL： 鰓小片；PC： 柱細(xì)胞；PVC： 扁平上皮細(xì)胞

表1 對照組和脅迫組雜交鱘幼魚鰓絲的顯微結(jié)構(gòu)Tab.1 Gill filaments of Juvenile hybrid sturgeon in microscope of control group and treatment group

2.2 測序數(shù)據(jù)過濾結(jié)果及組裝

對鰓的6個(gè)樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，質(zhì)控后共獲得有效堿基(CleanData)為40.22 G，各樣品的有效數(shù)據(jù)量分布為 5.78～7.31 G，去除接頭序列、低質(zhì)量序列后，各樣品Q30 為96.11%～96.23%，GC 含量為45.65%～74.29%(表2)。結(jié)果表明，該測序質(zhì)量可靠，構(gòu)建文庫可用于后續(xù)分析。使用 Trinity軟件paired-end 的拼接方法，根據(jù)序列相似性以及長度，挑選出最長的一條作為Unigene，獲得去冗余的Unigene共 80 422條，總長度為88 658 788 bp，N50為1759 bp，最長序列為32 175 bp，最短序列為301 bp。

表2 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表Tab.2 Summary of RNA-seq dates

2.3 差異表達(dá)基因聚類分析

差異表達(dá)基因的聚類結(jié)果顯示，對照組與脅迫組有1 507個(gè)基因差異表達(dá)，其中694個(gè)基因差異表達(dá)上調(diào)，813個(gè)基因差異表達(dá)下調(diào)(圖2)。此外，差異表達(dá)基因分別聚類，同組樣本的不同重復(fù)表達(dá)相似(圖3)。

圖2 對照組與脅迫組差異表達(dá)基因火山圖Fig.2 Volcano map of DEGs between control group and stress group

圖3 對照組與脅迫組差異表達(dá)基因熱圖Fig.3 Heat map of DEGs between control group and stress groupC1、C2與C3為對照組；T1、T2與T3為脅迫組。

2.4 GO功能分類

將Unigene比對到GO數(shù)據(jù)庫進(jìn)行功能分類，結(jié)果顯示，差異表達(dá)基因?yàn)?71個(gè)，其中87個(gè)基因上調(diào)，284個(gè)基因下調(diào)，富集到的生物過程包括鈉離子跨膜輸出(sodium ion export across plasma membrane)、細(xì)胞鉀離子穩(wěn)態(tài)(cellular potassium ionhomeostasis)和精氨酸代謝過程(arginine metabolic process)等，差異基因均顯著表達(dá)下調(diào)(<0.05)；富集到的細(xì)胞組分包括頂端質(zhì)膜(apical plasma membrane)、微絨毛(microvillus)和鈉/鉀交換ATP酶復(fù)合體(sodium:potassium-exchanging ATPase complex)等，其中，頂端質(zhì)膜組分與鈉/鉀交換ATP酶復(fù)合體組分中的差異表達(dá)基因均顯著下調(diào)，微絨毛組分中包括7個(gè)基因顯著下調(diào)表達(dá)與1個(gè)基因顯著上調(diào)表達(dá)。富集到的分子功能包括鈉/鉀交換ATP酶活性(sodium:potassium-exchanging ATPase activity)、精氨酸酶活性(arginase activity)和硫轉(zhuǎn)移酶活性(sulfotransferase activity)等，其中鈉/鉀交換ATP酶活性功能與精氨酸酶活性功能的差異表達(dá)基因均顯著下調(diào)，硫轉(zhuǎn)移酶活性功能中包括4個(gè)基因顯著下調(diào)表達(dá)與1個(gè)基因顯著上調(diào)表達(dá)(圖4)。

圖4 Top 30差異表達(dá)基因GO富集結(jié)果Fig.4 GO enrichment of top 30 of DEGs 顯著性水平為P<0.05。

2.5 KEGG通路富集及主效應(yīng)表達(dá)通路分析

將Unigene比對KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行富集，結(jié)果顯示，在主要富集通路中，近曲小管碳酸氫鹽再生(ko04964:Proximal tubule bicarbonate reclamation)中8個(gè)基因顯著表達(dá)下調(diào)；礦物吸收(ko04978:Mineral absorption)中7個(gè)基因顯著表達(dá)下調(diào)；胃酸分泌(ko04971：Gastric acid secretion)中10個(gè)基因顯著表達(dá)下調(diào)。篩選21個(gè)顯著富集的KEGG代謝通路，構(gòu)建代謝通路互作網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果顯示，近曲小管碳酸氫鹽再生途徑為主效應(yīng)途徑(圖5)。

圖5 KEGG顯著富集通路相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.5 Network of significantly enriched pathways in KEGG紅色代表顯著上調(diào)通路，綠色代表顯著下調(diào)通路(P<0.05)。大圓形圖標(biāo)代表主效應(yīng)途徑，小圓形圖標(biāo)代表次效應(yīng)途徑。

參考KOG數(shù)據(jù)庫，近曲小管碳酸氫鹽再生代謝通路的主要差異表達(dá)基因?yàn)?、1、1和，分別參與合成鈉/氫交換蛋白3型(NHE3)、鈉/鉀ATP酶α亞基(NKAα)、鈉/鉀ATP酶β亞基(NKAβ)和谷氨酸脫氫酶(GLDH)等(表3)。

表3 近曲小管碳酸氫鹽再生通路(ko0496)差異表達(dá)基因及編碼蛋白Tab.3 The DEGs and protein of Proximal tubule bicarbonate reclamation pathway(ko0496)

3 討論

研究表明，低堿條件下，魚類可以改變氯細(xì)胞等鰓上細(xì)胞的形態(tài)來適應(yīng)水質(zhì)的變化，但隨著堿度上升，魚類在堿的刺激下會分泌大量粘液，粘液凝結(jié)于鰓絲表面，會直接抑制氯細(xì)胞的生理功能，當(dāng)鹽堿濃度超過魚類的承受力時(shí)，魚類的鰓組織結(jié)構(gòu)會造成器質(zhì)性損傷，甚至威脅到魚類的生存。本研究中，堿脅迫下“鱘龍1號”的鰓組織已經(jīng)發(fā)生了明顯的病理損傷，鰓小片發(fā)生卷曲、融合，鰓上細(xì)胞發(fā)生脫落、游離，該結(jié)果與黑龍江泥鰍()、大鱗副泥鰍()、和奧尼羅非魚和黃河鯉()等相似，表明堿度為14.4 ～16.67 mmol/L的條件下，“鱘龍1號”的滲透壓平衡與呼吸功能已經(jīng)受到影響。

進(jìn)行GO富集與KEGG富集，并構(gòu)建基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，差異表達(dá)基因主要富集到鈉離子跨膜輸出與細(xì)胞鉀離子穩(wěn)態(tài)等生物進(jìn)程，以及礦物質(zhì)吸收與近曲小管碳酸氫鹽再生等代謝通路，其中3、1、1與等基因主要參與了調(diào)控。NHE3是鈉/氫交換蛋白家族的第三個(gè)亞型，由3編碼，主要存在于上皮細(xì)胞基底膜，可對細(xì)胞內(nèi)外H和Na進(jìn)行電中性跨膜交換，對魚類適應(yīng)非等滲環(huán)境有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，NHE3參與尿鈉的重吸收，敲除小鼠()的3后，小鼠對碳酸氫鈉的重吸收減少了50%～60%。本研究中3基因響應(yīng)表達(dá)下調(diào)，推測“鱘龍1號”采取減少重吸收的策略來降低血液離子濃度，從而維持滲透壓平衡，該結(jié)果符合魚類在高滲水環(huán)境的滲透調(diào)節(jié)規(guī)律，但關(guān)于堿脅迫下“鱘龍1號”的血清離子變化模式仍有待研究。NKA是動(dòng)物細(xì)胞膜上普遍存在的跨膜結(jié)合蛋白，主要由α與β亞基構(gòu)成，分別由1與1基因編碼，可通過亞基的構(gòu)象變化，泵入3個(gè)Na同時(shí)釋放2個(gè)K，從而參與調(diào)節(jié)靜息電位與滲透壓的平衡。研究發(fā)現(xiàn)，尼羅羅非魚()的基因響應(yīng)堿度變化，堿脅迫下，尼羅羅非魚的血清離子濃度迅速升高，基因的mRNA表達(dá)水平隨離子濃度而產(chǎn)生變化，隨著離子濃度下降，的 mRNA表達(dá)水平又趨于恢復(fù)。大鱗鲃()在高鹽堿下，由于堿度高于耐受范圍，離子轉(zhuǎn)運(yùn)體系負(fù)荷，NKA酶活力降低甚至低于正常水平。 本研究1與1基因均顯著表達(dá)下調(diào)，表明堿度已高于耐受范圍，離子轉(zhuǎn)運(yùn)功能下降，可能與鰓損傷有關(guān)。 GLDH是一種重要的線粒體酶，由基因編碼，可催化谷氨酸的氧化分解，生成產(chǎn)物α-酮戊二酸與氨，促進(jìn)魚類的排氨作用。本研究中，基因顯著下調(diào)表達(dá)，表明鰓損傷已導(dǎo)致排氨功能下降，排泄功能也受到了影響。綜上，堿脅迫下，“鱘龍1號”的鰓組織發(fā)生了病理損傷，鰓上細(xì)胞的礦物質(zhì)重吸收、鈉/鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)與排氨等功能下降。