楊合霖,張 穎,王念民,徐 偉,呂偉華
(1.上海海洋大學(xué),農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 201306;2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所,黑龍江省冷水性魚類種質(zhì)資源及增養(yǎng)殖重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室,哈爾濱150070)
鱘隸屬于硬骨魚綱(Osteichthyes)鱘形目(Acipenseriformes),是現(xiàn)存起源最早的脊椎動(dòng)物之一,具有極高的科研價(jià)值。鱘魚籽營養(yǎng)豐富,制成的魚子醬價(jià)格昂貴,素有“黑色黃金”之稱。中國的鱘魚產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅猛,鱘魚養(yǎng)殖產(chǎn)量和魚子醬產(chǎn)量世界領(lǐng)先,20世紀(jì)90年代初至今,中國的鱘魚養(yǎng)殖品種不斷增多,其中 “鱘龍1號”(♀×)為中國第一個(gè)自主選育獲得的雜交鱘新品種,相比其他鱘科魚類,該品種兼具個(gè)體大、生長快與性腺發(fā)育早等優(yōu)勢。
“鱘龍1號”幼魚(簡稱雜交鱘)采集于中國水產(chǎn)科學(xué)研究院北京房山鱘魚工程繁育中心,并于黑龍江水產(chǎn)研究所呼蘭基地進(jìn)行試驗(yàn),試驗(yàn)魚約為30日齡,體長為(133.17±16.75) mm,體重為(12.43±3.99) g。本試驗(yàn)設(shè)置了1個(gè)對照組(C)與1個(gè)脅迫組(T),每組設(shè)三個(gè)平行。對照組為自來水,實(shí)際測定堿度為3.13 ~ 3.20 mmol/L,脅迫組為自來水添加99%純度的食用小蘇打(哈爾濱市呼蘭區(qū)三鑫制堿廠)的穩(wěn)定溶解液,實(shí)際測定堿度為14.4 ~16.67 mmol/L,每個(gè)養(yǎng)殖缸養(yǎng)殖15尾,共90尾。
試驗(yàn)前于自來水中馴養(yǎng)2周,養(yǎng)殖水溫為17~21 ℃,溶氧量大于6 mg/L,日投喂2次(天邦鱘魚顆粒配合飼料),日投餌率為1%~1.5%。試驗(yàn)開始后每2日更換相同堿度新水,持續(xù)增氧曝氣,并保持水質(zhì)清潔。于試驗(yàn)第30天,采集鰓組織,保存于Bouin′s固定液,并于24 h后轉(zhuǎn)入70%酒精中保存,每個(gè)平行各取3尾備用。另取鰓裝入凍存管后用液氮臨時(shí)保存,于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?,每個(gè)平行各取5尾混合為一個(gè)重復(fù),每組共采3個(gè)重復(fù)。
1.2.1 鰓的石蠟切片制作與觀察
將鰓修成小塊(3 mm×3 mm×3 mm),分別置于70%、80%、90%、95%和100%(2次)的酒精中進(jìn)行梯度脫水,并置于二甲苯 ∶酒精(1 ∶1)、二甲苯(2次)中梯度脫去酒精,再置于二甲苯 ∶石蠟(1 ∶1)、軟蠟和硬蠟除去二甲苯,進(jìn)行石蠟包埋;用MICROM HM 200切片機(jī)切片,切片厚度為4 μm;將獲得的切片置于二甲苯、二甲苯 ∶酒精(1 ∶1)、100%酒精、90%酒精、80%酒精和清水,逐步除去組織內(nèi)的石蠟、二甲苯和酒精,并進(jìn)行蘇木精·伊紅(H·E)染色;染色后的切片逐步置于70%酒精、80%酒精、90%酒精、100%酒精、二甲苯 ∶酒精(1∶1)、二甲苯(2次);采用中性樹膠封片,并用Leica DMI 6000B拍照觀察。
1.2.2 RNA提取及RNA-seq測序
利用 RNA easy Lipid Tissue Mini Kit(QIAGEN,Germany)提取總RNA。利用nanodrop 8000儀器檢測各RNA樣品的純度和濃度,并通過瓊脂糖凝膠電泳極檢測RNA的完整性。RNA-seq測序委托上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司(上海)完成,利用 Illumina HiseqTM 2500平臺進(jìn)行高通量測序。
1.2.3 測序數(shù)據(jù)分析
測序數(shù)據(jù)去除接頭、重復(fù)及低質(zhì)量數(shù)據(jù)后,利用Trinity軟件將數(shù)據(jù)全部混合拼接獲得Unigene,并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄注釋及表達(dá)量的計(jì)算。利用 DESeq 進(jìn)行基因的差異表達(dá)分析,并進(jìn)行聚類分析。使用DEseq2 方法進(jìn)行差異基因檢測,<0.05視為差異表達(dá)。利用GO數(shù)據(jù)庫對差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋和富集,運(yùn)用KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行通路分析,F(xiàn)DR≤0.01和Fold Change≥2視為顯著富集。使用Cytoscape軟件構(gòu)建代謝通路互作網(wǎng)絡(luò)。
1.2.4 數(shù)據(jù)處理
數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示。為保證試驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性,組織顯微結(jié)構(gòu)設(shè)3個(gè)生物重復(fù),轉(zhuǎn)錄組測序設(shè)3個(gè)生物重復(fù),5尾魚混為一個(gè)重復(fù)。用SPSS 22進(jìn)行單因素方差分析和Duncan多重比較,顯著性水平設(shè)為<0.05。
鰓組織切片觀察顯示,對照組的鰓小片為扁平囊狀,細(xì)長,呈梳狀排列,鰓小片由單層上皮細(xì)胞、毛細(xì)血管和柱狀支持細(xì)胞組成,上皮細(xì)胞呈扁平狀,核梭形,柱狀支持細(xì)胞核大而圓,與基膜相連,鰓絲及鰓小片中含有氯細(xì)胞,少量分布(圖1-a)。與對照組相比,脅迫組的鰓絲與鰓小片發(fā)生腫脹,鰓絲血管壁上有大量扁平細(xì)胞與柱細(xì)胞增生,泌氯細(xì)胞數(shù)量增加,鰓小片發(fā)生卷曲、融合,鰓上細(xì)胞脫落、游離(圖1-b)。顯微結(jié)構(gòu)測量結(jié)果顯示,脅迫組的氯細(xì)胞略有膨大,與對照組差異不顯著,鰓小片寬度和鰓小片間距顯著增大,差異顯著(<0.05)(表1)。
圖1 雜交鱘幼魚對照組與脅迫組的鰓絲組織切片(H·E)Fig.1 Tissue section of gill filament of juvenile hybrid sturgeon of control group and stress group(H·E)“a”為對照組;“b”為脅迫組;BC: 血細(xì)胞;CSC:氯細(xì)胞;GL: 鰓小片;PC: 柱細(xì)胞;PVC: 扁平上皮細(xì)胞
表1 對照組和脅迫組雜交鱘幼魚鰓絲的顯微結(jié)構(gòu)Tab.1 Gill filaments of Juvenile hybrid sturgeon in microscope of control group and treatment group
對鰓的6個(gè)樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,質(zhì)控后共獲得有效堿基(CleanData)為40.22 G,各樣品的有效數(shù)據(jù)量分布為 5.78~7.31 G,去除接頭序列、低質(zhì)量序列后,各樣品Q30 為96.11%~96.23%,GC 含量為45.65%~74.29%(表2)。結(jié)果表明,該測序質(zhì)量可靠,構(gòu)建文庫可用于后續(xù)分析。使用 Trinity軟件paired-end 的拼接方法,根據(jù)序列相似性以及長度,挑選出最長的一條作為Unigene,獲得去冗余的Unigene共 80 422條,總長度為88 658 788 bp,N50為1759 bp,最長序列為32 175 bp,最短序列為301 bp。
表2 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表Tab.2 Summary of RNA-seq dates
差異表達(dá)基因的聚類結(jié)果顯示,對照組與脅迫組有1 507個(gè)基因差異表達(dá),其中694個(gè)基因差異表達(dá)上調(diào),813個(gè)基因差異表達(dá)下調(diào)(圖2)。此外,差異表達(dá)基因分別聚類,同組樣本的不同重復(fù)表達(dá)相似(圖3)。
圖2 對照組與脅迫組差異表達(dá)基因火山圖Fig.2 Volcano map of DEGs between control group and stress group
圖3 對照組與脅迫組差異表達(dá)基因熱圖Fig.3 Heat map of DEGs between control group and stress groupC1、C2與C3為對照組;T1、T2與T3為脅迫組。
將Unigene比對到GO數(shù)據(jù)庫進(jìn)行功能分類,結(jié)果顯示,差異表達(dá)基因?yàn)?71個(gè),其中87個(gè)基因上調(diào),284個(gè)基因下調(diào),富集到的生物過程包括鈉離子跨膜輸出(sodium ion export across plasma membrane)、細(xì)胞鉀離子穩(wěn)態(tài)(cellular potassium ionhomeostasis)和精氨酸代謝過程(arginine metabolic process)等,差異基因均顯著表達(dá)下調(diào)(<0.05);富集到的細(xì)胞組分包括頂端質(zhì)膜(apical plasma membrane)、微絨毛(microvillus)和鈉/鉀交換ATP酶復(fù)合體(sodium:potassium-exchanging ATPase complex)等,其中,頂端質(zhì)膜組分與鈉/鉀交換ATP酶復(fù)合體組分中的差異表達(dá)基因均顯著下調(diào),微絨毛組分中包括7個(gè)基因顯著下調(diào)表達(dá)與1個(gè)基因顯著上調(diào)表達(dá)。富集到的分子功能包括鈉/鉀交換ATP酶活性(sodium:potassium-exchanging ATPase activity)、精氨酸酶活性(arginase activity)和硫轉(zhuǎn)移酶活性(sulfotransferase activity)等,其中鈉/鉀交換ATP酶活性功能與精氨酸酶活性功能的差異表達(dá)基因均顯著下調(diào),硫轉(zhuǎn)移酶活性功能中包括4個(gè)基因顯著下調(diào)表達(dá)與1個(gè)基因顯著上調(diào)表達(dá)(圖4)。
圖4 Top 30差異表達(dá)基因GO富集結(jié)果Fig.4 GO enrichment of top 30 of DEGs 顯著性水平為P<0.05。
將Unigene比對KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行富集,結(jié)果顯示,在主要富集通路中,近曲小管碳酸氫鹽再生(ko04964:Proximal tubule bicarbonate reclamation)中8個(gè)基因顯著表達(dá)下調(diào);礦物吸收(ko04978:Mineral absorption)中7個(gè)基因顯著表達(dá)下調(diào);胃酸分泌(ko04971:Gastric acid secretion)中10個(gè)基因顯著表達(dá)下調(diào)。篩選21個(gè)顯著富集的KEGG代謝通路,構(gòu)建代謝通路互作網(wǎng)絡(luò),結(jié)果顯示,近曲小管碳酸氫鹽再生途徑為主效應(yīng)途徑(圖5)。
圖5 KEGG顯著富集通路相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.5 Network of significantly enriched pathways in KEGG紅色代表顯著上調(diào)通路,綠色代表顯著下調(diào)通路(P<0.05)。大圓形圖標(biāo)代表主效應(yīng)途徑,小圓形圖標(biāo)代表次效應(yīng)途徑。
參考KOG數(shù)據(jù)庫,近曲小管碳酸氫鹽再生代謝通路的主要差異表達(dá)基因?yàn)?、1、1和,分別參與合成鈉/氫交換蛋白3型(NHE3)、鈉/鉀ATP酶α亞基(NKAα)、鈉/鉀ATP酶β亞基(NKAβ)和谷氨酸脫氫酶(GLDH)等(表3)。
表3 近曲小管碳酸氫鹽再生通路(ko0496)差異表達(dá)基因及編碼蛋白Tab.3 The DEGs and protein of Proximal tubule bicarbonate reclamation pathway(ko0496)
研究表明,低堿條件下,魚類可以改變氯細(xì)胞等鰓上細(xì)胞的形態(tài)來適應(yīng)水質(zhì)的變化,但隨著堿度上升,魚類在堿的刺激下會分泌大量粘液,粘液凝結(jié)于鰓絲表面,會直接抑制氯細(xì)胞的生理功能,當(dāng)鹽堿濃度超過魚類的承受力時(shí),魚類的鰓組織結(jié)構(gòu)會造成器質(zhì)性損傷,甚至威脅到魚類的生存。本研究中,堿脅迫下“鱘龍1號”的鰓組織已經(jīng)發(fā)生了明顯的病理損傷,鰓小片發(fā)生卷曲、融合,鰓上細(xì)胞發(fā)生脫落、游離,該結(jié)果與黑龍江泥鰍()、大鱗副泥鰍()、和奧尼羅非魚和黃河鯉()等相似,表明堿度為14.4 ~16.67 mmol/L的條件下,“鱘龍1號”的滲透壓平衡與呼吸功能已經(jīng)受到影響。
進(jìn)行GO富集與KEGG富集,并構(gòu)建基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò),差異表達(dá)基因主要富集到鈉離子跨膜輸出與細(xì)胞鉀離子穩(wěn)態(tài)等生物進(jìn)程,以及礦物質(zhì)吸收與近曲小管碳酸氫鹽再生等代謝通路,其中3、1、1與等基因主要參與了調(diào)控。NHE3是鈉/氫交換蛋白家族的第三個(gè)亞型,由3編碼,主要存在于上皮細(xì)胞基底膜,可對細(xì)胞內(nèi)外H和Na進(jìn)行電中性跨膜交換,對魚類適應(yīng)非等滲環(huán)境有重要作用。研究發(fā)現(xiàn),NHE3參與尿鈉的重吸收,敲除小鼠()的3后,小鼠對碳酸氫鈉的重吸收減少了50%~60%。本研究中3基因響應(yīng)表達(dá)下調(diào),推測“鱘龍1號”采取減少重吸收的策略來降低血液離子濃度,從而維持滲透壓平衡,該結(jié)果符合魚類在高滲水環(huán)境的滲透調(diào)節(jié)規(guī)律,但關(guān)于堿脅迫下“鱘龍1號”的血清離子變化模式仍有待研究。NKA是動(dòng)物細(xì)胞膜上普遍存在的跨膜結(jié)合蛋白,主要由α與β亞基構(gòu)成,分別由1與1基因編碼,可通過亞基的構(gòu)象變化,泵入3個(gè)Na同時(shí)釋放2個(gè)K,從而參與調(diào)節(jié)靜息電位與滲透壓的平衡。研究發(fā)現(xiàn),尼羅羅非魚()的基因響應(yīng)堿度變化,堿脅迫下,尼羅羅非魚的血清離子濃度迅速升高,基因的mRNA表達(dá)水平隨離子濃度而產(chǎn)生變化,隨著離子濃度下降,的 mRNA表達(dá)水平又趨于恢復(fù)。大鱗鲃()在高鹽堿下,由于堿度高于耐受范圍,離子轉(zhuǎn)運(yùn)體系負(fù)荷,NKA酶活力降低甚至低于正常水平。 本研究1與1基因均顯著表達(dá)下調(diào),表明堿度已高于耐受范圍,離子轉(zhuǎn)運(yùn)功能下降,可能與鰓損傷有關(guān)。 GLDH是一種重要的線粒體酶,由基因編碼,可催化谷氨酸的氧化分解,生成產(chǎn)物α-酮戊二酸與氨,促進(jìn)魚類的排氨作用。本研究中,基因顯著下調(diào)表達(dá),表明鰓損傷已導(dǎo)致排氨功能下降,排泄功能也受到了影響。綜上,堿脅迫下,“鱘龍1號”的鰓組織發(fā)生了病理損傷,鰓上細(xì)胞的礦物質(zhì)重吸收、鈉/鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)與排氨等功能下降。