王葆生， 龐 杰， 廉 勇， 劉曉蕊， 扈 順， 劉湘萍

(內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，內(nèi)蒙古呼和浩特 010031)

(nonexpressor of pathogenesis-related genes 1)最初是在擬南芥()的突變體中發(fā)現(xiàn)的，因該突變基因使得系統(tǒng)獲得性抗性標(biāo)志基因PR的表達(dá)量很低甚至不表達(dá)而得名。隨著擬南芥全基因組測序的完成，在擬南芥中又發(fā)現(xiàn)5個like基因，分別為、、、和。擬南芥NPR1-like家族成員在進(jìn)化上可分為3個亞組，亞組Ⅰ中的AtNPR1和AtNPR2是擬南芥水楊酸(SA)的受體蛋白，在水楊酸介導(dǎo)的植物免疫反應(yīng)中發(fā)揮正調(diào)控作用，同時也是低溫調(diào)控的重要因子；在亞組Ⅱ中，AtNPR3和AtNPR4也都是水楊酸的受體蛋白，在系統(tǒng)抗性(SAR)中發(fā)揮負(fù)調(diào)節(jié)作用；AtNPR5和AtNPR6在亞組Ⅲ中，蛋白C端不含NPR1_like_C結(jié)構(gòu)域，主要在擬南芥葉片和花生長發(fā)育方面發(fā)揮重要作用。近年來，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，在鱷梨、油菜、棉花和小麥等植物中也進(jìn)行了like基因家族的鑒定。

芫荽(L.)，傘形科芫荽屬草本植物，別名胡荽、香荽，具有強(qiáng)烈的特殊香氣，是常見的調(diào)味蔬菜，別稱香菜。芫荽原產(chǎn)于歐洲地中海地區(qū)，漢代時引入我國，我國大部分省份均有栽培。芫荽富含維生素C、胡蘿卜素、維生素B和B。芫荽中維生素C的含量很高，攝入7～10 g/d的芫荽葉子就可以滿足人體所需。芫荽葉片中含有的胡蘿卜素濃度比番茄、豆類和黃瓜高10倍以上。芫荽同時還具有藥用價值，根、莖、葉及種子均可入藥，在中東和歐洲被用于預(yù)防失眠、焦慮，治療糖尿病，輔助治療風(fēng)濕病等，芫荽還具有抑菌、抗氧化、抗炎及抗糖尿病功效，對緩解某些食物中毒也有一定的作用。此外，芫荽的莖、葉、根和果實全株都可用于提取精油，芫荽精油可應(yīng)用于食品、化工以及醫(yī)藥等行業(yè)。

本試驗依據(jù)已發(fā)表的芫荽全基因組測序數(shù)據(jù)，對芫荽like基因家族成員進(jìn)行鑒定和分析，以期為進(jìn)一步開展對傘形科其他植物該基因家族的功能和進(jìn)化研究提供參考，同時為基因工程手段調(diào)控傘形科蔬菜生長發(fā)育和改良抗逆性狀奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗的研究對象是芫荽，芫荽的全基因組數(shù)據(jù)文件來源于Coriander Genome Database(http：//cgdb.bio2db.com/)；擬南芥基因組數(shù)據(jù)文件來源于TAIR 10(https：//www.arabidopsis.org/)；NPR1-like基因蛋白序列下載自NCBI(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)，擬南芥AtNPR1～6的登錄號分別是At1g64280、At4g26120、At5g45110、At4g19660、At2g41370、At3g57130，水稻()OsNPR1～3和OsNPR5的登錄號分別是ABE11614、ABE11615、ABE11618、ABE11622，大麥()HvNPR1的登錄號是CAJ19095，二穗短柄草()BdNPR1的登錄號是XP_003564857，玉米()ZmNPR1的登錄號是NP_001354806，小麥()wNPR1的登錄號是AGH18701，香蕉()MNPR1A/B的登錄號分別是ABI93182、ABL63913，唐菖蒲()GhNPR1的登錄號是AIM54370，百合()LhSorNPR1的登錄號是APG55777，芥菜()BjNPR1的登錄號是ABC94642，桑樹()MuNPR1/4的登錄號分別是AGI03909、AGL61506，煙草()NtNPR1的登錄號是AAM62410，棉花()GhNPR1的登錄號是ABV68572，大豆()GmNPR1-1/1-2的登錄號分別是ACJ45013、ACJ45015，海棠()MpNPR1的登錄號是ACC77697，葡萄()VvNPR1.1/1.2的登錄號是XP_002281475、XP_003633057，番茄()LeNPR1的登錄號是APY24056，可可樹()TcNPR1/3的登錄號分別是ADI24348、AGC39275，番木瓜()CpNPR1的登錄號是AAS55117，甘薯()IbNPR1的登錄號是ABM64782，楊樹()PtNPR1.1的登錄號是AEY99652，沙梨()PpNPR1-1的登錄號是ABK62792，鱷梨()PaNPR1～5的登錄號分別是AKH61407、AKH61408、AKH61409、AKH61410、AKH61411。

1.2 芫荽NPR1-like家族的鑒定

鑒定芫荽基因組中l(wèi)ike基因家族成員采用BLASTp和HMMER相結(jié)合的方式進(jìn)行搜索。首先，從Pfam(http：//pfam.xfam.org/)數(shù)據(jù)庫中下載基因保守結(jié)構(gòu)域模型PF12313，利用HMMsearch3.1(http：//hmmer.org/)程序?qū)据吹鞍踪|(zhì)數(shù)據(jù)進(jìn)行搜索，獲得候選相似蛋白序列；利用TBtools軟件，以AtNPR1～6蛋白序列為查詢序列對芫荽全基因組蛋白數(shù)據(jù)進(jìn)行本地BLASTp搜索(-value設(shè)置為1×10)，獲得候選蛋白序列。將2種檢索方法獲得的蛋白序列合并，將去除冗余的序列提交到SMART(http：//smart.embl-heidelberg.de)和PROSITE(http：//us.expasy.org/prosite)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)分析，剔除不含完整的N端BTB/POZ結(jié)構(gòu)域和中間區(qū)域ANK錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域的序列，剩余序列即為芫荽基因組中的like基因家族成員。

1.3 生物信息學(xué)分析

利用在線工具ExPASy(http：//web.expasy.org/compute_pi/)預(yù)測芫荽NPR1-like蛋白的等電點和分子量，利用TBtools軟件分析基因結(jié)構(gòu)(包含內(nèi)含子和UTR)，利用MEME在線工具(http：//meme.nbcr.net/meme/)分析保守基序。利用ClustalX進(jìn)行多重序列比對。利用Tbtools工具，從芫荽基因組中提取like基因起始密碼子ATG上游2 000 bp的核酸序列，用在線分析工具PlantCare(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)對序列的順式作用元件進(jìn)行分析預(yù)測，預(yù)測結(jié)果用TBtools進(jìn)行展示。

1.4 基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

利用MEGA 7.0軟件中的Clustal W程序?qū)据春推渌锓N的NPR1-like蛋白序列進(jìn)行多重序列比對(空位開放罰分設(shè)置為10，空位延伸罰分設(shè)置為0.2)，利用比對結(jié)果構(gòu)建進(jìn)化樹。進(jìn)化樹構(gòu)建選用鄰接法(neighbor joining，NJ)，檢驗方法選用步長檢驗法(bootstrp method)，檢驗次數(shù)設(shè)置為 1 000 次，計算模型選用距離模型(p-distance)，空位處理模式選用成對刪除(pairwise deletion)。

1.5 表達(dá)模式分析

從CGDB(http：//cgdb.bio2db.com/)下載芫荽like家族成員基因在芫荽根、莖、葉、花和播種后30、60、90 d的表達(dá)數(shù)據(jù)，將FPKM值取對數(shù)值后利用TBtools軟件繪制熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 芫荽NPR1-like基因家族鑒定與分析

將BLASTp和HMMER搜索的結(jié)果去除冗余和不含保守結(jié)構(gòu)的序列，最終在芫荽基因組中鑒定得到7個like基因家族成員，參考擬南芥同源基因，根據(jù)蛋白序列相似性及系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分別將這7個芫荽like基因命名為～?！岸ㄎ辉谲据吹腃hr03、Chr04、Chr06、Chr08和Chr09染色體上，而和的位置未知。這7個like基因的開放閱讀框長度為1 089～1 788 bp，編碼的氨基酸序列長度為362～595個，相應(yīng)的蛋白分子量為39.52～66.24 ku，等電點在5.26～8.56之間(表1)。

表1 芫荽NPR1-like家族基因信息

2.2 多重序列比對及系統(tǒng)發(fā)育分析

為研究like基因家族同源基因之間的親緣關(guān)系和進(jìn)化模式，利用7個芫荽、6個擬南芥、4個、5個鱷梨及已從其他物種中通過克隆得到的like基因蛋白序列構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹。由圖1可知，芫荽like基因家族明顯地分成3個進(jìn)化分支，分別是Clade Ⅰ、Clade Ⅱ和Clade Ⅲ。其中，Clade I(AtNPR1/2亞家族)中包含、、、、等，Clade Ⅱ(AtNPR3/4亞家族)中包含、、和等，Clade Ⅲ(AtNPR5/6亞家族)中包含、和。系統(tǒng)發(fā)育分組可為理解like基因家族的功能多樣性提供參考。

結(jié)合多重序列比對(圖2)和SMART在線分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，7個都存在BTB/POZ和錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域，這2個結(jié)構(gòu)域在芫荽和擬南芥中較為保守，并且在每個亞組的組內(nèi)成員之間保守程度更高。此外，Clade Ⅰ和Clade Ⅱ亞家族的～的C端含有NPR1_like_C-terminal結(jié)構(gòu)域，而～不含該結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域包含核定位信號NLS。序列比較分析結(jié)果顯示，在至的蛋白序列中，等位基因突變體的氨基酸序列突變位點(His334Tyr)、(Cys150Tyr)和(His300Tyr)高度保守；而(Arg432Lys)突變位點只在Clade Ⅰ和Clade Ⅱ亞家族的～中保守。此外，在寡聚物-單體相互轉(zhuǎn)變過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用的3個半胱氨酸殘基(Cys82、Cys155和Cys216)在7個CsNPRs中完全保守。

2.3 芫荽NPR1-like家族成員基因結(jié)構(gòu)分析

利用在線分析工具M(jìn)EME對芫荽和擬南芥NPR1-like蛋白序列進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析，在預(yù)測出的10個保守基序中，motif1、motif2和motif3為BTB/POZ結(jié)構(gòu)域的保守基序，motif5和motif6為Ankyrinrepeats結(jié)構(gòu)域保守基序，motif8、motif9和motif10為NPR1_like_C保守基序。在CladeⅠ和Clade Ⅱ中，除CsNPR3只含有motif2～8之外，其余芫荽和擬南芥的NPRs序列中都含有motif1～10；而在CladeⅢ中，因C端缺少NPR_Like_C結(jié)構(gòu)域，除CsNPR7只含有motif1～5、缺少motif6～10之外，其余芫荽和擬南芥的NPRs序列中只含有motif1～7，缺少motif8～10(圖3-A、圖3-B)。

根據(jù)基因結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，在Clade I和Clade Ⅱ中，除外，芫荽和擬南芥-like家族基因序列都含有4個外顯子和3個內(nèi)含子，且芫荽的內(nèi)含子長度明顯大于擬南芥；在Clade Ⅲ中，所有成員序列中都含有2個外顯子和1個內(nèi)含子，且外顯子和內(nèi)含子的大小基本相同(圖3-C)。

由此可見，-like家族成員3個亞族在結(jié)構(gòu)域和基因結(jié)構(gòu)上都具有相似的特點，說明它們在進(jìn)化上存在相當(dāng)?shù)谋Ｊ匦浴?/p>

2.4 芫荽NPR1-like基因啟動子元件分析

通過分析芫荽like基因上游2 000 bp的啟動子區(qū)域進(jìn)行順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)，所有l(wèi)ike基因都含有基本的CAAT-box和TATA-box保守元件。7個啟動子區(qū)域還鑒定出TCT-motif、TCCC-motif、Sp1、GT1-motif、GA-motif等光調(diào)控元件，啟動子區(qū)域含有的數(shù)量最多，達(dá)到22個(圖4)。啟動子區(qū)域還鑒定出茉莉酸甲酯響應(yīng)元件TGACG-motif和 CGTCA-motif、水楊酸響應(yīng)元件as-1和TCA、脫落酸響應(yīng)元件ABRE、赤霉素響應(yīng)元件P-box、生長素響應(yīng)元件TGA和乙烯響應(yīng)元件ERE等植物激素響應(yīng)元件，其中在7個啟動子區(qū)域都鑒定到水楊酸響應(yīng)元件，數(shù)量在1～5個不等，其余激素響應(yīng)元件并未出現(xiàn)在所有7個中，、啟動子區(qū)域中分別含有8、4個茉莉酸甲酯響應(yīng)元件，和啟動子區(qū)域都含有6個乙烯響應(yīng)元件，啟動子區(qū)域含有4個脫落酸響應(yīng)元件。此外，啟動子區(qū)域還鑒定出防御和脅迫響應(yīng)元件TC-rich和W-box、低溫響應(yīng)元件LTR、脅迫響應(yīng)元件STRE、MYBr和MYCr、干旱響應(yīng)元件MBS、脫水響應(yīng)元件DRE、厭氧誘導(dǎo)元件ARE、機(jī)械損傷響應(yīng)元件WUN等逆境脅迫相關(guān)的響應(yīng)元件，且總體數(shù)量較多。此外，在個別中還鑒定出數(shù)量不多的植物生長發(fā)育調(diào)控相關(guān)的分生組織表達(dá)與激活元件CAT-box和玉米醇溶蛋白代謝調(diào)控元件O2-site。

以上分析結(jié)果表明，芫荽like基因家族成員可能在植物激素響應(yīng)、逆境脅迫和植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。

2.5 芫荽NPR1-like基因表達(dá)模式分析

為探討基因在芫荽生長發(fā)育過程中的作用，對芫荽根、莖、葉、花以及生長30、60、90 d的表達(dá)模式進(jìn)行分析。結(jié)果表明，～在各組織中都有表達(dá)，其中和在4種組織中的表達(dá)量均較高；和在根和葉中表達(dá)量較高，莖中其次，花中的表達(dá)量最低；和在根中的表達(dá)量較高，其余組織中表達(dá)量很低；在4種組織中的表達(dá)量都很低(圖5-B)。在芫荽生長過程中，和的表達(dá)量最高，其次為和，而和的表達(dá)量很低，基本沒有表達(dá)。、、在3個生長時期的表達(dá)量呈現(xiàn)出輕微的先上升后下降趨勢，在生長后60 d的表達(dá)量最高；而的表達(dá)量持續(xù)上升，在生長后90 d的表達(dá)量最高(圖5-A)。上述結(jié)果可能暗示基因家族成員在調(diào)控芫荽不同組織和不同時期發(fā)育過程中發(fā)揮了不同作用。

3 討論與結(jié)論

like基因家族已經(jīng)在多種單子葉和雙子葉植物中被鑒定和研究，研究方向多集中在和參與植物應(yīng)對生物及非生物脅迫的抗性響應(yīng)上，它們被認(rèn)為是SA受體，共同調(diào)控植物免疫。正向調(diào)節(jié)SA介導(dǎo)的植物免疫，而的主要功能是作為植物防御的負(fù)向調(diào)節(jié)因子?；蚪M信息不足和落后的生物技術(shù)極大限制園藝物種中R基因的發(fā)現(xiàn)，而關(guān)鍵同源物的鑒定和應(yīng)用已被證明是產(chǎn)生抗病轉(zhuǎn)基因植物的有效方法，在園藝作物如番茄、胡蘿卜和柑橘中異源表達(dá)，顯示出具有增強(qiáng)的廣譜疾病和害蟲抗性的轉(zhuǎn)基因植物的潛力。因此，對芫荽-like基因家族的鑒定和分析將有助于傘形科科和其他植物物種的抗病育種。

本研究在最新發(fā)表的芫荽高質(zhì)量基因組中搜索like基因家族成員，最終鑒定到7個芫荽-like成員，這個數(shù)量與擬南芥(6個)和鱷梨(5個)等植物中l(wèi)ike基因家族成員的數(shù)量類似。進(jìn)化和結(jié)構(gòu)分析都將7個分為明顯3組，該聚類方式與擬南芥like基因家族成員的聚類方式相同，且在2個介導(dǎo)蛋白-蛋白相互作用的必需結(jié)構(gòu)域，即BTB/POZ蛋白的N末端和錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域的中心區(qū)域，在芫荽和擬南芥中都很保守，并且在內(nèi)含子和外顯子數(shù)量和結(jié)構(gòu)方面具有極大的相似性。

在通常狀態(tài)下，以分子間二硫鍵形成多聚體的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)受到生物和非生物脅迫時，SA等誘導(dǎo)基因表達(dá)并促進(jìn)的構(gòu)象變化，以單體形式轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中，單體在細(xì)胞核中積累并激活防御基因表達(dá)。單體間二硫鍵的形成在Cys82和Cys150、Cys155、Cys 160、Cys216這幾個保守的半胱氨酸殘基之間形成，～的保守結(jié)構(gòu)域中的這些位點與擬南芥相比完全保守。NLS基序與AtNPR1/2的核定位有關(guān)，它在的部分堿性氨基酸(在圖5中用圓點標(biāo)記)中高度保守。此外，、和中的基序也存在于～中，其與對SA的敏感性十分重要。綜上，聚類在同一進(jìn)化分枝的擬南芥和芫荽-like家族成員具有相似的基因結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域類型和位置排列，并且在關(guān)鍵氨基酸位點和功能基序上高度保守，說明屬于同一分支的芫荽NPR蛋白可能以相似的方式展現(xiàn)生物學(xué)功能。

存在于基因啟動子或上游區(qū)域的獨特順式元件是轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點，也是基因調(diào)控的關(guān)鍵因素。越來越多的證據(jù)表明，病原體或水楊酸誘導(dǎo)基因的啟動子包含更多的防御相關(guān)順式元件，～的順式元件中防御相關(guān)順式元件的富集程度非常高(圖4)。其中，7個基因的啟動子區(qū)域均含有2個與SA信號途徑相關(guān)的元件，即CAAT-box和TATA-box。除了，其余6個基因啟動子區(qū)域都含有受水楊酸間接調(diào)控的順式作用元件as-1(activation sequence-1)。此前研究表明，啟動子區(qū)域含有W-box(TTGACC)序列，其為轉(zhuǎn)錄因子特異性識別的DNA結(jié)合位點。同樣，W-box元件也存在于、和基因的啟動子區(qū)域中，這預(yù)示著當(dāng)芫荽受到生物逆境脅迫時，可能具有與擬南芥基因類似的自我誘導(dǎo)調(diào)控機(jī)制。

本研究對芫荽-like基因家族成員進(jìn)行生物信息學(xué)和表達(dá)分析，不僅為更好地研究芫荽生長發(fā)育和抗病機(jī)制提供一定的參考，同時也為傘形科園藝作物的抗病改良提供重要的基因資源。