李玉平，嚴春蘭，駱進程，林 昶，楊長福

(貴州中醫(yī)藥大學，貴州 貴陽 550025)

厚樸始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，是我國傳統(tǒng)的芳香化濕藥，具有燥濕消痰、下氣除滿的功效，用于濕滯傷中，脘痞吐瀉，食積氣滯，腹脹便秘等癥[1]。厚樸主要含厚樸酚、厚樸酚[2]、揮發(fā)油[3-4]、厚樸堿[5]等。厚樸酚及和厚樸酚具有抗腫瘤[6]、抗抑郁[7]、抗炎[8]等作用?！吨袊幍洹芬髮駱氵M行“發(fā)汗”炮制加工?！鞍l(fā)汗”是中藥一種傳統(tǒng)增效的產(chǎn)地加工方法?！鞍l(fā)汗”類似于發(fā)酵，且“發(fā)汗”后樣品的質量均有所提升[9]。多個研究表明“發(fā)汗”后厚樸藥理作用更強[10]。因此，“發(fā)汗”后的厚樸藥材通常被認為是質量上乘的重要體現(xiàn)[11]，是厚樸增效的炮制過程。

迄今為止，已有研究多通過檢測“發(fā)汗”前后有效成分的變化情況，進而判斷“發(fā)汗”的必要性，然而有關厚樸“發(fā)汗”機理的報道很少?！鞍l(fā)汗”可通過厚樸鮮樹皮置沸水中微蒸、煮后堆積放置或鮮樹皮直接堆積放置等方式使藥材發(fā)熱、“回潮”，藥材內部水分外溢，從而產(chǎn)生一個濕熱的環(huán)境[12]。研究表明，濕熱環(huán)境有利于微生物的生長繁殖[13]，厚樸在“發(fā)汗”過程中，隨著溫濕度的改變，微生物群落結構和多樣性隨之產(chǎn)生變化。不同方式“發(fā)汗”后厚樸藥材質量均得到提高[14]。魏擔等[15]對厚樸鮮樹皮置沸水中微蒸后“發(fā)汗”的菌群變化情況進行了研究，但將厚樸鮮樹皮直接堆積放置“發(fā)汗”的菌群多樣性及特征變化情況如何，以及與微蒸后“發(fā)汗”菌群變化是否一致，目前仍不知曉。為此，采用高通量擴增測序技術探索厚樸鮮皮直接“發(fā)汗”過程中微生物群落多樣性及其特征，旨在進一步尋找影響厚樸藥材質量的微生物群落，為推進厚樸的精準“發(fā)汗”提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 厚樸樣品于2019年6月采集于貴州省遵義市習水縣杉王街道羊九村(北緯28°36'東經(jīng)106°21')，選取3株樹齡18年厚樸植株，剝取厚樸干皮，趁鮮帶回實驗室，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學林昶副教授鑒定為厚樸M.officinalis，并于潔凈實驗室的超凈工作臺(紫外燈照射30min)內用鍘刀(紫外燈全方位照射30 min)無菌操作將其切成長4 cm，寬2 cm小塊，然后對切塊進行混均，隨機取其中3份厚樸新鮮干皮作為“發(fā)汗”前樣本(Q1-Q3)，剩余切塊裝于無菌黑色塑料袋置于陰涼處進行“發(fā)汗”并于第3 d隨機取3份樣本(Z1-Z3)、第6 d隨機取3份樣本(H1-H3)，取樣分別裝于9個無菌取樣袋中，每次樣本取完后立即放入-80 ℃冷凍備用。

1.2 方法

1.2.1 DNA抽提和PCR擴增 厚樸“發(fā)汗”過程中樣品的真菌ITS區(qū)以及細菌V3～V4區(qū)基因測序，由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。根據(jù)E.Z.N.A.? soil試劑盒(Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.)說明書進行總DNA抽提，DNA濃度和純度利用NanoDrop2000進行檢測，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質量。

真菌擴增區(qū)域為ITS1區(qū)，引物為ITS1F(5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3')和ITS2R(5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3')[16]。用338F(5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-33')和806R(5'-GGACTACHVGGGTTCTAAT-3')引物對細菌V3-V4可變區(qū)進行PCR擴增[17]，擴增程序為：95℃預變性3min，真菌35個循環(huán)/細菌27個循環(huán)(95℃變性30 s，真菌53℃/細菌55℃退火30 s，72℃延伸30 s)，最后72℃延伸10 min(PCR儀：ABI GeneAmp? 9700型)。擴增體系為20 μL，4 μL 5×FastPfu緩沖液，2 μL 2.5mM dNTPs，0.8 μL 引物(5uM)，0.4 μL FastPfu聚合酶；10 ng DNA模板。

1.2.2 Illumina Miseq測序 使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen Biosciences，Union City，CA，USA)進行純化，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測。利用QuantiFluorTM-STPromega進行檢測定量。根據(jù)Illumina MiSeq 平臺(Illumina，San Diego，USA)標準操作規(guī)程將純化后的擴增片段構建PE 2×300的文庫。構建文庫步驟：(1)連接“Y”字形接頭。(2)使用磁珠篩選去除接頭自連片段。(3)利用PCR擴增進行文庫模板的富集。(4)氫氧化鈉變性，產(chǎn)生單鏈DNA片段。利用Illumina公司的Miseq PE300平臺進行測序(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司)。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 原始測序序列使用Trimmomatic 軟件質控，使用FLASH軟件進行拼接：(1)設置50 bp的窗口，如果窗口內的平均質量值低于20，從窗口前端位置截去該堿基后端所有序列，之后再去除質控后長度低于50 bp的序列。(2)根據(jù)重疊堿基overlap將兩端序列進行拼接，拼接時overlap之間的最大錯配率為0.2，長度需大于10 bp。去除無法拼接的序列。(3)根據(jù)序列首尾兩端的barcode和引物將序列拆分至每個樣本，barcode需精確匹配，引物允許2個堿基的錯配，去除存在模糊堿基的序列。使用的UPARSE軟件(version 7.1 http：//drive5.com/uparse/)，〗根據(jù)97%的相似度對序列進行OTU聚類，并在聚類的過程中去除單序列和嵌合體。利用RDP classifier(http：//rdp.cme.msu.edu/)對每條序列進行物種分類注釋，比對Silva數(shù)據(jù)庫(SSU123)，設置比對閾值為70%。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析 測序數(shù)據(jù)放在上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司的美吉生信云分析平臺(https：//cloud.majorbio.com)進行分析。MiSeq測序得到的雙端序列數(shù)據(jù)，首先根據(jù)PE reads之間的overlap關系，將成對的reads拼接(merge)成一條序列，同時對reads的質量和merge的效果進行質控過濾，根據(jù)序列首尾兩端的barcode和引物序列區(qū)分樣品得到有效序列，并校正序列方向。將高質量的序列按照97%相似性進行OTU(operational taxonomic unit)聚類。選擇所有的樣品統(tǒng)一按最小樣本序列數(shù)進行抽平分析，利用Chao和Shannon進行alpha多樣性指數(shù)分析，用主坐標分析(PCoA)進行beta多樣性指數(shù)分析。選擇分析平臺提供的Student、st-test差異檢驗方法進行alpha多樣性指組間差異檢驗，用ANOSIM差異檢驗方法進行主坐標分析(PCoA)的差異進行統(tǒng)計分析。利用求均值的樣本分組計算方法繪制群落柱形圖和群落餅圖進行門水平上菌群組成變化分析。利用求均值的樣本分組計算方法繪制群落柱形圖，用Average的物種層級聚類和求均值的樣本分組計算方法繪制群落物種聚類樹Heatmap圖共同進行屬水平上菌群結構及變化分析。

2 結果

2.1 alpha多樣性分析 由分析結果(圖1)可知，對于真菌，“發(fā)汗”中樣品(ZZ)具有最高的 Chao 指數(shù)(139.85)，說明“發(fā)汗”中物種豐度最高，“發(fā)汗”前樣品(ZQ)和發(fā)汗”中樣品與“發(fā)汗”后樣品(ZH)物種豐度差異有統(tǒng)計學意義，說明“發(fā)汗”后真菌的物種豐度下降明顯?！鞍l(fā)汗”中樣品具有最高的Shannon指數(shù)(2.46)，反映“發(fā)汗”中物種多樣性最高。且與“發(fā)汗”前樣品和發(fā)汗”后樣品差異有統(tǒng)計學意義。

樣本中細菌的Chao指數(shù)相對真菌而言較小，說明厚樸“發(fā)汗”過程中細菌的物種豐度低于真菌，且“發(fā)汗”中樣品(XZ)和發(fā)汗”后樣品(XH)物種豐度相對“發(fā)汗”前樣品(XQ)變小，但差異無統(tǒng)計學意義。細菌Shannon指數(shù)同樣小于真菌Shannon指數(shù)，說明厚樸“發(fā)汗”過程中細菌的多樣養(yǎng)性低于真菌，且“發(fā)汗”后樣品物種多樣性小于“發(fā)汗”前樣品和發(fā)汗”中樣品，但差異無統(tǒng)計學意義。

注：0.01

2.2 微生物群落結構及變化情況

2.2.1 “發(fā)汗”過程中微生物門水平群落結構及變化情況 根據(jù)高通量測序結果，從9份供試樣本中共檢測到6個真菌菌門，分別為子囊菌門Ascomycota、擔子菌門Basidiomycota，未分類的真菌門Unclassified_k_Fungi、接合菌門Zygomycota、壺菌門Chytridiomycota和隱真菌門Rozellomycota，見圖2。子囊菌門Ascomycota在“發(fā)汗”整個過程中處于絕對優(yōu)勢地位。擔子菌門Basidiomycota、未分類的真菌門unclassified_k_Fungi和接合菌門Zygomycota在“發(fā)汗”中豐度明顯升高。壺菌門Chytridiomycota和隱真菌門Rozellomycota僅在“發(fā)汗”中出現(xiàn)，且豐度極小。可見“發(fā)汗”這一過程促進了在“發(fā)汗”中豐度變高或出現(xiàn)的菌門的繁殖，為其轉化厚樸提供了條件。我們尋找在“發(fā)汗”中發(fā)揮作用的真菌時，可以把范圍縮小到擔子菌門Basidiomycota、未分類的真菌門unclassified_k_Fungi、接合菌門Zygomycota、壺菌門Chytridiomycota和隱真菌門Rozellomycota。

共檢測到10個門水平細菌，由變形菌門Proteobacteria、藍藻門Cyanobacteria、厚壁菌門Firmicutes、浮霉菌門Planctomycetes、放線菌門Actinobacteria、未分類細菌門Unclassified_k_norank、酸桿菌門Acidobacteria、擬桿菌門Bacteroidetes、裝甲菌門Armatimonadetes及Saccharibacteria門組成?！鞍l(fā)汗”各階段門水平上的細菌群落結構見圖3，變形菌門Proteobacteria在整過“發(fā)汗”過程中處于絕對優(yōu)勢地位且在中后期豐度進一步提高。浮霉菌門Planctomycetes、酸桿菌門Acidobacteria、裝甲菌門Armatimonadetes及Saccharibacteria門在“發(fā)汗”中后期消失，且整過“發(fā)汗”過程中無新增優(yōu)勢菌門出現(xiàn)。由細菌菌門變化情況可知，“發(fā)汗”并沒有為功能菌的菌門創(chuàng)造適宜的條件，故判斷在“發(fā)汗”過程中發(fā)揮作用的微生物并不是細菌。

圖2 不同時期門水平上真菌樣本群落組成及變化分析

圖3 不同時期門水平上細菌樣本群落組成及變化分析

2.2.2 “發(fā)汗”過程中微生物屬水平組成及豐度變化情況分析 厚樸“發(fā)汗”過程中9個樣本共檢出167個真菌菌屬。按總豐度遞減排列，前5的真菌屬是青霉菌屬Penicillium、假絲酵母菌屬Candida(Meyerozyma)、Unclassified_p_Ascomycota、曲霉屬Aspergillus、Unclassified_c_Leanororcete。由圖4豐度熱圖可知，進化關系越近的菌屬，在“發(fā)汗”過程中豐度變化情況越相似。分支Unclassified_f_Davidielaceae、隱球菌屬Cryptococcus、鏈格孢屬Alternaria、Unclassified_c_Leanororcete、Unclassified_f_norank和Unclassified_o_Capnodiales中除了Unclassified_c_Leanororcete外，在“發(fā)汗”過程中都是由低豐度到高豐度再到低豐度的變化。分支Unclassified_k_fungi、擬盤多毛孢屬Pestalotiopsis和葡萄座腔菌屬Neofusicoccum中，豐度都是“發(fā)汗”前和“發(fā)汗”中豐度較高，“發(fā)汗”后豐度變小。分支Toxicocladosporium、Unclassified_f_Mycosphaerellaceae、小囊菌屬Microascus、紅冬孢酵母屬Rhodosporidium和黑星菌屬Venturia中，豐度都是“發(fā)汗”中變高，“發(fā)汗”前和“發(fā)汗”后豐度都很低。分支鐮刀菌屬Fusarium和Unclassified_f_Ramalinaceae在“發(fā)汗”過程中豐度逐漸變低。分支假絲酵母菌屬Candida(Meyerozyma)和曲霉屬Aspergillus在“發(fā)汗”整個過程中豐度不斷變高。分支青霉菌屬Penicillium和Unclassified_p_Ascomycota中，青霉菌屬Penicillium在“發(fā)汗”中豐度低于“發(fā)汗”前和“發(fā)汗”后，Unclassified_p_Ascomycota在“發(fā)汗”整個過程中豐度不斷降低。

圖4 真菌在屬水平上的組成及豐度變化情況

“發(fā)汗”過程中9個樣本共檢出50個細菌菌屬，按總豐度遞減排列，前5的細菌菌屬是泛菌屬Pantoea、腸桿菌屬Enterobacter、假單胞菌屬Pseudomonas、Norank_c_Cyanobacteria、沙雷氏菌屬Serratia。由圖5細菌豐度熱圖可知進化關系越近的菌屬，在“發(fā)汗”過程中豐度變化情況也越相似。分支norank_c_Cyanobacteria、泛菌屬Pantoea和腸桿菌屬Enterobacter中，只有norank_c_Cyanobacteria“發(fā)汗”過程中豐度逐漸降低，泛菌屬Pantoea和腸桿菌屬Enterobacter豐度幾乎保持不變。分支乳球菌屬Lactococcus、Bryocella、norank_f_ODP1230B8.23、Unclassified_k_ norank、Singulisphaera和norank_o_Acidimicrobiales中，各菌屬豐度均在降低。分支假單胞菌屬Pseudomonas、單胞菌屬Stenotrophomonas、沙雷氏菌屬Serratia、Rosenbergiella、塔特姆菌屬Tatumella和新鞘脂菌屬Novosphingobium中，各菌屬豐度幾乎保持不變。分支鞘脂菌屬Sphingobium、無色桿菌屬Achromobacter、葡糖桿菌屬Gluconobacter、Unclassified_f_Enterobacteriaceae和藤黃色桿菌屬Luteibacter中，雖然在中后期豐度都有所上升，但豐度都很低。分析結果進一步支持“發(fā)汗”中發(fā)揮作用的是真菌而非細菌。

圖5 細菌屬水平組成及豐度變化情況

3 討論

本實驗樣本中共檢測到6個真菌菌門，子囊菌門Ascomycota在“發(fā)汗”整個過程中處于絕對優(yōu)勢地位。擔子菌門Basidiomycota、未分類的真菌門unclassified_k_Fungi和接合菌門Zygomycota在“發(fā)汗”中豐度明顯升高。壺菌門Chytridiomycota和隱真菌門Rozellomycota僅在“發(fā)汗”中出現(xiàn)，且豐度極小。可見“發(fā)汗”這一過程促進了在“發(fā)汗”中豐度變高或出現(xiàn)的菌門的繁殖，為其轉化厚樸提供了條件。所以在尋找 “發(fā)汗”中發(fā)揮作用的真菌時，可以把范圍縮小到擔子菌門Basidiomycota、未分類的真菌門unclassified_k_Fungi、接合菌門Zygomycota、壺菌門Chytridiomycota和隱真菌門Rozellomycota。共檢測到10個門水平細菌，變形菌門Proteobacteria在整過“發(fā)汗”過程中處于絕對優(yōu)勢地位且在中后期豐度進一步提高。浮霉菌門Planctomycetes、酸桿菌門Acidobacteria、裝甲菌門Armatimonadetes及Saccharibacteria門在“發(fā)汗”中后期消失，且整個“發(fā)汗”過程中無新增優(yōu)勢菌門出現(xiàn)。

實驗結果顯示厚樸鮮樹皮直接堆積放置“發(fā)汗”的過程中真菌物種豐度在“發(fā)汗”中最高，且“發(fā)汗”前和“發(fā)汗”中都高于“發(fā)汗”后，差異有統(tǒng)計學意義?！鞍l(fā)汗”中真菌物種多樣性最高，且與“發(fā)汗”前和“發(fā)汗”后樣品差異有統(tǒng)計學意義，故真菌物種豐度和多樣性在整個“發(fā)汗”過程中均為先上升后下降，且“發(fā)汗”后真菌物種豐度和多樣性在整個“發(fā)汗”過程中最低。“發(fā)汗”過程中的細菌物種豐度和多樣性均低于真菌，“發(fā)汗”前中后期細菌物種豐度和多樣性差異無統(tǒng)計學意義。這與魏擔等[15]將厚樸鮮樹皮置沸水中微蒸后“發(fā)汗”的真菌最后物種豐度和多樣性均下降具有一致性，但魏擔等微蒸后“發(fā)汗”的過程中細菌豐度和多樣性均高于真菌，這與本實驗結果相反，這可能與微蒸處理后改變了厚樸初始菌群結構有關，也有可能是采集厚樸地方或“發(fā)汗”環(huán)境不同造成的。另外本實驗還注意到進化關系越近的菌屬，在“發(fā)汗”過程中豐度變化情況也越相似。這可能是越相近的菌屬對生存環(huán)境的適應性越相似的原故。

厚樸主要有效成分厚樸酚與和厚樸酚[18-19]，能夠作為評價指標反映厚樸質量。王穎[20]利用在厚樸中分離到的真菌搖瓶發(fā)酵發(fā)現(xiàn)曲霉屬、毛霉屬、木霉屬、鐮刀菌屬、交鏈孢霉屬、粘帚霉屬和蠟蚧菌屬都能提高厚樸酚的產(chǎn)量。這與本實驗及魏擔等微蒸后“發(fā)汗”后的優(yōu)勢真菌菌屬的差異較大，但均能對厚樸藥材起到增效作用[14]這一結果不矛盾。

“發(fā)汗”會提高中藥厚樸藥材質量，本人認為，“發(fā)汗”會給發(fā)揮作用的菌屬創(chuàng)造適宜的繁殖條件，從而使其豐度升高。故發(fā)揮作用的應該是真菌而非細菌，且在“發(fā)汗”中發(fā)揮作用的真菌屬應該在Unclassified_f_Davidielaceae、隱球菌屬Cryptococcus、鏈格孢屬Alternaria、Unclassified_f_norank、Unclassified_o_Capnodiales、Toxicocladosporium、Unclassified_f_Mycosphaerellaceae、小囊菌屬Microascus、紅冬孢酵母屬Rhodosporidium和黑星菌屬Venturia這些在中后期豐度升高的菌屬中尋找。綜上，本實驗分析了鮮皮厚樸直接堆積放置 “發(fā)汗”過程中的微生物群落結構及特征，對進一步尋找厚樸“發(fā)汗”過程中發(fā)揮作用的菌屬具有一定參考價值。