李玉平，嚴(yán)春蘭，駱進(jìn)程，林 昶，楊長(zhǎng)福

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽(yáng) 550025)

厚樸始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，是我國(guó)傳統(tǒng)的芳香化濕藥，具有燥濕消痰、下氣除滿的功效，用于濕滯傷中，脘痞吐瀉，食積氣滯，腹脹便秘等癥[1]。厚樸主要含厚樸酚、厚樸酚[2]、揮發(fā)油[3-4]、厚樸堿[5]等。厚樸酚及和厚樸酚具有抗腫瘤[6]、抗抑郁[7]、抗炎[8]等作用?！吨袊?guó)藥典》要求對(duì)厚樸進(jìn)行“發(fā)汗”炮制加工?！鞍l(fā)汗”是中藥一種傳統(tǒng)增效的產(chǎn)地加工方法?！鞍l(fā)汗”類似于發(fā)酵，且“發(fā)汗”后樣品的質(zhì)量均有所提升[9]。多個(gè)研究表明“發(fā)汗”后厚樸藥理作用更強(qiáng)[10]。因此，“發(fā)汗”后的厚樸藥材通常被認(rèn)為是質(zhì)量上乘的重要體現(xiàn)[11]，是厚樸增效的炮制過(guò)程。

迄今為止，已有研究多通過(guò)檢測(cè)“發(fā)汗”前后有效成分的變化情況，進(jìn)而判斷“發(fā)汗”的必要性，然而有關(guān)厚樸“發(fā)汗”機(jī)理的報(bào)道很少?！鞍l(fā)汗”可通過(guò)厚樸鮮樹(shù)皮置沸水中微蒸、煮后堆積放置或鮮樹(shù)皮直接堆積放置等方式使藥材發(fā)熱、“回潮”，藥材內(nèi)部水分外溢，從而產(chǎn)生一個(gè)濕熱的環(huán)境[12]。研究表明，濕熱環(huán)境有利于微生物的生長(zhǎng)繁殖[13]，厚樸在“發(fā)汗”過(guò)程中，隨著溫濕度的改變，微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性隨之產(chǎn)生變化。不同方式“發(fā)汗”后厚樸藥材質(zhì)量均得到提高[14]。魏擔(dān)等[15]對(duì)厚樸鮮樹(shù)皮置沸水中微蒸后“發(fā)汗”的菌群變化情況進(jìn)行了研究，但將厚樸鮮樹(shù)皮直接堆積放置“發(fā)汗”的菌群多樣性及特征變化情況如何，以及與微蒸后“發(fā)汗”菌群變化是否一致，目前仍不知曉。為此，采用高通量擴(kuò)增測(cè)序技術(shù)探索厚樸鮮皮直接“發(fā)汗”過(guò)程中微生物群落多樣性及其特征，旨在進(jìn)一步尋找影響厚樸藥材質(zhì)量的微生物群落，為推進(jìn)厚樸的精準(zhǔn)“發(fā)汗”提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 厚樸樣品于2019年6月采集于貴州省遵義市習(xí)水縣杉王街道羊九村(北緯28°36'東經(jīng)106°21')，選取3株樹(shù)齡18年厚樸植株，剝?nèi)『駱愀善?，趁鮮帶回實(shí)驗(yàn)室，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)林昶副教授鑒定為厚樸M.officinalis，并于潔凈實(shí)驗(yàn)室的超凈工作臺(tái)(紫外燈照射30min)內(nèi)用鍘刀(紫外燈全方位照射30 min)無(wú)菌操作將其切成長(zhǎng)4 cm，寬2 cm小塊，然后對(duì)切塊進(jìn)行混均，隨機(jī)取其中3份厚樸新鮮干皮作為“發(fā)汗”前樣本(Q1-Q3)，剩余切塊裝于無(wú)菌黑色塑料袋置于陰涼處進(jìn)行“發(fā)汗”并于第3 d隨機(jī)取3份樣本(Z1-Z3)、第6 d隨機(jī)取3份樣本(H1-H3)，取樣分別裝于9個(gè)無(wú)菌取樣袋中，每次樣本取完后立即放入-80 ℃冷凍備用。

1.2 方法

1.2.1 DNA抽提和PCR擴(kuò)增 厚樸“發(fā)汗”過(guò)程中樣品的真菌ITS區(qū)以及細(xì)菌V3～V4區(qū)基因測(cè)序，由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。根據(jù)E.Z.N.A.? soil試劑盒(Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行總DNA抽提，DNA濃度和純度利用NanoDrop2000進(jìn)行檢測(cè)，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取質(zhì)量。

真菌擴(kuò)增區(qū)域?yàn)镮TS1區(qū)，引物為ITS1F(5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3')和ITS2R(5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3')[16]。用338F(5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-33')和806R(5'-GGACTACHVGGGTTCTAAT-3')引物對(duì)細(xì)菌V3-V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增[17]，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3min，真菌35個(gè)循環(huán)/細(xì)菌27個(gè)循環(huán)(95℃變性30 s，真菌53℃/細(xì)菌55℃退火30 s，72℃延伸30 s)，最后72℃延伸10 min(PCR儀：ABI GeneAmp? 9700型)。擴(kuò)增體系為20 μL，4 μL 5×FastPfu緩沖液，2 μL 2.5mM dNTPs，0.8 μL 引物(5uM)，0.4 μL FastPfu聚合酶；10 ng DNA模板。

1.2.2 Illumina Miseq測(cè)序 使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen Biosciences，Union City，CA，USA)進(jìn)行純化，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測(cè)。利用QuantiFluorTM-STPromega進(jìn)行檢測(cè)定量。根據(jù)Illumina MiSeq 平臺(tái)(Illumina，San Diego，USA)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程將純化后的擴(kuò)增片段構(gòu)建PE 2×300的文庫(kù)。構(gòu)建文庫(kù)步驟：(1)連接“Y”字形接頭。(2)使用磁珠篩選去除接頭自連片段。(3)利用PCR擴(kuò)增進(jìn)行文庫(kù)模板的富集。(4)氫氧化鈉變性，產(chǎn)生單鏈DNA片段。利用Illumina公司的Miseq PE300平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司)。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 原始測(cè)序序列使用Trimmomatic 軟件質(zhì)控，使用FLASH軟件進(jìn)行拼接：(1)設(shè)置50 bp的窗口，如果窗口內(nèi)的平均質(zhì)量值低于20，從窗口前端位置截去該堿基后端所有序列，之后再去除質(zhì)控后長(zhǎng)度低于50 bp的序列。(2)根據(jù)重疊堿基overlap將兩端序列進(jìn)行拼接，拼接時(shí)overlap之間的最大錯(cuò)配率為0.2，長(zhǎng)度需大于10 bp。去除無(wú)法拼接的序列。(3)根據(jù)序列首尾兩端的barcode和引物將序列拆分至每個(gè)樣本，barcode需精確匹配，引物允許2個(gè)堿基的錯(cuò)配，去除存在模糊堿基的序列。使用的UPARSE軟件(version 7.1 http：//drive5.com/uparse/)，〗根據(jù)97%的相似度對(duì)序列進(jìn)行OTU聚類，并在聚類的過(guò)程中去除單序列和嵌合體。利用RDP classifier(http：//rdp.cme.msu.edu/)對(duì)每條序列進(jìn)行物種分類注釋，比對(duì)Silva數(shù)據(jù)庫(kù)(SSU123)，設(shè)置比對(duì)閾值為70%。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析 測(cè)序數(shù)據(jù)放在上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司的美吉生信云分析平臺(tái)(https：//cloud.majorbio.com)進(jìn)行分析。MiSeq測(cè)序得到的雙端序列數(shù)據(jù)，首先根據(jù)PE reads之間的overlap關(guān)系，將成對(duì)的reads拼接(merge)成一條序列，同時(shí)對(duì)reads的質(zhì)量和merge的效果進(jìn)行質(zhì)控過(guò)濾，根據(jù)序列首尾兩端的barcode和引物序列區(qū)分樣品得到有效序列，并校正序列方向。將高質(zhì)量的序列按照97%相似性進(jìn)行OTU(operational taxonomic unit)聚類。選擇所有的樣品統(tǒng)一按最小樣本序列數(shù)進(jìn)行抽平分析，利用Chao和Shannon進(jìn)行alpha多樣性指數(shù)分析，用主坐標(biāo)分析(PCoA)進(jìn)行beta多樣性指數(shù)分析。選擇分析平臺(tái)提供的Student、st-test差異檢驗(yàn)方法進(jìn)行alpha多樣性指組間差異檢驗(yàn)，用ANOSIM差異檢驗(yàn)方法進(jìn)行主坐標(biāo)分析(PCoA)的差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。利用求均值的樣本分組計(jì)算方法繪制群落柱形圖和群落餅圖進(jìn)行門(mén)水平上菌群組成變化分析。利用求均值的樣本分組計(jì)算方法繪制群落柱形圖，用Average的物種層級(jí)聚類和求均值的樣本分組計(jì)算方法繪制群落物種聚類樹(shù)Heatmap圖共同進(jìn)行屬水平上菌群結(jié)構(gòu)及變化分析。

2 結(jié)果

2.1 alpha多樣性分析 由分析結(jié)果(圖1)可知，對(duì)于真菌，“發(fā)汗”中樣品(ZZ)具有最高的 Chao 指數(shù)(139.85)，說(shuō)明“發(fā)汗”中物種豐度最高，“發(fā)汗”前樣品(ZQ)和發(fā)汗”中樣品與“發(fā)汗”后樣品(ZH)物種豐度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明“發(fā)汗”后真菌的物種豐度下降明顯。“發(fā)汗”中樣品具有最高的Shannon指數(shù)(2.46)，反映“發(fā)汗”中物種多樣性最高。且與“發(fā)汗”前樣品和發(fā)汗”后樣品差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

樣本中細(xì)菌的Chao指數(shù)相對(duì)真菌而言較小，說(shuō)明厚樸“發(fā)汗”過(guò)程中細(xì)菌的物種豐度低于真菌，且“發(fā)汗”中樣品(XZ)和發(fā)汗”后樣品(XH)物種豐度相對(duì)“發(fā)汗”前樣品(XQ)變小，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。細(xì)菌Shannon指數(shù)同樣小于真菌Shannon指數(shù)，說(shuō)明厚樸“發(fā)汗”過(guò)程中細(xì)菌的多樣養(yǎng)性低于真菌，且“發(fā)汗”后樣品物種多樣性小于“發(fā)汗”前樣品和發(fā)汗”中樣品，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

注：0.01

2.2 微生物群落結(jié)構(gòu)及變化情況

2.2.1 “發(fā)汗”過(guò)程中微生物門(mén)水平群落結(jié)構(gòu)及變化情況 根據(jù)高通量測(cè)序結(jié)果，從9份供試樣本中共檢測(cè)到6個(gè)真菌菌門(mén)，分別為子囊菌門(mén)Ascomycota、擔(dān)子菌門(mén)Basidiomycota，未分類的真菌門(mén)Unclassified_k_Fungi、接合菌門(mén)Zygomycota、壺菌門(mén)Chytridiomycota和隱真菌門(mén)Rozellomycota，見(jiàn)圖2。子囊菌門(mén)Ascomycota在“發(fā)汗”整個(gè)過(guò)程中處于絕對(duì)優(yōu)勢(shì)地位。擔(dān)子菌門(mén)Basidiomycota、未分類的真菌門(mén)unclassified_k_Fungi和接合菌門(mén)Zygomycota在“發(fā)汗”中豐度明顯升高。壺菌門(mén)Chytridiomycota和隱真菌門(mén)Rozellomycota僅在“發(fā)汗”中出現(xiàn)，且豐度極小?？梢?jiàn)“發(fā)汗”這一過(guò)程促進(jìn)了在“發(fā)汗”中豐度變高或出現(xiàn)的菌門(mén)的繁殖，為其轉(zhuǎn)化厚樸提供了條件。我們尋找在“發(fā)汗”中發(fā)揮作用的真菌時(shí)，可以把范圍縮小到擔(dān)子菌門(mén)Basidiomycota、未分類的真菌門(mén)unclassified_k_Fungi、接合菌門(mén)Zygomycota、壺菌門(mén)Chytridiomycota和隱真菌門(mén)Rozellomycota。

共檢測(cè)到10個(gè)門(mén)水平細(xì)菌，由變形菌門(mén)Proteobacteria、藍(lán)藻門(mén)Cyanobacteria、厚壁菌門(mén)Firmicutes、浮霉菌門(mén)Planctomycetes、放線菌門(mén)Actinobacteria、未分類細(xì)菌門(mén)Unclassified_k_norank、酸桿菌門(mén)Acidobacteria、擬桿菌門(mén)Bacteroidetes、裝甲菌門(mén)Armatimonadetes及Saccharibacteria門(mén)組成?！鞍l(fā)汗”各階段門(mén)水平上的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖3，變形菌門(mén)Proteobacteria在整過(guò)“發(fā)汗”過(guò)程中處于絕對(duì)優(yōu)勢(shì)地位且在中后期豐度進(jìn)一步提高。浮霉菌門(mén)Planctomycetes、酸桿菌門(mén)Acidobacteria、裝甲菌門(mén)Armatimonadetes及Saccharibacteria門(mén)在“發(fā)汗”中后期消失，且整過(guò)“發(fā)汗”過(guò)程中無(wú)新增優(yōu)勢(shì)菌門(mén)出現(xiàn)。由細(xì)菌菌門(mén)變化情況可知，“發(fā)汗”并沒(méi)有為功能菌的菌門(mén)創(chuàng)造適宜的條件，故判斷在“發(fā)汗”過(guò)程中發(fā)揮作用的微生物并不是細(xì)菌。

圖2 不同時(shí)期門(mén)水平上真菌樣本群落組成及變化分析

圖3 不同時(shí)期門(mén)水平上細(xì)菌樣本群落組成及變化分析

2.2.2 “發(fā)汗”過(guò)程中微生物屬水平組成及豐度變化情況分析 厚樸“發(fā)汗”過(guò)程中9個(gè)樣本共檢出167個(gè)真菌菌屬。按總豐度遞減排列，前5的真菌屬是青霉菌屬Penicillium、假絲酵母菌屬Candida(Meyerozyma)、Unclassified_p_Ascomycota、曲霉屬Aspergillus、Unclassified_c_Leanororcete。由圖4豐度熱圖可知，進(jìn)化關(guān)系越近的菌屬，在“發(fā)汗”過(guò)程中豐度變化情況越相似。分支Unclassified_f_Davidielaceae、隱球菌屬Cryptococcus、鏈格孢屬Alternaria、Unclassified_c_Leanororcete、Unclassified_f_norank和Unclassified_o_Capnodiales中除了Unclassified_c_Leanororcete外，在“發(fā)汗”過(guò)程中都是由低豐度到高豐度再到低豐度的變化。分支Unclassified_k_fungi、擬盤(pán)多毛孢屬Pestalotiopsis和葡萄座腔菌屬Neofusicoccum中，豐度都是“發(fā)汗”前和“發(fā)汗”中豐度較高，“發(fā)汗”后豐度變小。分支Toxicocladosporium、Unclassified_f_Mycosphaerellaceae、小囊菌屬M(fèi)icroascus、紅冬孢酵母屬Rhodosporidium和黑星菌屬Venturia中，豐度都是“發(fā)汗”中變高，“發(fā)汗”前和“發(fā)汗”后豐度都很低。分支鐮刀菌屬Fusarium和Unclassified_f_Ramalinaceae在“發(fā)汗”過(guò)程中豐度逐漸變低。分支假絲酵母菌屬Candida(Meyerozyma)和曲霉屬Aspergillus在“發(fā)汗”整個(gè)過(guò)程中豐度不斷變高。分支青霉菌屬Penicillium和Unclassified_p_Ascomycota中，青霉菌屬Penicillium在“發(fā)汗”中豐度低于“發(fā)汗”前和“發(fā)汗”后，Unclassified_p_Ascomycota在“發(fā)汗”整個(gè)過(guò)程中豐度不斷降低。

圖4 真菌在屬水平上的組成及豐度變化情況

“發(fā)汗”過(guò)程中9個(gè)樣本共檢出50個(gè)細(xì)菌菌屬，按總豐度遞減排列，前5的細(xì)菌菌屬是泛菌屬Pantoea、腸桿菌屬Enterobacter、假單胞菌屬Pseudomonas、Norank_c_Cyanobacteria、沙雷氏菌屬Serratia。由圖5細(xì)菌豐度熱圖可知進(jìn)化關(guān)系越近的菌屬，在“發(fā)汗”過(guò)程中豐度變化情況也越相似。分支norank_c_Cyanobacteria、泛菌屬Pantoea和腸桿菌屬Enterobacter中，只有norank_c_Cyanobacteria“發(fā)汗”過(guò)程中豐度逐漸降低，泛菌屬Pantoea和腸桿菌屬Enterobacter豐度幾乎保持不變。分支乳球菌屬Lactococcus、Bryocella、norank_f_ODP1230B8.23、Unclassified_k_ norank、Singulisphaera和norank_o_Acidimicrobiales中，各菌屬豐度均在降低。分支假單胞菌屬Pseudomonas、單胞菌屬Stenotrophomonas、沙雷氏菌屬Serratia、Rosenbergiella、塔特姆菌屬Tatumella和新鞘脂菌屬Novosphingobium中，各菌屬豐度幾乎保持不變。分支鞘脂菌屬Sphingobium、無(wú)色桿菌屬Achromobacter、葡糖桿菌屬Gluconobacter、Unclassified_f_Enterobacteriaceae和藤黃色桿菌屬Luteibacter中，雖然在中后期豐度都有所上升，但豐度都很低。分析結(jié)果進(jìn)一步支持“發(fā)汗”中發(fā)揮作用的是真菌而非細(xì)菌。

圖5 細(xì)菌屬水平組成及豐度變化情況

3 討論

本實(shí)驗(yàn)樣本中共檢測(cè)到6個(gè)真菌菌門(mén)，子囊菌門(mén)Ascomycota在“發(fā)汗”整個(gè)過(guò)程中處于絕對(duì)優(yōu)勢(shì)地位。擔(dān)子菌門(mén)Basidiomycota、未分類的真菌門(mén)unclassified_k_Fungi和接合菌門(mén)Zygomycota在“發(fā)汗”中豐度明顯升高。壺菌門(mén)Chytridiomycota和隱真菌門(mén)Rozellomycota僅在“發(fā)汗”中出現(xiàn)，且豐度極小?？梢?jiàn)“發(fā)汗”這一過(guò)程促進(jìn)了在“發(fā)汗”中豐度變高或出現(xiàn)的菌門(mén)的繁殖，為其轉(zhuǎn)化厚樸提供了條件。所以在尋找 “發(fā)汗”中發(fā)揮作用的真菌時(shí)，可以把范圍縮小到擔(dān)子菌門(mén)Basidiomycota、未分類的真菌門(mén)unclassified_k_Fungi、接合菌門(mén)Zygomycota、壺菌門(mén)Chytridiomycota和隱真菌門(mén)Rozellomycota。共檢測(cè)到10個(gè)門(mén)水平細(xì)菌，變形菌門(mén)Proteobacteria在整過(guò)“發(fā)汗”過(guò)程中處于絕對(duì)優(yōu)勢(shì)地位且在中后期豐度進(jìn)一步提高。浮霉菌門(mén)Planctomycetes、酸桿菌門(mén)Acidobacteria、裝甲菌門(mén)Armatimonadetes及Saccharibacteria門(mén)在“發(fā)汗”中后期消失，且整個(gè)“發(fā)汗”過(guò)程中無(wú)新增優(yōu)勢(shì)菌門(mén)出現(xiàn)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示厚樸鮮樹(shù)皮直接堆積放置“發(fā)汗”的過(guò)程中真菌物種豐度在“發(fā)汗”中最高，且“發(fā)汗”前和“發(fā)汗”中都高于“發(fā)汗”后，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。“發(fā)汗”中真菌物種多樣性最高，且與“發(fā)汗”前和“發(fā)汗”后樣品差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故真菌物種豐度和多樣性在整個(gè)“發(fā)汗”過(guò)程中均為先上升后下降，且“發(fā)汗”后真菌物種豐度和多樣性在整個(gè)“發(fā)汗”過(guò)程中最低。“發(fā)汗”過(guò)程中的細(xì)菌物種豐度和多樣性均低于真菌，“發(fā)汗”前中后期細(xì)菌物種豐度和多樣性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這與魏擔(dān)等[15]將厚樸鮮樹(shù)皮置沸水中微蒸后“發(fā)汗”的真菌最后物種豐度和多樣性均下降具有一致性，但魏擔(dān)等微蒸后“發(fā)汗”的過(guò)程中細(xì)菌豐度和多樣性均高于真菌，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相反，這可能與微蒸處理后改變了厚樸初始菌群結(jié)構(gòu)有關(guān)，也有可能是采集厚樸地方或“發(fā)汗”環(huán)境不同造成的。另外本實(shí)驗(yàn)還注意到進(jìn)化關(guān)系越近的菌屬，在“發(fā)汗”過(guò)程中豐度變化情況也越相似。這可能是越相近的菌屬對(duì)生存環(huán)境的適應(yīng)性越相似的原故。

厚樸主要有效成分厚樸酚與和厚樸酚[18-19]，能夠作為評(píng)價(jià)指標(biāo)反映厚樸質(zhì)量。王穎[20]利用在厚樸中分離到的真菌搖瓶發(fā)酵發(fā)現(xiàn)曲霉屬、毛霉屬、木霉屬、鐮刀菌屬、交鏈孢霉屬、粘帚霉屬和蠟蚧菌屬都能提高厚樸酚的產(chǎn)量。這與本實(shí)驗(yàn)及魏擔(dān)等微蒸后“發(fā)汗”后的優(yōu)勢(shì)真菌菌屬的差異較大，但均能對(duì)厚樸藥材起到增效作用[14]這一結(jié)果不矛盾。

“發(fā)汗”會(huì)提高中藥厚樸藥材質(zhì)量，本人認(rèn)為，“發(fā)汗”會(huì)給發(fā)揮作用的菌屬創(chuàng)造適宜的繁殖條件，從而使其豐度升高。故發(fā)揮作用的應(yīng)該是真菌而非細(xì)菌，且在“發(fā)汗”中發(fā)揮作用的真菌屬應(yīng)該在Unclassified_f_Davidielaceae、隱球菌屬Cryptococcus、鏈格孢屬Alternaria、Unclassified_f_norank、Unclassified_o_Capnodiales、Toxicocladosporium、Unclassified_f_Mycosphaerellaceae、小囊菌屬M(fèi)icroascus、紅冬孢酵母屬Rhodosporidium和黑星菌屬Venturia這些在中后期豐度升高的菌屬中尋找。綜上，本實(shí)驗(yàn)分析了鮮皮厚樸直接堆積放置 “發(fā)汗”過(guò)程中的微生物群落結(jié)構(gòu)及特征，對(duì)進(jìn)一步尋找厚樸“發(fā)汗”過(guò)程中發(fā)揮作用的菌屬具有一定參考價(jià)值。