鄭淑霞，許金森，陳苑平，陳 柯，薩喆燕，潘曉華

(福建省中醫(yī)藥科學(xué)院經(jīng)絡(luò)研究所/福建省經(jīng)絡(luò)感傳重點(diǎn)研究室，福建 福州 350003)

腹瀉型腸易激綜合征(diarrhoeal irritable bowel syndrome，IBS-D)是臨床最為常見的功能性胃腸病之一，因其癥狀遷延不愈，復(fù)發(fā)率高，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)[1-2]。已有臨床和實驗研究[3-5]證實，針刺對IBS-D有較好的治療效果，能顯著改善IBS-D患者腹痛、腹瀉等腸道癥狀，恢復(fù)腸道功能。近年來，國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)PAR-2介導(dǎo)的信號通路在IBS的發(fā)病機(jī)制中起到重要影響，不僅參與胃腸道的運(yùn)動功能，還可調(diào)節(jié)內(nèi)臟的敏感程度，且越來越多的研究發(fā)現(xiàn)PAR-2在腸道黏膜通透性中亦起到重要作用。然而針刺對IBS-D腸道功能的調(diào)節(jié)作用是否與PAR-2有關(guān)，目前尚未有深入研究。因此本研究觀察了IBS-D模型大鼠結(jié)腸組織PAR-2 mRNA及蛋白表達(dá)的變化，探討電針干預(yù)IBS-D的可能機(jī)制，為電針治療IBS-D提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物 健康成年的雄性SD大鼠32只，體質(zhì)量(250±20)g，由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司動物提供(許可證號：SCXK(滬)2018-0006)。適應(yīng)性飼養(yǎng)于福建省中醫(yī)藥科學(xué)院實驗動物中心7 d后分組飼養(yǎng)，溫度為(23～26)℃，相對濕度為50%～70%。

1.2 實驗試劑及儀器 番瀉葉生藥(亳州市華鑫中藥飲片科技有限公司)，液體石蠟(運(yùn)加牌，黑龍江省運(yùn)加醫(yī)療科技有限公司)，AG RNAex Pro RNA提取試劑盒、Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR? Green Pro Taq HS預(yù)混型qPCR試劑盒(湖南艾科瑞生物工程有限公司)，PAR-2一抗(英國 Abcam公司)，GAPDH一抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG(H+L)(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，8FR導(dǎo)尿管(事達(dá)牌，湛江市事達(dá)實業(yè)有限公司)，2 mL注射器(康友牌，江蘇康友醫(yī)用器械有限公司)，電子秤(福建福日電子股份有限公司)，R407小動物呼吸麻醉系統(tǒng)(瑞沃德生命科技有限公司)，異氟烷(瑞沃德生命科技有限公司)，SDZ-Ⅱ型電針儀(華佗牌，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)，0.25 mm×13 mm無菌針灸針(華成牌，蘇州東邦醫(yī)療器械有限公司)，NANODROP RNA質(zhì)量檢測儀(美國Thermo公司)，Veriti梯度PCR儀(美國ABI公司)，ABI 7500 Fast熒光定量PCR儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)，冷凍高通量組織研磨儀(浙江美壁儀器有限公司)。

1.3 分組與造模 32只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分成對照組、對照電針組、模型組及模型電針組，每組8只。對照組、對照電針組大鼠正常喂養(yǎng)，余下2組則需進(jìn)行2w的IBS-D造模處理。參照Williams等[6]的方法進(jìn)行改進(jìn)，采用慢性束縛應(yīng)激聯(lián)合番瀉葉灌胃的方法建立IBS-D大鼠模型，并參照趙妍等[7]的方法制備0.3 g/mL的番瀉葉煎劑。造模時先給予番瀉葉煎劑(0.3 g/mL)，并按照10 mL/kg的給藥劑量灌胃。灌服番瀉葉煎劑后，將大鼠裝進(jìn)自制的固定器中，限制其無法進(jìn)行自如活動，持續(xù)時長為1h，每日1次，持續(xù)2w。以模型組大鼠腹瀉指數(shù)與大便Bristol評分、直結(jié)腸擴(kuò)張(colorectal distension，CRD)容量閾值與空白組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義為造模成功的標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 干預(yù)方法 對照電針組和模型電針組在造模成功后對大鼠的足三里穴進(jìn)行電針干預(yù)，將大鼠固定在自制固定器內(nèi)，使其不亂跑亂動，參照實驗針灸研究會制定的《實驗動物針灸穴位圖譜》，選取大鼠的足三里穴。選用規(guī)格為0.25 mm×13 mm的毫針直刺，深度約為5 mm，并接上電針儀，選用疏密波，頻率2 Hz，強(qiáng)度為1～2 mA，以大鼠下肢出現(xiàn)輕微抖動且不嘶叫為度，留針20 min，每日1次，持續(xù)7d。

1.5 觀察指標(biāo)和檢測方法

1.5.1 一般情況 觀察大鼠在實驗過程中的精神狀態(tài)、活動情況、毛發(fā)光澤度以及體重增長等情況。

1.5.2 腹瀉情況 在大鼠造模前后以及干預(yù)后，對所有大鼠進(jìn)行腹瀉指數(shù)的測算。腹瀉指數(shù)測定時在鼠籠內(nèi)墊上濾紙，定時觀察大鼠排便情況，如有稀便污跡沾染濾紙則需更換濾紙，并及時記錄濾紙的污跡面積。持續(xù)觀察5h后，統(tǒng)計大鼠排稀便的數(shù)量及腹瀉情況，再根據(jù)公式計算每只大鼠的腹瀉指數(shù)[8]。

腹瀉指數(shù)=稀便率(每只大鼠的稀便數(shù)/總便數(shù))×稀便級(每只大鼠的稀便級數(shù)總和/稀便數(shù))。

稀便級數(shù)分級[4]：以稀便污染濾紙形成污跡面積的大小定級，分為4級：1級為污染直徑<1 cm，2級污染直徑1.0～1.9 cm，3級污染直徑2～3 cm，4級污染直徑>3 cm。統(tǒng)計每個大鼠排便的總數(shù)，再統(tǒng)計大鼠排稀便的總數(shù)，并逐一測定每堆稀便的級數(shù)，然后參照公式算出腹瀉率、稀便級以及腹瀉指數(shù)。測量污染直徑時，如果糞便形狀大致為圓形，則可以直接量直徑；若糞便形狀為橢圓形或較不規(guī)則時，則測量其最長距離和近似圓的直徑，并將二者相加除以2，即為最后的直徑。

Bristol評分：參照Bristol分型積分[9]，對大鼠的糞便形態(tài)逐一進(jìn)行評分，統(tǒng)計后取積分的平均值。

1.5.3 內(nèi)臟敏感性評價 在造模前、造模后及干預(yù)后，先將大鼠禁食12 h，將所有大鼠逐個放入小動物呼吸麻醉誘導(dǎo)盒內(nèi)，使其吸入異氟烷麻醉。待其麻醉后將帶有球囊的8FR導(dǎo)尿管插入大鼠肛門內(nèi)，導(dǎo)尿管插入深度為4.5 cm，隨后用膠帶將其纏在大鼠尾巴上固定。將大鼠放入規(guī)格為200 mm×80 mm×80 mm的透明固定盒中，并將含有溫生理鹽水的2 mL注射器接入導(dǎo)尿管尾部，待大鼠完全清醒后盡快檢測大鼠的內(nèi)臟敏感性。測量結(jié)直腸擴(kuò)張時，緩慢向球囊內(nèi)注溫生理鹽水，使球囊內(nèi)的壓力逐漸增高，記錄大鼠出現(xiàn)腹壁收縮反應(yīng)及腹部、臀部抬高并抬離地面時的容量閾值，需重復(fù)3次該操作，并取平均值。

1.5.4 熒光定量 PCR法檢測結(jié)腸組織PAR-2 mRNA的表達(dá)：稱取大鼠自肛門上6 cm處的結(jié)腸組織50～100 mg，剪碎，放入低溫研磨機(jī)中進(jìn)行組織研磨，用AG RNAex Pro RNA提取試劑盒提取結(jié)腸組織總RNA。用Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板，采用SYBR? Green Pro Taq HS預(yù)混型qPCR試劑盒提供的反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：各基因?qū)?yīng)上下游引物(引物序列見表1)各0.4 μL，2×SYBR? Green Pro Taq HS Premix 10 μL，cDNA模板2.0 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL，最后加RNase free water到20 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 30s；95 ℃ 5s，60 ℃ 30s，40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，運(yùn)用2-△△Ct公式計算目標(biāo)mRNA的相對表達(dá)量。

表1 引物序列

1.5.5 Western blot法檢測結(jié)腸組織 PAR-2蛋白相對表達(dá)量：稱取大鼠自肛門上6 cm處的結(jié)腸組織50～100 mg，加入適量的RIPA裂解液和適量的PMSF溶液，并放入研磨機(jī)內(nèi)進(jìn)行研磨、裂解。4℃、14000 rpm離心15 min，取上清液，得到總蛋白溶液。利用NANODROP RNA質(zhì)量檢測儀進(jìn)行總蛋白濃度測定，經(jīng)過電泳，通過轉(zhuǎn)膜裝置恒流轉(zhuǎn)膜，按照轉(zhuǎn)膜海綿-濾紙-凝膠-PVDF膜(經(jīng)甲醇活化后)-濾紙-轉(zhuǎn)膜海綿的順序，持續(xù)轉(zhuǎn)膜45 min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，TBST溶液中漂洗1 min，后再放入QuickBlock? Western封閉液內(nèi)進(jìn)行約30 min的封閉處理。加入經(jīng)抗體稀釋液稀釋的一抗(PAR-2抗體(兔單克隆抗體)按1∶10000稀釋，TRPV1抗體(兔多克隆抗體)按1∶1000稀釋，GAPDH抗體按1∶1000稀釋)，4 ℃緩慢搖動孵育過夜后，用TBST溶液漂洗3遍，加入1∶20000稀釋的二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG)溶液中室溫孵育1 h，結(jié)束后用TBST溶液漂洗5遍，加入發(fā)光試劑盒中A液與B液，將膜放入化學(xué)發(fā)光成像儀內(nèi)進(jìn)行顯影。顯現(xiàn)結(jié)束后得到的條帶用分析軟件進(jìn)行灰度值測定。以GAPDH為內(nèi)參蛋白，目的蛋白與GAPDH的比值為其相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況比較 造模前，各組大鼠精神狀態(tài)良好，活潑好動，皮毛白凈順滑光澤，眼角口鼻干凈，耳廓呈淡粉色，大便干稀適中。造模結(jié)束后，與對照組相比，模型組和模型電針組的大鼠日常處于易激惹狀態(tài)，弓身豎毛，躲避、畏懼，對周圍動靜十分警惕，進(jìn)食量相對減少，毛色偏黃，較為粗糙無光澤，肛周及尾部可見明顯污穢附著。對各組大鼠在造模與電針干預(yù)前后體重值進(jìn)行比較，如表2所示，造模前各組體重比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；造模后，與對照組相比，對照電針組大鼠體重有所降低，差異不明顯，模型組與模型電針組的大鼠體重都明顯降低(P<0.01)；電針干預(yù)后，與對照組相比，對照電針組大鼠體重有所降低，差異不明顯；與模型組相比，模型電針組大鼠的體重明顯高于模型組(P<0.01)。

表2 各組大鼠體重值比較

2.2 各組大鼠的腹瀉指數(shù)與大便Bristol評分比較 如表3所示，與對照組相比，模型組大鼠的腹瀉指數(shù)與Bristol評分明顯高于對照組(P<0.01)，而對照電針組大鼠的腹瀉指數(shù)、Bristol評分與對照組相比未見有統(tǒng)計學(xué)差異；與模型組比較，模型電針組大鼠的腹瀉指數(shù)、Bristol評分明顯低于模型組(P<0.01)。

表3 各組大鼠大便的Bristol評分和腹瀉指數(shù)

2.3 各組大鼠的內(nèi)臟敏感性評價比較 直結(jié)腸擴(kuò)張(colorectal distension，CRD)容量閾值包括腹部收縮、腹部抬高、臀部抬高的容量閾值，各組大鼠CRD容量閾值比較結(jié)果見表4。與對照組相比，對照電針組的腹部收縮、腹部抬高、臀部抬高的容量閾值比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；模型組大鼠腹部收縮和腹部抬高的容量閾值明顯降低(P<0.01)，模型組大鼠的臀部抬高閾值低于對照組(P<0.05)；與模型組相比，電針組大鼠出現(xiàn)腹部收縮和腹部抬高的容量閾值明顯升高(P<0.05)。

表4 容量閾值

2.4 各組大鼠的腹壁撤退反射(abdominal withdrawal reflex，AWR)評分結(jié)果 如表5所示，與對照組相比，模型組大鼠在1 mL容量時的評分明顯高于對照組(P<0.01)、在1.5 mL容量時的評分也高于對照組(P<0.05)；與模型組比較，模型電針組的評分呈現(xiàn)降低趨勢，電針組大鼠在1 mL容量時的評分低于模型組(P<0.05)、在1.5 mL容量時的評分也明顯低于模型組(P<0.01)。

表5 腹壁撤反射評分

2.5 各組大鼠結(jié)腸中PAR-2的mRNA及蛋白相對表達(dá)量比較 如表6和圖1所示，與對照組相比，模型組大鼠PAR-2的mRNA及蛋白的相對表達(dá)量明顯增多(P<0.01)；與模型組相比，模型電針組大鼠的PAR-2的mRNA及蛋白的相對表達(dá)量均有所降低，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表6 各組大鼠PAR-2的mRNA及蛋白相對表達(dá)量比較

圖1 各組大鼠PAR-2蛋白Western blot電泳圖

3 討論

IBS是一種與多因素相關(guān)的疾病，具有復(fù)雜的潛在發(fā)病機(jī)制，至今尚未有完整、確切的解釋。目前，內(nèi)臟高敏感是對該病的發(fā)病機(jī)制闡述中較普遍的認(rèn)識之一。中醫(yī)學(xué)將IBS-D歸為“泄瀉”“腹痛”的范疇，肝失疏泄、脾胃虛弱是主要病機(jī)[10]。足三里屬胃經(jīng)合穴、胃下合穴，可補(bǔ)中益氣，通過相關(guān)的數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，臨床上針刺治療IBS-D時，足三里穴是使用頻率較高的穴位之一[11]。研究表明，電針足三里穴可明顯糾正偏于正常生理狀態(tài)的胃腸功能抑制狀態(tài)，對胃腸功能起促進(jìn)作用[12]。本實驗結(jié)果顯示，電針組大鼠的腹瀉指數(shù)、Bristol評分明顯降低；CRD容量閾值明顯升高；AWR評分明顯降低，表明電針足三里能降低IBS-D模型大鼠的內(nèi)臟敏感，并改善其腹瀉情況。

隨著IBS生理病理研究的不斷深入，近年來，國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)PAR-2介導(dǎo)的信號通路在其發(fā)病機(jī)制中起到重要影響。PAR-2存在于體內(nèi)多種組織或器官中，其在胃腸道內(nèi)分布較為廣泛，同時胃腸道內(nèi)含有多種能激活PAR-2的蛋白酶，被激活后的PAR-2會產(chǎn)生多種能影響消化系統(tǒng)功能的生物學(xué)效應(yīng)，且被認(rèn)為與多種消化系統(tǒng)疾病有密切的聯(lián)系。已有的研究[13-17]發(fā)現(xiàn)：PAR-2在控制人結(jié)腸黏膜通透性中起著重要作用，PAR-2活性的增加是IBS直腸黏膜通透性增加的原因之一；IBS-D患者的糞便中的蛋白酶活性較高，推斷PAR-2與IBS-D的發(fā)病存在一定的聯(lián)系，并且還發(fā)現(xiàn)當(dāng)外源性的PAR-2激動劑在大鼠體內(nèi)發(fā)生作用時，內(nèi)臟敏感的閾值會呈現(xiàn)降低的趨勢；IBS患者腸組織中PAR-2的表達(dá)量較健康人升高；PAR-2受體信號傳導(dǎo)可能是IBS-D患者中傷害感受器持續(xù)過度興奮的基礎(chǔ)，IBS小鼠模型中PAR-2的激活能增加腸道通透性，并且導(dǎo)致免疫激活和內(nèi)臟超敏反應(yīng)。本實驗結(jié)果顯示，模型組大鼠PAR-2的mRNA及蛋白的相對表達(dá)量明顯增多，而電針可以降低其表達(dá)。由此推測，IBS-D的發(fā)病機(jī)制可能與PAR-2存在密切聯(lián)系，電針足三里穴改善IBS-D模型大鼠的腹瀉及內(nèi)臟高敏感可能與PAR-2的表達(dá)水平降低有關(guān)。而PAR-2及其相關(guān)的信號通路如何在電針過程中發(fā)揮作用，還有待于今后的進(jìn)一步研究。