王 劍 楊文玉 普天彪 李曉花,2*

1.西雙版納版納藥業(yè)有限責(zé)任公司，云南 景洪 666100；2.滇西應(yīng)用技術(shù)大學(xué) 傣醫(yī)藥學(xué)院，云南 景洪 666100

腎茶為唇形科植物Clerodendranthusspicatus(Thunb.)C. Y. Wu的全草，傣醫(yī)應(yīng)用歷史悠久[1-2]。現(xiàn)代藥理學(xué)和化學(xué)研究[3-4]顯示：腎茶中含有黃酮、二萜、酚類、三萜類等化學(xué)成分，具有抗炎、抗菌、利尿、免疫調(diào)節(jié)、改善慢性腎功能衰竭等藥理活性。腎茶袋泡茶(國(guó)藥準(zhǔn)字Z20026660)由云南西雙版納版納藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，是將腎茶切段粉碎成粗粉，過篩，混勻，滅菌后低溫干燥制得，具有清熱解毒、利水通淋的功效，用于膀胱濕熱所致的尿急、尿熱、尿痛，非特異性下尿路感染見上述證候者[5]。

腎茶袋泡茶質(zhì)量控制的文獻(xiàn)報(bào)道較少，僅見王劍等[6]采用薄層色譜法對(duì)腎茶中熊果酸的含量進(jìn)行了改進(jìn)。腎茶袋泡茶現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)WS-11108(ZD-1108)-2002中，包括薄層色譜的定性鑒別方法，采用HPLC法對(duì)熊果酸含量進(jìn)行測(cè)定等方法[5]。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，迷迭香酸(RA)是一種天然存在的羥基化合物，具有抗炎、抗氧化、抗抑郁、抗菌作用和抗病毒的活性[7-8]，是腎茶主要有效成分之一，目前未見以腎茶袋泡茶中迷迭香酸作為含量測(cè)定指標(biāo)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。本項(xiàng)目以腎茶袋泡茶的臨床應(yīng)用為基礎(chǔ)，采用TLC法對(duì)腎茶袋泡茶進(jìn)行定性鑒別，并建立腎茶袋泡茶中迷迭香酸的高效液相色譜法，以期使該制劑具備更好的質(zhì)量可控性，使檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)更加全面和完善，提高現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

A.腎茶生藥；B.腎茶藥材；C.腎茶袋泡茶圖1 腎茶圖

1 儀器與材料

1.1 儀器 1260型高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)；LC-2030型高效液相色譜儀(日本SHIMADZU公司)；DFY-600D型粉碎機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司)；ZF-2三用紫外分析儀(上海安亭電子儀器廠)；XMTD-701型薄層電動(dòng)點(diǎn)樣器(上?？普苌萍加邢薰?ZDHW型調(diào)溫電熱套(河北省黃驊市中興儀器有限公司)；MS-105DU型電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；DK-98-Ⅱ型電熱恒溫水浴鍋(天津泰斯特儀器有限公司)；DFY-600型搖擺式高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司)；島津InertSustain C18液相色譜柱；Agilent 5 TC-C18液相色譜柱。

1.2 藥品與試劑 10批腎茶袋泡茶(西雙版納版納藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)：160803、160805、170131、170901、170903、180610、180701、180704、180911、181004；規(guī)格：每袋裝3 g)；腎茶對(duì)照藥材(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：121326-200502)；迷迭香酸對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院,批號(hào)：111871-201706；純度：90.5%)；硅膠G薄層色譜板(青島譜科分離材料有限公司，批號(hào)：20200421)；純乙腈(Merk)和磷酸(J.T.Baker)為色譜純；鹽酸、乙酸乙酯、三氯甲烷、甲醇、甲酸等均為分析純?cè)噭?，水為超純水?/p>

2 方法與結(jié)果

2.1 外觀性狀 原標(biāo)準(zhǔn)對(duì)腎茶袋泡茶的性狀描述為“本品為袋泡茶，內(nèi)容物為植物莖、葉混合粗粉；氣微香，味微苦”，缺少色澤描述，筆者對(duì)樣品進(jìn)行觀察后，將腎茶袋泡茶的外觀性狀描述修改為“本品為袋泡茶，內(nèi)容物黃褐色至深褐色的粗粉及顆粒；氣微香，味微苦”。

2.2 TLC鑒別[9-11]精密稱取腎茶袋泡茶(批號(hào)：180701)粉末約1.0g，置于圓底燒瓶中，加入20倍量30%甲醇，回流提取60 min，濾過，濾液作為供試品溶液；另取迷迭香酸對(duì)照品，加30%甲醇超聲處理5 min，搖勻，制成50 μg /mL對(duì)照品溶液；30%甲醇作為陰性對(duì)照。照薄層色譜法 (通則 0502) 試驗(yàn)， 吸取上述3種溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-異丙醇-甲酸(10∶2∶2∶0.5) 為展開劑展開，取出晾干，置紫外光燈 (365 nm) 下檢視，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性樣品無(wú)干擾。結(jié)果表明不同批次腎茶袋泡茶中均含有迷迭香酸。TLC色譜圖如圖2所示。

2.3 迷迭香酸的含量測(cè)定[8,12-15]

2.3.1 溶液制備 精密稱取腎茶袋泡茶(批號(hào)：180701)約1.0 g，置于圓底燒瓶中，加入20倍量30%甲醇，稱定質(zhì)量，回流提取60 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，30%甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，得到供試品溶液。取迷迭香酸對(duì)照品10.79 mg，置50 mL容量瓶中，加30%甲醇適量，超聲處理5 min，加30%甲醇至刻度，搖勻，制成195.3 μg /mL對(duì)照品儲(chǔ)備液。乙腈-0.1%磷酸水溶液(20∶80，V/V)為陰性對(duì)照溶液。

1.腎茶對(duì)照藥材；2.迷迭香酸對(duì)照品；3.陰性對(duì)照(30%甲醇)；4～13號(hào)樣品

2.3.2 色譜條件 高效液相色譜儀：Agilent 1260和島津LC-2030；檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器；色譜柱：島津InertSustain C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)和Agilent 5 TC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸水溶液(20∶80，V/V)；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：330 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.3.3 系統(tǒng)適用性及專屬性試驗(yàn) 取陰性對(duì)照溶液(流動(dòng)相)、對(duì)照品溶液和供試品溶液各適量，按照“2.3.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果顯示：腎茶袋泡茶中迷迭香酸的保留時(shí)間約為21.9 min，與其余色譜峰的分離度均大于1.5，基線分離度良好，陰性對(duì)照溶液在供試品和對(duì)照品色譜峰相應(yīng)位置無(wú)干擾色譜峰，本方法系統(tǒng)適用性及專屬性良好。色譜圖如圖3所示。

2.3.4 線性關(guān)系考察 精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液 0.5 mL、1 mL、2 mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL，置25 mL容量瓶中，加30%甲醇稀釋至刻度，搖勻。分別取上述制備的對(duì)照溶液10 μL注入液相色譜中，按“2.3.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定峰面積，以進(jìn)樣量(μg)橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。線形方程為Y=28988.0569967X+3434.4871968(r=0.9999)。迷迭香酸在3.906～78.12μg范圍內(nèi)線性符合要求。結(jié)果如圖4所示。

A. 陰性對(duì)照；B. 對(duì)照品；C.樣品

圖4 迷迭香酸線性曲線圖

2.3.5 中間精密度試驗(yàn) 精密稱取同一批的腎茶袋泡茶(批號(hào)180701)，采用Agilent1260高效液相色譜儀和島津LC-2030高效液相色譜儀，按“2.3.2”項(xiàng)下方法試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果表明，兩個(gè)型號(hào)高效液相色譜儀，兩個(gè)不同操作人員檢測(cè)結(jié)果分別為3.70mg和3.79mg，RSD分別為1.56%和1.45%，表明該方法中間精密度良好，結(jié)果符合要求。

2.3.6 重復(fù)性試驗(yàn) 分別稱取腎茶袋泡茶(批號(hào)：180701)，按照“2.3.1”項(xiàng)下制備方法獲得6個(gè)供試品，按“2.3.2”項(xiàng)下檢測(cè)方法測(cè)定迷迭香酸峰面積，計(jì)算質(zhì)量分?jǐn)?shù)，測(cè)定結(jié)果RSD為1.59%，重復(fù)性符合要求。

2.3.7 加樣回收試驗(yàn) 取已知含量的供試品(批號(hào)：180701)9份，隨機(jī)分為3組，分別加入含有401.2 μg/mL的迷迭香酸對(duì)照品溶液4 mL、5 mL和7 mL后，加30%甲醇補(bǔ)充至20 mL，精密稱定，按“2.3.1”項(xiàng)下樣品溶液制備方法進(jìn)行提取，按“2.3.2”項(xiàng)下檢測(cè)方法進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果表明：本法回收率在98.07%～101.45%之間。平均回收率為99.47%。結(jié)果符合要求。結(jié)果見表1。

表1 迷迭香酸回收率試驗(yàn)

2.3.8 檢測(cè)限與定量限考察 檢測(cè)限和信噪比以3倍和10倍噪聲水平所相當(dāng)?shù)拇郎y(cè)物質(zhì)的量計(jì)算，按照“2.3.2”項(xiàng)下迷迭香酸的檢測(cè)方法對(duì)對(duì)照品溶液進(jìn)樣檢測(cè)，結(jié)果迷迭香酸的檢測(cè)限為195.3 ng /mL，定量限為664.02 ng /mL。

2.3.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取腎茶袋泡茶(批號(hào)：180701)樣品3份，按“2.3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，與對(duì)照品溶液分別于0、3、6、9、12、18、24 h測(cè)定，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)，考察溶液穩(wěn)定性，結(jié)果顯示：RSD為0.57%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.10 耐用性試驗(yàn) 取三份樣品，按“2.3.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行樣品制備，選用Agilent 5 TC-C18色譜柱和島津InertSustain C18色譜柱，按“2.3.2”項(xiàng)下方法測(cè)定含量，比較不同廠家同型色譜柱對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。結(jié)果顯示，用島津InertSustain C18色譜柱和Agilent 5 TC-C18色譜柱所測(cè)的樣品含量均為3.55 mg/g，RSD分別為0.81%和0.96%，兩種品牌的色譜柱對(duì)迷迭香酸的含量測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著影響，本方法耐用性良好。

2.3.11 樣品含量測(cè)定 按“2.3.2”項(xiàng)下檢測(cè)方法測(cè)定10批腎茶袋泡茶，迷迭香酸含量在8.13～11.54 mg/袋之間。平均含量為9.05 mg/袋。

表2 10批次腎茶袋泡茶迷迭香酸含量測(cè)定結(jié)果 (n=2)

續(xù)表2 表2 10批次腎茶袋泡茶迷迭香酸含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法的選擇 在薄層鑒定和含量測(cè)定試驗(yàn)中，筆者分別考察了不同提取方法(超聲提取、回流提取)、不同提取溶劑(10%、30%、50%、70%和100%甲醇-水)、不同液料比(10、20、30、40、50倍50%甲醇)、不同提取時(shí)長(zhǎng)(0.5 h、1 h、1.5 h和2 h)對(duì)腎茶袋泡茶中迷迭香酸提取率的影響，并通過正交試驗(yàn)進(jìn)行了提取工藝優(yōu)化。結(jié)果顯示，采用20倍30%甲醇，回流提取60 min，為腎茶袋泡茶中迷迭香酸的的最佳提取工藝。

3.2 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)性狀描述的改進(jìn) 將原標(biāo)準(zhǔn)中腎茶袋泡茶的性狀“本品為袋泡茶，內(nèi)容物為植物莖、葉混合粗粉；氣微香，味微苦”改為“本品為袋泡茶，內(nèi)容物黃褐色至深褐色的粗粉及顆粒；氣微香，味微苦”，增加了色澤描述，使腎茶袋泡茶的性狀特征更完善。

3.3 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中TLC鑒別項(xiàng)的改進(jìn) 以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(9∶4∶1)、正己烷-乙酸乙酯-甲酸 (3∶10∶0.2)、甲苯-乙酸乙酯-甲酸 -水(5∶4∶0.5∶0.5)、甲苯-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸 (2∶3∶4∶0.5∶2)、環(huán)己烷-乙酸乙酯-異丙醇-甲酸(10∶2∶2∶0.5)，對(duì)展開劑進(jìn)行了篩選，結(jié)果顯示：展開劑為環(huán)己烷-乙酸乙酯-異丙醇-甲酸系統(tǒng)時(shí)，TLC圖譜中斑點(diǎn)清晰，分離度好。在方法學(xué)研究中，分別考察了溫度、濕度及不同廠家薄層板對(duì)迷迭香酸展開情況的影響，結(jié)果顯示，色譜斑點(diǎn)與分離度均符合要求，耐用性良好，確定環(huán)己烷-乙酸乙酯-異丙醇-甲酸(10∶2∶2∶0.5)為腎茶袋泡茶的TLC鑒別條件。

3.4 HPLC含量測(cè)定方法的考察

3.4.1 流動(dòng)相的選擇 通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)資料，筆者主要考察了乙腈-0.1%乙酸(18∶82)，乙腈-0.1%乙酸(20∶80)和乙腈-0.1%乙酸(22∶78)等3種流動(dòng)相對(duì)迷迭香酸出峰時(shí)間、峰形及樣品峰的影響。結(jié)果顯示，乙腈-0.1%磷酸溶液(20∶80)為流動(dòng)相，迷迭香酸的出峰時(shí)間為21.9 min左右、峰形呈正態(tài)分布、分離度好、樣品峰的純度最優(yōu)。

3.4.2 流速的選擇 比較0.8 mL/min、1.0 mL/min和1.2 mL/min下對(duì)迷迭香酸出峰時(shí)間、峰形等的影響。結(jié)果所示，流速為1.0 mL/min時(shí)，樣品中迷迭香酸的保留時(shí)間為21.9 min左右，與其他雜鋒分離度較好；流速越低，保留時(shí)間越長(zhǎng)，流速快則影響迷迭香酸的分離度。綜合以上因素，選擇流動(dòng)相的流速為1.0 mL/min。

3.4.3 柱溫的選擇 比較28 ℃、30 ℃和32 ℃ 3種柱溫條件對(duì)樣品中迷迭香酸含量測(cè)定結(jié)果的影響。結(jié)果顯示，不同溫度條件下所測(cè)的樣品含量范圍為3.81～3.94 mg/g，RSD為1.18%，符合要求，綜合考慮操作條件的可控性，選擇檢測(cè)柱溫為30 ℃。

3.4.4 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 色譜圖和光譜圖的檢測(cè)結(jié)果顯示，迷迭香酸在328 nm、330 nm和332 nm處均有吸收，檢測(cè)結(jié)果的RSD為0.76%，符合要求。當(dāng)檢測(cè)波長(zhǎng)為330 nm時(shí)，色譜圖基線更平穩(wěn)、色譜峰分離度更好，靈敏度更高，因此確定檢測(cè)波長(zhǎng)為330 nm。

3.5 含量限度的擬定 腎茶袋泡茶現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)WS-11108(ZD-1108)-2002中，每袋腎茶以熊果酸(C30H48O3)計(jì)，含量不得少于2.4 mg。為了使腎茶袋泡茶質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)更能與臨床應(yīng)用相結(jié)合，本試驗(yàn)采用HPLC法建立了腎茶袋泡茶中迷迭香酸的檢測(cè)方法。根據(jù)腎茶袋泡茶的處方(腎茶3000 g)和制法(切段，粉碎成粗粉，過篩，混勻，滅菌后低溫干燥，分裝，制成袋泡茶1000袋，即得)，本研究對(duì)10批腎茶袋泡茶進(jìn)行檢測(cè)，迷迭香酸含量范圍為8.13～11.54 mg/袋。平均含量為9.05 mg/袋，根據(jù)10批產(chǎn)品的含量測(cè)定結(jié)果及《中國(guó)藥典》2015版四部通則9000制定原則9101藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則七“原料藥和制劑含量測(cè)定，范圍一般為測(cè)定濃度的80%～120%”，以及公司對(duì)腎茶袋泡茶含量控制要求，暫定本品含量為平均含量的80%，即本品每袋含腎茶以迷迭香酸(C18H16O8)計(jì)，不得少于7.2 mg。

綜上，筆者在腎茶袋泡茶原有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上修訂了性狀描述，改進(jìn)了TLC檢測(cè)條件，并采用HPLC法測(cè)定了迷迭香酸的含量，方法簡(jiǎn)便可行，準(zhǔn)確性、重復(fù)性高，能夠有效地提高腎茶袋泡茶的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，為該制劑的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。