楊曉琪，毛景濤，劉 娟，馬維娜

(1.陜西省森林工業(yè)職工醫(yī)院胸外科,西安 710300；2.兵器工業(yè)五二一醫(yī)院腫瘤科,陜西西安 710065；3.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院，陜西 710061)

肺癌是最常見的一種呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤，是全球癌癥占比最大，死亡率最高的惡性腫瘤，嚴重危害人類生命健康[1]。非小細胞肺癌占肺癌比例高達85%，而患者生存率僅為15%[2]。目前，傳統(tǒng)手術(shù)仍是肺癌的主要治療方法，放、化療作為輔助治療方法。然而，隨治療時間延長、耐藥細胞的出現(xiàn)及其他不良反應(yīng)的發(fā)生，療效并不理想，不能滿足臨床需求。因此，發(fā)掘傳統(tǒng)中藥資源，研究中藥對惡性腫瘤的作用效果及其作用機制具有重要的科學(xué)和臨床意義[3]。

細胞凋亡是一個多種基因參與調(diào)控、高度有序、細胞內(nèi)一系列酶級聯(lián)參與主動的分子調(diào)控的過程[4]。有研究表明，在腫瘤細胞中50%在凋亡機制方面存在缺陷[5]。有研究表明，B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)蛋白家族與細胞凋亡過程密切相關(guān)，已成為治療腫瘤的一個重要靶標[6-8]。同時，有研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)腫瘤是一種細胞周期調(diào)控異常的疾病[9-10]。細胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin dependent kinase，CDK)和細胞周期蛋白(Cyclins)是目前研究最為主要的調(diào)控周期的相關(guān)蛋白[11]，其與細胞的增殖和分化均密切相關(guān)[12-13]。因此，開發(fā)調(diào)控細胞周期與凋亡的藥物對腫瘤的治療至關(guān)重要。

呋喃香豆素是香豆素類化合物的一種，可分為線型呋喃香豆素和角型呋喃香豆素。香豆素因其相對分子質(zhì)量較小，制備工藝簡單，在各個領(lǐng)域應(yīng)用較為廣泛，很多藥理作用被逐漸發(fā)現(xiàn)，尤其是呋喃香豆素的抗腫瘤活性[14]。歐前胡素是典型的呋喃香豆素類化合物，被發(fā)現(xiàn)于傘形科和蕓香科植物中，在天然的藥用植物中分布廣泛，而且在白芷中含量較高。目前，對歐前胡素的藥效學(xué)研究已有一定進展，有研究發(fā)現(xiàn)，其除有抗炎、抗菌、鎮(zhèn)痛，以及對心血管、神經(jīng)系統(tǒng)等作用外，還能抑制多種腫瘤細胞的繁殖、左右藥物代謝酶的活性,是重要的天然活性物質(zhì)[15]。歐前胡素衍生物(IMP-1)為聯(lián)苯型呋喃香豆素類化合物[16]。本研究通過體外細胞實驗對IMP-1抗肺癌作用機制進行初步研究，探索IMP-1對細胞凋亡和周期調(diào)控的影響，旨在為開發(fā)治療肺癌的靶向藥物奠定實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細胞株與試劑

人肺癌細胞A549細胞株購自中科院上海細胞生物學(xué)研究所，RPMI-1640培養(yǎng)基購自上海培源生物科技股份有限公司(批號：L240KJ，含10%血清、100 IU/mL青霉素和鏈霉素，37 ℃，飽和濕度，5% CO2)，胎牛血清購自美國Thermo公司(批號：16140063)，胰酶購自北京索萊寶科技有限公司(批號：T8151)，四甲基偶氮唑鹽(MTT)購自美國Sigma-Aldrich公司(批號：M2003)，二甲基亞砜(DMSO)購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，青霉素、鏈霉素購自華北制藥集團，二喹啉甲酸(bicinchoninic acid assay，BCA)蛋白定量試劑盒購自美國Pierce公司(批號：5345-2018)，異丙醇及甲醇購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司(批號：2892-2010、683-2006)，預(yù)染蛋白分子量標準購自ABclonal公司(批號：3452Q)，超敏增強型化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)化學(xué)發(fā)光底物購自正四柏生物有限公司(批號：4AW011-500)，脫脂奶粉購自伊利公司(批號：050DH0310)，碘化丙定(PI)雙染法細胞凋亡檢測試劑盒及抗體購自美國Proteintech公司(批號：PF00005)，細胞分裂周期基因2(CDC2)抗體(批號：19532-1-AP)、細胞周期蛋白D1(CyclinD1)抗體(批號：60186-1-lg)、細胞周期蛋白E(CyclinE)抗體(批號：11554-1-AP)、髓樣細胞白血病蛋白-1(mcl-1)抗體(批號：16225-1-AP)、B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)抗體(批號：12789-1-AP)、B淋巴細胞瘤-2相關(guān)X蛋白(Bax)抗體(批號：50599-2-lg)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體(批號：60004-1-lg)均購自美國Proteintech公司。

1.2 主要儀器

CO2恒溫培養(yǎng)箱(SANYO MCO-15AC)、倒置顯微鏡(日本Nikon公司)、超凈工作臺(SW-CJ-1F，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)、酶標儀(美國Bio-Rad公司)、流式細胞分析儀(艾森生物有限公司)、冷凍離心機(德國Eppendorf公司)、凝膠成像系統(tǒng)(北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司)等。

1.3 方法

1.3.1細胞增殖測定

取對數(shù)生長期A549細胞考察IMP-1對細胞增殖的影響。將細胞接種于96孔板(180 μL/孔)，放置37 ℃、5% CO2飽和濕度孵育箱中培養(yǎng)24 h。次日加入用無血清無雙抗培養(yǎng)基配制的8個濃度梯度(0.39、0.78、1.56、3.12、6.25、12.50、25.00、50.00 μmol/L)待測藥品——IMP-1，每個濃度設(shè)置5個復(fù)孔。陰性對照為等量培養(yǎng)基未加藥，空白對照為等量無細胞且無血清無雙抗的培養(yǎng)基。加完藥后置于37 ℃、5% CO2飽和濕度孵育箱內(nèi)培養(yǎng)。48 h后取出孔板，在超凈工作臺中進行操作，小心吸出每個孔中的培養(yǎng)基，加入配制好的MTT溶液(200 μL/孔)。在37 ℃、5% CO2飽和濕度孵育箱中繼續(xù)培養(yǎng)，4 h后將96孔板中培養(yǎng)基吸干凈，每孔加入DMSO 150 μL，在搖床上使其混合均勻(15 min)。使用酶標儀在490 nm波長處測定光密度值。

1.3.2細胞周期測定

待細胞生長至對數(shù)期時接種細胞于細胞培養(yǎng)皿中，分別標注陰性、小濃度(1.56 μmol/L)、中濃度(3.12 μmol/L)、大濃度(6.25 μmol/L)，放置37 ℃孵育箱中培養(yǎng)48 h，次日加藥。將細胞消化后收集至10 mL EP管中，1 000 r/min離心5 min，棄培養(yǎng)液，加預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)清洗，1 000 r/min離心5 min。每個EP管中加入1 mL預(yù)冷的70%乙醇，在-20 ℃中放置2 h，1 000 r/min離心5 min，小心吸去乙醇后每管加入1 mL PBS，1 000 r/min離心5 min，棄上清液。室溫條件下每管加1 mL RNA酶(避光操作)，反應(yīng)30 min后1 000 r/min離心5 min，吸出上清液。每管加入PBS 500 μL，以及PI 25 μL染色，使用流式細胞分析儀避光檢測。

1.3.3細胞凋亡測定

待細胞生長至對數(shù)期時接種細胞于細胞培養(yǎng)皿中，分別標注陰性、小濃度(1.56 μmol/L)、中濃度(3.12 μmol/L)、大濃度(6.25 μmol/L)，放置37 ℃孵育箱中培養(yǎng)48 h，次日加藥。將細胞消化后收集至10 mL EP管中，1 000 r/min離心5 min，棄培養(yǎng)液，加預(yù)冷的PBS清洗，1 000 r/min離心5 min。按凋亡試劑盒說明書操作，對細胞進行PI和異硫氧酸熒光素-膜聯(lián)蛋白V(Annexin V-FITC)雙染色。在4 ℃下避光孵育20 min后用流式細胞分析儀檢測。

1.3.4蛋白免疫印跡(Western blot)分析

取對數(shù)生長期的A549細胞接種于細胞培養(yǎng)皿中，分組給藥后加入細胞裂解液進行細胞裂解，抽提蛋白采用BCA試劑盒進行定量檢測，并與適量上樣緩沖液混合，加熱煮沸5 min使蛋白變性。同時按說明書進行聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠配飾，以每孔20 μg蛋白量進行電泳，待電泳完畢后將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，然后采用5%脫脂奶粉封閉1 h。棄封閉液，采用三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽(TBST)漂洗，并孵育一抗4 ℃過夜。采用TBST漂洗后加入二抗室溫振蕩1 h，進行ECL曝光，采用IPP5.0圖像處理軟件進行灰度定量分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 IMP-1對A549細胞增殖的影響

IMP-1化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1A。IMP-1對肺癌細胞(A549、HCC827及NCI-H460)具有明顯的增殖抑制作用且呈劑量依賴關(guān)系，對A549細胞的敏感性最強，因此后續(xù)實驗采用A549細胞作為研究對象。見圖1B。IMP-1對A549細胞生長具有明顯抑制作用，且呈良好的劑量依賴關(guān)系。其半數(shù)抑制濃度為3.62 μmol/L。見圖1C。

A：IMP-1化學(xué)結(jié)構(gòu)式；B：IMP-1抑制肺癌細胞增殖；C：IMP-1抑制A549細胞增殖。圖1 IMP-1抑制肺癌細胞增殖

2.2 IMP-1對A549細胞周期的影響

IMP-1對A549周期變化有明顯影響，隨藥物濃度增大G1期細胞逐漸增多，分別為35.39%(陰性)、39.11%(1.56 μmol/L)、43.92%(3.12 μmol/L)、47.66%(6.24 μmol/L)。見圖2。表明IMP-1可阻滯細胞于G1期，從而延長細胞周期，抑制細胞增殖。

A：細胞周期流式;B:細胞周期流式定量。圖2 IMP-1對A549細胞周期的調(diào)控作用

2.3 IMP-1對A549細胞周期相關(guān)蛋白的影響

IMP-1作用于A549細胞后明顯下調(diào)CyclinE、CyclinD1、CDC2的表達水平。見圖3。

A：周期相關(guān)蛋白Western blot條帶;B:CDC2定量;C:CyclinD1定量;D:CyclinE定量;*：P<0.05;**:P<0.001，與陰性組比較。圖3 IMP-1對A549細胞周期相關(guān)蛋白表達的影響

2.4 IMP-1對A549細胞凋亡的影響

IMP-1對A549細胞具有明顯誘導(dǎo)凋亡的作用，且隨藥物濃度遞增細胞凋亡率增多。見圖4。

圖4 IMP-1對A549細胞凋亡的調(diào)控作用

2.5 IMP-1對凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

IMP-1作用于A549細胞后明顯下調(diào)抗凋亡蛋白——Mcl-1、Bcl-2的表達水平，上調(diào)促凋亡蛋白——Bax的表達水平。見圖5。

A：凋亡蛋白Western blot條帶;B:Mcl-1定量;C:Bcl-2定量;D:Bax定量;*：P<0.05;**:P<0.001，與陰性組比較。圖5 IMP-1對A549細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

3 討 論

肺癌是一種常見的惡性腫瘤，發(fā)病率及死亡率逐年增加，嚴重威脅人類身體健康[17]。前期文獻報道了歐前胡素具有抗腫瘤作用，為進一步研究其機制，本研究對其結(jié)構(gòu)進行了優(yōu)化，得到其衍生物——IMP-1，進而進行了IMP-1抗肺癌作用的初步研究。采用MTT法進行初篩后結(jié)果顯示，IMP-1對A549細胞增殖抑制效果明顯，且呈濃度依賴性。

細胞周期異?？蓪?dǎo)致腫瘤細胞無限增殖，調(diào)控參與細胞周期的相關(guān)蛋白能抑制腫瘤細胞的活性，并阻滯腫瘤細胞的無限增殖，達到治療腫瘤的目的[18]。本研究結(jié)果顯示，IMP-1對A549周期變化具有明顯影響，隨藥物濃度增大G1期細胞逐漸增多，表明IMP-1可阻滯細胞于G1期，從而延長細胞周期，抑制細胞增殖。CyclinD1為G1期進展的限速調(diào)節(jié)因子，CyclinD1表達水平下降可阻滯細胞于G1期；CyclinE是細胞周期從G1期轉(zhuǎn)向S期的重要蛋白，其表達水平減少可阻滯細胞由G1期進入S期；CDC可與CyclinA、CyclinB結(jié)合控制S期至G2期和G2期至M期2個控制點，因此，CDC表達減少，抑制細胞從S期至G2期和G2期至M期。本研究Western blot檢測結(jié)果顯示，IMP-1可下調(diào)CyclinD1、CyclinE、CDC2的表達水平，從而抑制細胞增殖。

凋亡過程的紊亂與腫瘤的發(fā)生具有直接或間接的關(guān)系，由于腫瘤細胞無法對其生長進行正常調(diào)控，導(dǎo)致無限增殖[19]。本研究結(jié)果顯示，IMP-1可有效誘導(dǎo)A549細胞凋亡，且隨給藥濃度增加細胞凋亡比例依次上升。Bcl-2蛋白家族是細胞凋亡相關(guān)內(nèi)源性線粒體通路的關(guān)鍵蛋白，主要包括促凋亡蛋白——Bax、Bcl-2相關(guān)K蛋白(Bcl-2 associated K protein，BAK)等和抗凋亡蛋白——Bcl-2、Mcl-1等[20]。本研究Western blot檢測結(jié)果顯示，IMP-1可下調(diào)抗凋亡蛋白——Mcl-1、Bcl-2的表達水平，上調(diào)促凋亡蛋白——Bax的表達水平，從而誘導(dǎo)細胞凋亡。

綜上所述，IMP-1通過下調(diào)CyclinD1、CyclinE、CDC2蛋白的表達水平，阻滯A549細胞于G1期；同時，通過下調(diào)抗凋亡蛋白——Mcl-1、Bcl-2蛋白的表達水平，上調(diào)促凋亡蛋白——Bax蛋白的表達水平誘導(dǎo)細胞凋亡，從而抑制肺癌細胞A549的增殖。本研究結(jié)果為系統(tǒng)研究IMP-1抗腫瘤作用奠定了基礎(chǔ)。