劉瑞廷，田利飛，王國榮△，劉 昌，白繼蓉，邱 健，閆立昆，李小軍，王小強(qiáng)

(1.陜西省人民醫(yī)院普外一科，西安 710068；2.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科，西安 710068；3.美國石溪大學(xué)醫(yī)學(xué)中心病理科，紐約 11777)

Y-box結(jié)合蛋白家族從微生物到脊椎動物均具有高度保守性核酸結(jié)合區(qū)域，稱為冷休克區(qū)域，多項(xiàng)研究表明，Y-box家族成員[包括Y-box binding蛋白-1和DNA結(jié)合蛋白A(DNA binding protein A，dbpA)]在基因調(diào)控中具有至關(guān)重要的作用[1-2]。dbpA表達(dá)水平與腫瘤進(jìn)展相關(guān)，有研究證實(shí)，dbpA在胃癌發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了積極作用[3]，dbpA可能參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。眾所周知，結(jié)直腸癌是世界范圍內(nèi)最嚴(yán)重的惡性腫瘤之一[4]。結(jié)直腸癌的發(fā)生通常與癌基因和抑癌基因失衡有關(guān)[5]。最近有研究表明，dbpA在結(jié)直腸癌組織樣品和SW620細(xì)胞株中明顯過表達(dá)[6]，即與結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖相關(guān)。本研究采用基因芯片技術(shù)探討dbpA沉默的SW620細(xì)胞中的基因表達(dá)譜。通過基因本體 (gene ontology，GO)和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)途徑對結(jié)直腸癌的dbpA潛在分子機(jī)制進(jìn)行GO富集分析，希望通過尋找dbpA介導(dǎo)的基因用于進(jìn)一步研究更有效地治療結(jié)直腸癌的藥物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1主要試劑、儀器設(shè)備

人基因表達(dá)譜芯片(Affymetrix)包括Agilent RNA 6000 Nano Kit、GeneChip 3′IVT Express Kit、GeneChip Hybridization Wash and Stain Kit、Thremo Nanodrop 2000、Aglient 2100 Bioanalyzer、GeneChip Hybridization Oven 645、GeneChip Fluidics Station 450、GeneChip Scanner 3000等。吉凱基因包括Thremo、Agilent、affymetrix、Thremo、Agilent、affymetrix、affymetrix、affymetrix等。

1.1.2主要細(xì)胞系

人結(jié)直腸癌細(xì)胞系LoVo、SW480、SW620、RKO、HT-29、DLD-1、SW1463和人結(jié)直腸黏膜上皮細(xì)胞系FHC細(xì)胞委托吉凱基因購自ATCC細(xì)胞庫；委托吉凱基因構(gòu)建慢病毒載體dbpA-短發(fā)夾RNA (short hairpin RNA，shRNA)-1轉(zhuǎn)染SW620細(xì)胞。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)

取液氮中凍存的人結(jié)直腸癌細(xì)胞系LoVo、SW480、SW620、RKO、HT-29、DLD-1、SW1463和人結(jié)直腸黏膜上皮細(xì)胞系FHC立即置37 ℃恒溫水浴箱中快速解凍，隨后在超凈工作臺內(nèi)將解凍的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中，并加入10 mL RPMI-1640完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)，1 000 r/ min離心5 min，棄上清液，用培養(yǎng)基重懸后倒入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中隔天換液連續(xù)培養(yǎng)10 d。

1.2.2構(gòu)建慢病毒載體

在dbpA shRNA序列的設(shè)計及合成后進(jìn)行dbpA-shRNA雙鏈模板合成，慢病毒載體雙酶切，質(zhì)粒的純化及割膠回收，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，抽提重組質(zhì)粒，進(jìn)行病毒包裝、濃縮和滴度測定。

1.2.3慢病毒載體dbpA-shRNA-1轉(zhuǎn)染SW620細(xì)胞

將生成狀態(tài)良好的SW620細(xì)胞鋪到96孔板中，細(xì)胞密度為5×103/孔。12 h后換液，每孔先加入90 μL無血清培養(yǎng)基，同時將病毒原液冰上解凍，取10 μL于無菌EP管中按上述操作梯度稀釋后加入到96孔板中，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，并更換培養(yǎng)基。72 h后熒光顯微鏡下觀察熒光，確定最佳感染復(fù)數(shù)值(病毒顆粒數(shù)/細(xì)胞數(shù))。實(shí)驗(yàn)分組為：正常細(xì)胞對照組(CON組)；陰性對照細(xì)胞組(NC組)；RNA干擾細(xì)胞組(KD組)。

1.2.4cDNA探針制備及雜交

RNA樣品進(jìn)行質(zhì)控分析后采用GeneChip 3′IVT Express Kit 進(jìn)行第一鏈的合成得到cDNA，再進(jìn)一步通過二鏈的合成得到雙鏈DNA。將獲得的DNA模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后得到帶有生物素標(biāo)記的擴(kuò)增RNA。對擴(kuò)增RNA進(jìn)行純化和片段化后與芯片探針進(jìn)行雜交。洗染芯片，進(jìn)行圖片與數(shù)據(jù)的分析處理。

1.2.5基因表達(dá)的定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription- polymerase chain reaction，RT-PCR)驗(yàn)證分析

采用定量RT-PCR檢測3份樣品特異性引物和探針隨機(jī)選自10個有顯著差異表達(dá)的基因(CXCL1、VLDLR、ACVR2B、EREG、ASNS、WNT11、CEACAM6、CD24、FGFBP1、SERPINF1等)。cDNA的合成采用隨機(jī)引物上標(biāo)Ⅱ逆轉(zhuǎn)錄酶。擴(kuò)增條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s 30個循環(huán)。采用軟件Primer 5.0進(jìn)行引物設(shè)計。引物的目標(biāo)基因見表1。GAPDH為PCR反應(yīng)中的cDNA內(nèi)參控制。結(jié)果計算采用2-ΔΔCt法。

表1 用于微陣列基因表達(dá)驗(yàn)證的引物

1.2.6數(shù)據(jù)處理及分析

通過圖像分析軟件對圖像進(jìn)行定位和排列，對雜交點(diǎn)進(jìn)行確定，對背景噪音進(jìn)行過濾處理，根據(jù)chi-suqared test對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析找到有差異的基因進(jìn)行分析。基因表達(dá)有顯著差異的篩選標(biāo)準(zhǔn)為必須符合 |FC| >2，且P<0.05。利用WEGO分析工具對上調(diào)倍數(shù)小于2及大于2的基因功能進(jìn)行聚類分析，并對富集的基因進(jìn)行KEGG細(xì)胞信號通路分析，找到關(guān)鍵的調(diào)節(jié)基因和涉及的通路。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 RNA質(zhì)檢結(jié)果

5S、18S、28S 3條帶出現(xiàn)，說明已提出RNA。見圖1。5S條帶較模糊，在膠的最前端，剩余的2條帶均沒有觀察到彌散現(xiàn)象的出現(xiàn)，28S核糖體RNA亮度大約是18S核糖體RNA亮度的2倍，并且加樣孔附近沒有條帶表明產(chǎn)物中未混有DNA，說明RNA沒被降解。所抽提的組織或細(xì)胞總RNA質(zhì)量濃度均在900 ng/μL以上，A260/A280 1.8～2.0,說明濃度及純度符合實(shí)驗(yàn)要求。RNA完整度(RIN)值均在9以上，并且除5S、18S、28S 3個峰值外，未檢測到其他雜峰。見圖2、表2。說明RNA樣品的質(zhì)量檢測結(jié)果符合實(shí)驗(yàn)要求。

圖1 RNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

圖中編號對應(yīng)表2中樣本編號。圖2 Agilent2000 評價RNA質(zhì)量結(jié)果

表2 RNA質(zhì)檢結(jié)果報告

2.2 差異基因的芯片數(shù)據(jù)分析

dbpA敲除后對SW620細(xì)胞基因表達(dá)水平產(chǎn)生了很大影響?；蛐酒瑱z測差異表達(dá)的基因有578條，其中181條上調(diào)，397條下調(diào)。顯著上調(diào)60個基因，顯著下調(diào)60個基因，顯著上調(diào)基因包括CFL2、C12orf39、EREG、SESN2、CXCL3、CXCL1、VLDVR、DDIT4、INHBE等。顯著下調(diào)基因包括PRDM10、PCDH19、SRSF8、FGFBP1、TFF2、MTDH、TCF7、EHHADH、WDR77、CEACAM6等。

2.3 RT-PCR驗(yàn)證結(jié)果

KD組檢測基因mRNA表達(dá)水平與NC組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。而且這種變化趨勢與基因芯片分析結(jié)果一致，證明基因芯片分析結(jié)果是可靠的。

圖3 RT-PCR分析結(jié)果

2.4 GO分析

差異基因共分為3個類別，即細(xì)胞成分、分子功能、生物過程。dbpA敲除后SW620細(xì)胞中與腫瘤形成有關(guān)的通路主要與生物過程有關(guān)。

2.5 差異基因深入分析

2.5.1通路分析

與腫瘤形成有關(guān)的通路包括絲裂原活化蛋白激酶信號通路、癌癥途徑、NOD樣受體信號通路、趨化因子信號通路、粘著斑、基底細(xì)胞癌、Wnt信號通路等。

2.5.2基因網(wǎng)絡(luò)圖

有10個基因表達(dá)水平下降(FASLG、PDGFA、FGF18、MAP3K7、FGF3、CSDA、NF1、RAP1A、HSPA1A、LAMTOR3等)，4個基因表達(dá)水平上升(DUSP5、PRAS2、CDC42、DUSP2等)。dbpA與MAPK信號通路相關(guān)性最大。見圖4。

綠色代表基因芯片下調(diào)基因，紅色代表基因芯片上調(diào)基因，灰色代表系統(tǒng)添加的關(guān)聯(lián)基因；圓點(diǎn)越大KD組和NC組基因表達(dá)差異越大。圖4 基因網(wǎng)絡(luò)圖

2.6 下游基因Western blot驗(yàn)證

綜合以上生物信息學(xué)分析，推測目的基因dbpA可能通過調(diào)節(jié)以上基因的表達(dá)在結(jié)直腸癌中發(fā)揮功能，因此，選擇KEGG_MAPK_SIGNALING_PATHWAY 通路中的5個相關(guān)基因，即RAPIA、TAK1(MAP3K7)、DUSP5、CDC42、ZAK進(jìn)行Western blot驗(yàn)證。DUSP5表達(dá)水平在KD組明顯上調(diào)(P<0.05)，RAP1A、TAK1、ZAK在KD組表達(dá)水平下降，RAP1A、TAK1下降明顯(P<0.05)。見圖5。與預(yù)期結(jié)果相符。CDC42在SW620細(xì)胞中檢測到目的條帶，KD組相對于NC組有所下調(diào)，與預(yù)期結(jié)果不符。

a：P<0.05，與NC組比較。圖5 Western blot灰度分析

3 討 論

基因芯片分析方法已廣泛用于越來越多的基因分析領(lǐng)域[7]。以往文獻(xiàn)報道已通過微矩陣方法證實(shí)了dbpA敲除后對人類肝癌形成有很大的關(guān)系[8]。本研究結(jié)果顯示，dbpA被敲除后在SW620細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)CFL2是上調(diào)表達(dá)最顯著的基因，CFL2是普遍存在于細(xì)胞內(nèi)的小蛋白，并對癌細(xì)胞的遷移和侵襲具有重要的調(diào)控作用。EREG屬上皮生長因子家族，以往有研究表明，EREG的表達(dá)與惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的分化、遷移和黏附具有顯著的相關(guān)性[9]。SESN2作為調(diào)解p53的SESN2家族一員，在自噬信號通路中具有重要作用。以往有文獻(xiàn)報道，ESN2的下調(diào)與結(jié)直腸癌患者的不良預(yù)后有關(guān)，并可作為癌癥治療的一個新的靶點(diǎn)[10]。CXCL3、CXCL1在不同類型的腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲中均扮演著重要角色[11-12]。VLDLR作為體內(nèi)能量的來源，主要功能是調(diào)節(jié)脂肪酸代謝。DDIT4也稱為REDD1，在DNA損傷和細(xì)胞內(nèi)的壓力增大時會顯著上調(diào)，并參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲[13]。INHBE作為轉(zhuǎn)化生長因子β超家族的一員，參與了調(diào)節(jié)人類腫瘤的形成過程[14]。高表達(dá)的組織蛋白酶抑制劑CSTA在細(xì)胞的生長、分化和黏附中具有重要作用，并可在肺癌[15]、鼻咽癌[16]的發(fā)生中起重要作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，dbpA敲除后SW620細(xì)胞中C12orf39表達(dá)水平上調(diào)了6.9倍之多。在此之前并未有C12orf39參與腫瘤形成的相關(guān)文獻(xiàn)報道。

在397個顯著下調(diào)的基因中，PRDM10被認(rèn)為是抑制未分化多型瘤細(xì)胞遷移的重要腫瘤抑制因子。PCDH19被認(rèn)為是腫瘤抑制因子，并且與膠質(zhì)癌患者的不良預(yù)后有關(guān)[17]。SRSF8作為SR蛋白家族一員，在誘導(dǎo)大腸癌細(xì)胞周期停滯和凋亡中具有重要作用。FGFBP1與胚胎期血管滲透性的形成有關(guān)[18]，并在人類腫瘤發(fā)生中增強(qiáng)血管生成的活性[19]。TFF2作為胃黏膜分泌的小肽段，在結(jié)直腸癌的發(fā)生中表達(dá)水平顯著上調(diào)[20]。MTDH作為重要的致癌基因通過調(diào)節(jié)信號傳導(dǎo)通路參與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程[21]。有相關(guān)文獻(xiàn)報道，TCF7與結(jié)直腸癌患者的不良預(yù)后有關(guān)。WDR77/p44作為類固醇受體共激活劑在卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展過程中具有調(diào)節(jié)激素分泌的作用[22]。CEACAM6在人類腫瘤細(xì)胞的遷移和血管生成過程中也具有調(diào)節(jié)作用[23-24]。

本研究發(fā)現(xiàn)，dbpA沉默是主要原因用于改變sw620細(xì)胞系的整體基因表達(dá)譜。dbpA可能會通過激活MAPK促進(jìn)結(jié)直腸癌發(fā)展的信號通路，可為尋找結(jié)直腸癌治療的新靶點(diǎn)提供可靠的證據(jù)。有研究已證實(shí)，CDC42的激活與侵襲性相關(guān)轉(zhuǎn)移、細(xì)胞分裂和各種癌癥的進(jìn)展，如黑色素瘤、結(jié)直腸癌和乳腺癌有關(guān)[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，dbpA敲除后MAPK信號通路中的相關(guān)基因RAP1A、TAK1(MAP3K7)、DUSP5、CDC42、WNT11表達(dá)水平均發(fā)生了顯著變化，與相關(guān)研究結(jié)果一致[26]。因此，推測結(jié)直腸癌中CDC42下調(diào)dbpA沉默更有說服力和合理性。通過GO和KEGG富集分析進(jìn)一步證明有MAPK信號通路等8個KEGG通路參與了dbpA調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌發(fā)展的過程。為驗(yàn)證此假設(shè)，還需要進(jìn)一步在多細(xì)胞和動物實(shí)驗(yàn)中研究揭示dbpA下調(diào)通路之間的關(guān)系及CDC42在結(jié)直腸癌發(fā)展中的作用。