周 迪，敖 葉，蔣桂榮，趙忠海，李 俊，楊 蓉，龔 菲，陳昌雪，沈 銀，李 輝

(1.貴州省種畜禽種質(zhì)測定中心，貴陽 550018；2.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽 550025；3.遵義市畜牧漁業(yè)站，遵義 563000)

據(jù)國家統(tǒng)計(jì)局官方網(wǎng)站發(fā)布的最新統(tǒng)計(jì)公報(bào)顯示，2021年全國肉類總產(chǎn)量8 887萬t，其中禽肉產(chǎn)量2 380萬t，同比增長0.8%，占肉類產(chǎn)量26.78%，僅次于豬肉59.59%的占比；禽蛋產(chǎn)量3 409萬t[1]。因此，禽類肉蛋產(chǎn)品有著良好的發(fā)展前景。通常情況下，家禽的經(jīng)濟(jì)價(jià)值主要體現(xiàn)在屠宰性能和繁殖性能，產(chǎn)肉性能則是屠宰性能的另一種表現(xiàn)形式，然而產(chǎn)肉性能又與體重、體尺性狀密不可分。肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2C(myocyte enhancer factor 2C,MEF2C)基因是MEF2基因家族一員，在肌肉沉積過程中扮演著重要角色，能夠與大多數(shù)肌肉特異基因的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子直接結(jié)合，從而啟動(dòng)或增強(qiáng)相關(guān)基因的表達(dá)[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)，MEF2C基因發(fā)生突變，會使人群增加患2型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)[4]；MEF2C基因表達(dá)異常可增加人體患急性淋巴細(xì)胞白血病的可能[5]；MEF2C基因部分或完全缺失會使機(jī)體的生長發(fā)育嚴(yán)重遲緩[6]；MEF2C基因與南江黃山羊的生長發(fā)育具有密切關(guān)系[7]；MFE2C基因可通過結(jié)合肌肉生長抑制素(myostatin,MSTN)啟動(dòng)子的相關(guān)位點(diǎn)來調(diào)節(jié)肌纖維類型相互轉(zhuǎn)換，實(shí)現(xiàn)對肌肉的正常生長及發(fā)育調(diào)控[8]；MSTN基因啟動(dòng)子與MEF2C基因同時(shí)參與了牛肌肉生長和分化的調(diào)控[9]；MEF2C基因5′-UTR變異可導(dǎo)致機(jī)體功能缺失從而出現(xiàn)嚴(yán)重的發(fā)育障礙[10]。然而目前關(guān)于MEF2C基因的研究主要集中在人類醫(yī)學(xué)以及其他模式生物和大型家畜上，對于雞的研究鮮見報(bào)道。黔東南小香雞是貴州省獨(dú)有的地方家禽品種，具有耐粗飼、抗逆性強(qiáng)、肉質(zhì)優(yōu)良、營養(yǎng)豐富等優(yōu)點(diǎn)，但由于群體數(shù)量偏少，加之缺少科學(xué)的選育方案，群體近交頻繁，導(dǎo)致黔東南小香雞近交衰退現(xiàn)象日趨明顯[11-13]。鑒于此，本研究以黔東南小香雞為研究對象，選取MEF2C為候選基因，通過篩選試驗(yàn)群體中單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)位點(diǎn)，并與黔東南小香雞的體重、體尺指標(biāo)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，以期獲得具有遺傳價(jià)值的標(biāo)記位點(diǎn)，為黔東南小香雞保種、育種提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

300日齡健康黔東南小香雞由貴州省榕江縣小香雞保種場提供，其中母雞146只、公雞105只，自由飲水和采食，翅靜脈采血，EDTA抗凝，冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室，―20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｈ后w體重、體尺指標(biāo)測量按照《家禽生產(chǎn)性能名詞術(shù)語和度量統(tǒng)計(jì)方法》(NY/T 823―2004)進(jìn)行。

血液基因組DNA提取試劑盒、2×TaqMasterMix、DL2000 DNA Marker、GoldView Ⅰ型核酸染料均購自上海索萊寶生物科技有限公司。

1.2 基因組DNA提取

采用血液基因組DNA提取試劑盒對血樣進(jìn)行DNA提取，利用微量紫外分光光度計(jì)進(jìn)行DNA純度和濃度檢測，鑒定合格的樣品于―20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設(shè)計(jì)及合成

根據(jù)GenBank中雞MEF2C基因預(yù)測序列(登錄號:NC_052572.1)，利用Primer Premier 5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)20對特異性引物用于擴(kuò)增MEF2C基因全部外顯子區(qū)域，引物信息見表1。引物均由安徽通用生物系統(tǒng)有限公司合成。

表1 引物信息

1.4 PCR擴(kuò)增及測序

PCR反應(yīng)體系30 μL：2×TaqMasterMix 15 μL，上、下游引物各2 μL，DNA 2 μL，ddH2O 9 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，退火30 s(退火溫度見表1)，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min；4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，電壓130 V，時(shí)間20 min。對鑒定合格的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送往安徽通用生物系統(tǒng)有限公司進(jìn)行直接測序，測序結(jié)果利用DNAStar程序進(jìn)行比對，并用GenBank上公布的參考序列(登錄號：NC_052572.1)進(jìn)行校正。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

利用Excel 2010對生長數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，利用SPSS 18.0軟件中一般線性模型(GLM)、非配對等方差t檢驗(yàn)方法對不同SNPs位點(diǎn)各基因型與雞的體重、體尺性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P<0.05為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測

利用20對特異性引物擴(kuò)增MEF2C基因全部外顯子區(qū)域，1.2%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度與預(yù)期大小一致，條帶清晰明亮，可進(jìn)行下一步試驗(yàn)，部分結(jié)果見圖1。

M，DL2000 DNA Marker；1～3，MEF2C-18引物PCR擴(kuò)增結(jié)果；4～6，MEF2C-19引物PCR擴(kuò)增結(jié)果；7～9，MEF2C-20引物PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 SNP位點(diǎn)分析

利用DNAStar程序?qū)y序結(jié)果進(jìn)行比對，結(jié)果在黔東南小香雞MEF2C基因外顯子12中發(fā)現(xiàn)3個(gè)SNPs，在第1 819 bp處發(fā)生T→C突變，命名為g.1819 T>C，導(dǎo)致第607位氨基酸由異亮氨酸突變?yōu)樘K氨酸，存在3種基因型：TT、CC、TC(圖2A)；在第2 426 bp處發(fā)生T→C突變，命名為g.2426 T>C，導(dǎo)致第809位氨基酸由異亮氨酸突變?yōu)樘K氨酸，存在2種基因型：TT和CC(圖2B)；在第2 543 bp處發(fā)生C→T突變，命名為g.2543 C>T，導(dǎo)致第848位氨基酸由丙氨酸突變?yōu)槔i氨酸，存在2種基因型：TT和CC(圖2C)。

A，g.1819 T>C；B,g.2426 T>C；C,g.2543 C>T

2.3 遺傳學(xué)分析

由表2可知，g.1819 T>C、g.2426 T>C和g.2543 C>T位點(diǎn)的優(yōu)勢基因型分別為CC、CC和TT，優(yōu)勢等位基因分別為C、C和T；χ2檢驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3個(gè)SNPs位點(diǎn)在黔東南小香雞群體中均偏離Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P>0.05)。

表2 MEF2C基因SNPs位點(diǎn)基因型頻率及基因頻率

2.4 MEF2C基因多態(tài)性與黔東南小香雞體重、體尺性狀的關(guān)聯(lián)分析

由表3可知，g.1819 T>C位點(diǎn)TC基因型個(gè)體體斜長、胸深和脛圍均極顯著高于TT和CC基因型(P<0.01)，CC基因型個(gè)體胸深和脛圍顯著高于TT基因型個(gè)體(P<0.05)；TC基因型個(gè)體體重極顯著高于TT基因型(P<0.01)，顯著高于CC基因型(P<0.05)；TC基因型個(gè)體脛長顯著高于TT和CC基因型(P<0.05)，TT和CC基因型之間差異不顯著(P>0.05)；TC基因型龍骨長顯著高于TT基因型(P<0.05)，與CC基因型差異不顯著(P>0.05)。g.2426 T>C位點(diǎn)TT基因型個(gè)體脛圍極顯著高于CC基因型(P<0.01)，其余性狀指標(biāo)在兩種基因型間差異均不顯著(P>0.05)。g.2543 C>T位點(diǎn)CC基因型個(gè)體脛圍極顯著高于TT基因型(P<0.01)，其余性狀指標(biāo)在兩種基因型間差異均不顯著(P>0.05)。通過對比分析發(fā)現(xiàn)，g.2426 T>C和g.2543 C>T位點(diǎn)互為連鎖平衡位點(diǎn)。

表3 MEF2C基因多態(tài)性與黔東南小香雞體重、體尺性狀的關(guān)聯(lián)分析

3 討 論

MEF2C基因是一個(gè)廣譜表達(dá)基因，在動(dòng)物機(jī)體的多個(gè)組織中均能檢測到表達(dá)，尤其是肌肉組織中[14]。王琴[15]研究報(bào)道，MEF2C基因在山羊多個(gè)組織中均能檢測到表達(dá)，且存在4種不同的轉(zhuǎn)錄本。邱進(jìn)等[16]研究指出，MEF2C基因啟動(dòng)子區(qū)多態(tài)性造成人獲得性先天性心臟病的可能性增大。楊華婷等[17]研究報(bào)道，興義鴨MEF2C基因啟動(dòng)子區(qū)的突變可能會使轉(zhuǎn)錄因子及結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生改變，從而導(dǎo)致屠宰性狀受到影響；興義鴨MEF2C基因存在2種可變剪切體，且在腿肌和胸肌中的表達(dá)量不隨日齡的增加而升高[18-19]。展召陽[20]研究顯示，MEF2C基因多態(tài)性對黃牛的體重、體長、體高、胸圍、坐骨端寬等多個(gè)性狀存在顯著影響。沈并兵[21]研究報(bào)道，在南江黃羊MEF2C基因多個(gè)外顯子中存在多個(gè)SNPs位點(diǎn)，且對山羊生長性狀有顯著影響。因此，無論是MEF2C基因的啟動(dòng)子區(qū)還是其他區(qū)域的突變，都對動(dòng)物機(jī)體存在著一定的影響。本研究利用PCR擴(kuò)增技術(shù)獲得了黔東南小香雞MEF2C基因全部外顯子序列，并從中發(fā)現(xiàn)了3個(gè)SNPs，與體重、體尺性狀關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明，g.1819 T>C位點(diǎn)TC基因型對黔東南小香雞的體重及體尺性狀多個(gè)指標(biāo)存在極顯著或顯著影響，而g.2426 T>C和g.2543 C>T位點(diǎn)僅對脛圍有極顯著影響，本研究結(jié)果與前人研究結(jié)果有一定的相似性，說明MEF2C基因多態(tài)性確實(shí)對黔東南小香雞體重、體尺指標(biāo)有影響，這3個(gè)SNPs可以作為黔東南小香雞輔助選育參考位點(diǎn)，尤其是g.1819 T>C位點(diǎn)。

趙忠海[22]研究報(bào)道，在興義鴨MEF2C基因中存在多個(gè)突變位點(diǎn)，但未詳細(xì)介紹這些突變位點(diǎn)所在的具體外顯子。王興東等[23]研究報(bào)道，牦牛MEF2C基因與普通牛相比存在2個(gè)堿基變異和一段24 bp缺失，且2個(gè)堿基變異均引起了所編碼氨基酸的改變。Juszczuk-Kubiak等[24]對不同牛品種的MEF2C基因多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行篩選時(shí)，僅在啟動(dòng)子及內(nèi)含子區(qū)域發(fā)現(xiàn)5個(gè)SNPs位點(diǎn)。展召陽[20]研究報(bào)道，在秦川牛、郟縣紅牛、德南牛和夏郟牛4個(gè)黃牛品種中均僅在MEF2C基因內(nèi)含子區(qū)發(fā)現(xiàn)4個(gè)SNPs位點(diǎn)。師新彩[25]在興義鴨MEF2C基因的外顯子中未發(fā)現(xiàn)多態(tài)位點(diǎn)。本研究中，僅在黔東南小香雞外顯子12中發(fā)現(xiàn)3個(gè)SNPs，其余外顯子中均未發(fā)現(xiàn)，推測MEF2C基因外顯子區(qū)域的保守性較強(qiáng)；通過χ2檢驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3個(gè)SNPs位點(diǎn)均偏離Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，這可能是人為過度干預(yù)黔東南小香雞品種選育，導(dǎo)致品種間長期頻繁近交，造成群體間遺傳距離較近，進(jìn)而種間樣本數(shù)量較小，也有可能是黔東南小香雞在獨(dú)特的生長環(huán)境中經(jīng)過自然選擇進(jìn)化的結(jié)果。但無論是哪種原因所致，加強(qiáng)對地方品種的保護(hù)、開發(fā)和研究顯得尤為重要，今后本課題組將進(jìn)一步圍繞黔東南小香雞核心主產(chǎn)區(qū)，加大樣本量進(jìn)行深入研究，進(jìn)一步豐富黔東南小香雞MEF2C基因研究成果，為該品種的保護(hù)、開發(fā)和利用提供理論支撐。

4 結(jié) 論

黔東南小香雞MEF2C基因外顯子12中存在3個(gè)SNPs位點(diǎn)：g.1819 T>C、g.2426 T>C和g.2543 C>T，對黔東南小香雞體重、體尺性狀均存在一定的影響，其中g(shù).1819 T>C位點(diǎn)可以作為黔東南小香雞分子標(biāo)記輔助選育參考位點(diǎn)。