彭彩淳，李斌強(qiáng)，王野影，粟海軍

(1.貴州大學(xué)林學(xué)院，貴陽 550025；2.貴州大學(xué)，生物多樣性與自然保護(hù)研究中心，貴陽 550025；3.貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴陽 550025)

野豬(Susscrofa)隸屬于偶蹄目(Artiodactyla)豬科(Suidae)豬屬(Sus)，全球有25個亞種，廣泛分布于亞、歐、北非大部分地區(qū)[1]。中國目前有7個亞種，分布于除干旱荒漠和高原區(qū)外的其他地區(qū)，貴州地區(qū)為華南亞種(S.s.chirodonticus)[2-3]。野豬及各地特有豬種是世界范圍內(nèi)一種重要遺傳資源，對其展開保護(hù)與研究對于人類發(fā)展具有重要意義[4]。

遺傳多樣性能夠反映遺傳變異的水平，是衡量種群生存、進(jìn)化及對環(huán)境條件適應(yīng)的關(guān)鍵指標(biāo)[5]。目前，多重微衛(wèi)星標(biāo)記[6]、基因擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(AFLP)分析[7]等技術(shù)早已用于野豬遺傳多樣性研究。線粒體DNA是動物體內(nèi)長期穩(wěn)定存在的核外遺傳物質(zhì)，線粒體Cytb基因有結(jié)構(gòu)保守、擴(kuò)增難度小和遺傳信息豐富等特點[8]，是物種系統(tǒng)發(fā)育、母系遺傳標(biāo)記以種群分類等基因組水平上遺傳多樣性研究中最常引用且可靠的分子標(biāo)記之一[9]，目前被廣泛用于系統(tǒng)發(fā)育研究[10]。通過微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)分析表明，中國地區(qū)野豬比國外野豬種群遺傳多樣性高[5,11]，并使用線粒體分子標(biāo)記推斷出亞洲野豬種群起源于東南亞地區(qū)，且在中國內(nèi)陸的野豬種群有較高的遺傳多樣性[12-13]。中國野豬最早可能出現(xiàn)在川黔湘、云貴高原等地[14-15]，但相關(guān)研究還處在探索階段。

貴州地處中國西南地區(qū)，主要以山地、丘陵為主，是世界喀斯特地貌發(fā)育最典型的地區(qū)之一[16]，該地區(qū)氣候溫和濕潤、地形地貌復(fù)雜、植被覆蓋率高，以致近年多地發(fā)現(xiàn)野豬活動頻繁[17-18]。野豬的遺傳多樣性對于衡量種群生存、環(huán)境適應(yīng)及種群動態(tài)有著極其重要的作用。為了評估貴州野豬種群的遺傳多樣性，本試驗對貴州野豬的11條線粒體Cytb基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測序，以與野豬親緣關(guān)系較近的爪哇野豬(Susverrucosus)作為外群，與GenBank中國內(nèi)其他9個地區(qū)野豬種群的線粒體Cytb基因進(jìn)行序列比對、系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建及歷史動態(tài)分析，探究貴州野豬種群和其他地區(qū)野豬種群的遺傳差異，以期為貴州野豬種群的遺傳多樣性保護(hù)、種質(zhì)管理與利用、應(yīng)對種群動態(tài)變化等提供重要依據(jù)，為遺傳分化研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

野豬組織樣本均來自于2019年貴州省森林地區(qū)采樣的11頭野豬(獵捕及采樣均獲得貴州省林業(yè)局行政批準(zhǔn)和貴州大學(xué)實驗動物倫理分委員會審批)，樣品編號、采集地點及數(shù)量見表1。對處死后的野豬進(jìn)行腿部肌肉組織采樣，用無菌密封袋裝集后置于冰盒中冷藏，48 h內(nèi)送回實驗室，-20 ℃保存?zhèn)溆谩腉enBank數(shù)據(jù)庫中下載中國部分地區(qū)野豬的55條線粒體Cytb基因序列，并下載爪哇野豬Cytb基因序列作為外群，序列信息見表2。

表1 貴州野豬樣品采集信息

表2 中國部分地區(qū)野豬和爪哇野豬Cytb基因序列

1.2 方法

1.2.1 DNA提取、PCR擴(kuò)增及測序 稱取0.5 g野豬肌肉組織，參考馬婷婷[22]方法提取DNA。DNA提取后加入50～100 μL去離子水溶解，使用核酸分析儀檢測濃度，1.2%瓊脂糖凝膠電泳中檢測DNA完整性，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

引物序列為：F：5′-CACGACCAATGACATG-AAAAATC-3′；R：5′-TGGCCCTCCTTTTCTGG-TTTAC-3′。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系25 μL：模板DNA(100 ng/μL)1 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，TaqPCR MasterMix(2×，Blue Dye)12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR擴(kuò)增程序參考Damdin等[23]方法。取2 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，對鑒定正確的PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行雙向測序。

1.2.2 序列分析 用BioEdit v 7.0.5軟件打開測序峰圖，將得到的單峰序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中經(jīng)BLAST比對確認(rèn)是否為野豬相應(yīng)序列后，將正反向引物雙向測序得到的兩條單峰序列使用DNAStar 7.1軟件中的Seqman程序進(jìn)行雙向拼接，將拼接后的Cytb基因序列合并整理成Fast文件。

1.2.3 遺傳多樣性及系統(tǒng)發(fā)育分析 使用Mega 7.0[24]軟件評估各地區(qū)野豬序列的保守位點(conserved sites,C)、簡約信息位點(parsimony informative sites,NPi)、變異位點(variation site,V)、堿基組成、種間和種內(nèi)遺傳距離；用DnaSP 6.0軟件[25]評估單倍型數(shù)目(number of haplotypes,H)、單倍型多樣性(haplotype diversity,Hd)、核苷酸多樣性(nucleotide diversity,Pi)、平均核苷酸差異(mean number of pairwise differences,K)。利用Kimura雙參數(shù)距離模型以鄰接法(Neighbor-Joining,NJ)構(gòu)建單倍型間系統(tǒng)發(fā)育樹，所有的計算均通過1 000次重復(fù)，貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育分析采用MrBayes 3.2.1軟件[26]MCMC方法，選擇GTR模型，直至分析的相似度<0.01結(jié)束運算，使用FigTree v 1.4.3軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹查看和編輯。采用Arlequin軟件進(jìn)行Tajima’sD和Fu’sFs檢驗，并計算不同地理種群間的遺傳分化系數(shù)(Fst)[27]；使用Network軟件中Median-Joining模型構(gòu)建種群單倍型網(wǎng)絡(luò)圖，網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建時均選擇軟件默認(rèn)參數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 不同地理種群線粒體Cytb基因序列堿基組成

對測序獲得的貴州野豬11條Cytb基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對，結(jié)果與GenBank中國內(nèi)其他9個地區(qū)野豬種群線粒體Cytb基因序列的一致性>98%，確認(rèn)擴(kuò)增序列為野豬Cytb基因序列。使用BioEdit軟件將Cytb基因序列手動補(bǔ)齊，補(bǔ)齊后序列長度為1 140 bp。貴州、臺灣野豬種群該片段GC含量均為42.10%，各地區(qū)野豬Cytb基因序列都明顯存在AT堿基偏好性，符合脊椎動物線粒體Cytb基因堿基組成特點，其中貴州野豬種群Cytb基因序列保守位點為1 134個，簡約信息位點為1個，單一多態(tài)位點為5個(表3)。

表3 中國部分地區(qū)野豬種群的線粒體Cytb基因序列堿基組成分析

2.2 不同地理種群線粒體Cytb基因序列遺傳多樣性

對本研究中11條貴州野豬種群Cytb基因序列和GenBank中下載的其他地區(qū)55條Cytb基因序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，66條序列對應(yīng)24種單倍型，高頻單倍型為Hap_1和Hap_10，其中Hap_1單倍型對應(yīng)7個地區(qū)的20條Cytb基因序列；Hap_10單倍型對應(yīng)4個地區(qū)的16條Cytb基因序列；基于貴州野豬種群11條Cytb基因序列分析發(fā)現(xiàn)，貴州野豬種群變異位點為6個；單倍型數(shù)量為4個；單倍型多樣性值為0.600；核苷酸多樣性值為0.00118；平均核苷酸差異值為1.34545(表4)。

表4 中國部分地區(qū)野豬種群線粒體Cytb基因遺傳多樣性分析

2.3 不同地理種群野豬線粒體Cytb基因種內(nèi)及種間遺傳距離、遺傳分化系數(shù)分析

按序列來源將野豬Cytb基因序列按照地區(qū)進(jìn)行分組，分析得知各地區(qū)野豬種群種內(nèi)遺傳距離在0～0.008之間，貴州野豬種群種內(nèi)遺傳距離為0.001，東北地區(qū)野豬種群種內(nèi)遺傳距離為0，種內(nèi)遺傳距離最大為云南野豬種群(0.008)；貴州野豬種群與其他地區(qū)野豬種群種間遺傳距離較小，最大與云南野豬種群之間為0.006(表5)。兩兩種群間遺傳分化系數(shù)在-0.111(湖南-臺灣省)～0.424(湖南-東北地區(qū))之間；貴州野豬種群同其他9個種群間與福建野豬種群的遺傳分化系數(shù)最大(0.324)，與臺灣野豬種群的遺傳分化系數(shù)最小(0.018)；東北地區(qū)野豬種群與其他各地區(qū)種群的遺傳分化系數(shù)普遍相對較大，在0.135(東北地區(qū)-貴州)～0.424(東北地區(qū)-湖南)之間，約半數(shù)的野豬種群間存在較高或高水平的遺傳分化(表5)。

表5 中國部分地區(qū)野豬種群Cytb基因種內(nèi)、種間遺傳距離及遺傳分化系數(shù)

2.4 種群歷史動態(tài)分析

基于線粒體Cytb基因序列，利用DnaSP 6.0軟件對中國不同地區(qū)野豬種群進(jìn)行中性檢驗分析，并對貴州野豬種群進(jìn)行堿基錯配差異分析，結(jié)果顯示，貴州野豬11條Cytb基因序列對應(yīng)4種單倍型，中性檢驗Tajima’sD值為―1.359(P>0.10)，F(xiàn)u’sFs值為―0.110(P>0.10)，兩個值均為負(fù)值且差異不顯著(表6)，表明貴州野豬種群在經(jīng)歷種群擴(kuò)張。對貴州野豬種群Cytb基因序列進(jìn)行堿基差異錯配分析發(fā)現(xiàn)，貴州野豬種群線粒體Cytb基因序列堿基差異分布呈單峰分布(圖1)，也表明貴州野豬種群該階段在經(jīng)歷種群擴(kuò)張。

表6 中國部分地區(qū)野豬種群Cytb基因片段中性檢驗分析

圖1 貴州野豬種群Cytb基因單倍型序列錯配分布

2.5 種群Cytb基因單倍型系統(tǒng)發(fā)育與單倍型網(wǎng)絡(luò)分析

基于10個地區(qū)野豬Cytb基因單倍型序列，以爪哇野豬Cytb基因序列作為外群，采用鄰接法(NJ)和貝葉斯方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，得到了相同的結(jié)果(圖2)。外群爪哇野豬與中國野豬種群之間直觀地形成2個分支，國內(nèi)各地區(qū)野豬種群單倍型分支混合。貴州野豬11條序列對應(yīng)4種單倍型：Hap_1、Hap_10、Hap_21和Hap_22(表7)，4種單倍型之間并未聚集，種群在不同時間段發(fā)生分化；四川野豬單倍型(Hap_2)、云南野豬單倍型(Hap_18、Hap_19、Hap_20)、貴州野豬單倍型(Hap_21)相對其他地區(qū)分化時間較早。通過Network軟件構(gòu)建各地區(qū)野豬Cytb序列單倍型網(wǎng)絡(luò)圖，其中貴州野豬單倍型(Hap_1、Hap_10)位于10個地區(qū)野豬單倍網(wǎng)絡(luò)關(guān)系的分化中心，這2種單倍型是大部分野豬群體的優(yōu)勢單倍型，并與其他單倍型短支相連，在24種單倍型中相對原始，可以看作是大部分野豬種群的祖先單倍型，周圍的單倍型由這2個單倍型分化衍生得到，各地區(qū)單倍型分化與地理分布之間的相關(guān)性并不明顯(圖3)。

分支數(shù)字代表分支后驗概率BI/NJ

表7 中國部分地區(qū)野豬種群Cytb基因?qū)?yīng)的單倍型

圖3 中國部分地區(qū)野豬群體Cytb基因的單倍型網(wǎng)絡(luò)分析圖

3 討 論

3.1 貴州野豬種群的遺傳多樣性分析

遺傳多樣性是物種進(jìn)化的重要依據(jù)保障，通常認(rèn)為，物種的遺傳多樣性越高，其后代的適應(yīng)能力越強(qiáng)，越容易發(fā)生擴(kuò)張，反之種群的適應(yīng)能力則會降低[28]。物種的單倍型多樣性及核苷酸多樣性是衡量物種遺傳多樣性的2個重要指標(biāo)[29]。堿基多樣性是遺傳多樣性的基礎(chǔ)，研究顯示，貴州野豬種群線粒體Cytb基因序列AT含量高于GC含量，與其他地區(qū)野豬種群堿基偏好性相似，符合哺乳動物線粒體DNA的進(jìn)化特點，這種偏好性反映了物種受到外界自然突變與堿基選擇壓力的影響較高，因為線粒體基因片段中A、T 2種堿基之間鍵能較低，容易引起堿基發(fā)突變，導(dǎo)致群體性狀發(fā)生變異[30]。本研究結(jié)果顯示，10個地區(qū)野豬Cytb基因序列單倍型多樣性在0.500～1.000之間，核苷酸多樣性在0.00044～0.00804之間，貴州野豬種群Cytb基因序列片段的單倍型多樣性為0.600，核苷酸多樣性為0.00118，符合Grant等[31]依據(jù)物種的演化模式以線粒體單倍型多樣性和核苷酸多樣性推測形成種群演化經(jīng)歷的4種模式的種群擴(kuò)張階段，即當(dāng)種群的單倍型多樣性較高(>0.5)但核苷酸多樣性較低(<0.5)時，種群可能正在經(jīng)歷由瓶頸效應(yīng)后引發(fā)的快速擴(kuò)張；貴州野豬種群的遺傳多樣性表現(xiàn)出高單倍型多樣性、低核苷酸多樣性的趨勢，說明貴州地區(qū)野豬種群該階段正經(jīng)歷種群擴(kuò)張。

3.2 貴州野豬種群的遺傳分化分析

物種種內(nèi)、種間的遺傳距離差異程度反映了各地理種群間親緣關(guān)系遠(yuǎn)近或種群間遺傳相似性[32]。本研究結(jié)果顯示，各野豬群體間平均遺傳距離范圍在0.001～0.008，云南和四川野豬種群與其他地區(qū)種群間的遺傳距離較大，與白立景[30]研究結(jié)果類似。貴州種群種間的遺傳距離與其他地區(qū)種群相比中等，種內(nèi)遺傳距離(0.001)較其他地區(qū)小，說明貴州野豬種群之間親緣關(guān)系較近，種群內(nèi)基因存在相互交流；優(yōu)越的棲息環(huán)境及逐漸減少的人為干擾為貴州野豬種群內(nèi)的基因交流提供了良好的條件，促進(jìn)了野豬種群基因交流，與胡超超[33]和白立景[30]研究結(jié)果一致。

遺傳分化系數(shù)(Fst)是反映2個種群間遺傳分化程度的一個指標(biāo)[34]。Rousset研究認(rèn)為，F(xiàn)st值范圍為0～1：Fst<0.05時種群間遺傳分化不顯著，分化程度低；0.050.25時種群間發(fā)生顯著遺傳分化，F(xiàn)st值越大，兩種群的分化程度越高，F(xiàn)st為負(fù)值說明種群之間基因交流普遍[28]。本研究中，各地區(qū)野豬群體間Fst值在-0.111～0.424之間；貴州和湖南、臺灣野豬種群間遺傳分化不顯著，親緣關(guān)系較近；貴州與四川、海南、云南、東北地區(qū)野豬種群間遺傳分化水平適中；貴州與福建、江西野豬種群間遺傳分化水平差異顯著。各個種群分化程度和地理位置之間的相關(guān)性不強(qiáng)，從側(cè)面反映了地理位置并不是形成遺傳格局的因素，與李崇奇[12]、朱雅[35]研究結(jié)果相同，地理因素未對野豬種群擴(kuò)張和遷移造成阻礙。

3.3 貴州野豬種群的歷史動態(tài)分析

種群歷史演化通常采用2種方法進(jìn)行檢測：一種方法是通過Tajima’sD和Fu’sFs中性檢驗；另一種方法是通過堿基差異性分析。中性檢驗時，F(xiàn)u’sFs檢驗對種群擴(kuò)張的反應(yīng)更加敏感[27]。本研究中Tajima’sD與Fu’sFs檢驗均證實各地區(qū)野豬群體遵行中性進(jìn)化，通過Cytb基因序列計算貴州地區(qū)野豬Tajima’sD值和Fu’sFs值是負(fù)值且無顯著差異，堿基錯配分布呈單峰，說明貴州野豬種群該階段正在經(jīng)歷種群擴(kuò)張，與張怡[36]使用線粒體控制區(qū)得到的結(jié)果相同，遺傳多樣性結(jié)果也相同。基于10個地區(qū)野豬線粒體Cytb基因單倍型序列構(gòu)建貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹和單倍型NJ系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)，各種單倍型之間分布混雜，其中四川、湖南、臺灣部分野豬種群聚集形成分支，其余地區(qū)無明顯以地理聚群形成單獨的分支，與白立景[30]研究表明國內(nèi)種群無明顯地理劃分一致。

貴州野豬種群包含的4種單倍型并未聚集在一起，而是與其他單倍型散布混雜在一起。出現(xiàn)以上情形可能是以下幾個方面原因造成的：①野豬自身的日常生活習(xí)性不同；②不同野豬種群生活環(huán)境不同；③由于各個地理省份的分析序列局限性，無法完全覆蓋地理區(qū)域內(nèi)的樣本。本研究中，四川野豬部分單倍型(Hap_2、Hap_4和Hap_5)與其他單倍型關(guān)系較遠(yuǎn)，與四川野豬種群作為國內(nèi)野豬的分化起源中心相關(guān)，同樣符合白立景[30]研究結(jié)果；貴州野豬序列中Hap_1和Hap_10屬于國內(nèi)野豬種群的共享單倍型，其余2種單倍型(Hap_21、Hap_22)屬于貴州種群特有單倍型，說明貴州野豬種群根據(jù)自身環(huán)境發(fā)生了物種分化；單倍型網(wǎng)絡(luò)圖顯示，10個地區(qū)的共享單倍型為Hap_1和Hap_10，各單倍型間親緣關(guān)系較近，沒有形成明顯的系統(tǒng)地理結(jié)構(gòu)，結(jié)果與系統(tǒng)發(fā)育樹相似，2種共享單倍型是國內(nèi)部分野豬種群較原始的祖先單倍型，與李崇奇[12]、張怡[36]研究認(rèn)為川黔和云貴高原等地是亞洲野豬分化起源中心相符，且貴州野豬種群單倍型與其他單倍型之間存在相互交流的情況，導(dǎo)致種群遺傳多樣性受到影響，可能對貴州種群種質(zhì)資源造成影響，并對亞洲野豬種群分化中心造成威脅。本研究中貴州野豬樣本的抽樣范圍較為廣泛，但其他9個地區(qū)的野豬樣本具體來源尚不明確，因此進(jìn)行比較分析可能有不足之處，但能較為客觀地反映各地區(qū)野豬種群間的遺傳多樣性及其系統(tǒng)發(fā)育情況。

4 結(jié) 論

貴州野豬種群在歷史上較為穩(wěn)定，現(xiàn)處于歷經(jīng)瓶頸后的種群擴(kuò)張階段；種群內(nèi)遺傳距離較小、親緣關(guān)系近，遺傳多樣性低于全國多個地區(qū)，說明貴州野豬種群發(fā)展?jié)摿^小。因此，應(yīng)采取有效的措施增加和保護(hù)其遺傳多樣性，進(jìn)一步加強(qiáng)野豬種群管理和種質(zhì)利用，促進(jìn)野豬保護(hù)遺傳學(xué)及其對環(huán)境適應(yīng)機(jī)制的研究。