郭雅嫻，李姿坤，張喜瑞，張滿，梁彬，姬長建，孫嬋嬋*

（1.煙臺大學生命科學學院，山東 煙臺 264003；2.魯東大學食品工程學院，山東 煙臺 264001；3.齊魯師范學院物理與電子工程學院，山東 濟南 250200）

乳清濃縮蛋白是牛奶中蛋白質(zhì)的一種，乳清濃縮蛋白中含有α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、乳鐵蛋白、生長因子[1]等營養(yǎng)物質(zhì)，具有蛋白質(zhì)功效比值高、易被人體消化吸收等特點，是一種國際公認的優(yōu)質(zhì)人體蛋白質(zhì)補充劑。此外，乳清濃縮蛋白還具有良好的乳化性、水合性、凝膠性、起泡性等，常作為乳化劑及發(fā)泡劑等應(yīng)用在食品工業(yè)中。

近年來，為了增強蛋白質(zhì)界面性質(zhì)，常用的改性方法主要包括化學改性、物理改性、生物改性。物理改性通常是指利用機械方法，如球磨、高壓均質(zhì)等對物質(zhì)進行破碎以減小其顆粒尺寸。與化學改性相比，物理改性操作簡單，不會產(chǎn)生污染性廢液。微?；夹g(shù)和納米粉碎都屬于物理改性方法。

納米粉碎可以顯著改變原材料的大小、結(jié)構(gòu)和比表面積等，能夠使物質(zhì)界面性質(zhì)得到增強，是近年來迅速發(fā)展形成的一種新興的高科技工業(yè)技術(shù)，目前被廣泛應(yīng)用于食品[3]、化妝品、醫(yī)療等領(lǐng)域。

微粒化技術(shù)是通過熱處理將蛋白質(zhì)變成一種凝膠狀態(tài)，再經(jīng)過高速剪切等操作使蛋白質(zhì)形成微凝膠顆粒。微凝膠顆粒是指粒徑大小在10 nm～1 000 nm之間的膠體分散體系，粒子具有三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和在溶劑中溶脹的性質(zhì)，具有穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)，其尺寸小，比表面積大，表面有很多懸掛鏈段[2]，所以能夠不可逆地被吸附在相界面上，增強食品多相體系的穩(wěn)定性。

為進一步擴展乳清濃縮蛋白在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用，解決國內(nèi)蛋白質(zhì)微凝膠顆粒粒徑大、粒徑分布不集中、制備能耗高等問題，本文以乳清濃縮蛋白為對照，考察納米粉碎對乳清濃縮蛋白（whey protein concentrate，WPC）和乳清濃縮蛋白微凝膠顆粒（whey protein concentrate micro-gel particles，WPM） 多尺度結(jié)構(gòu)和界面性質(zhì)的影響，為蛋白質(zhì)微凝膠顆粒的制備和高效應(yīng)用提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳清濃縮蛋白粉（蛋白質(zhì)含量80%）：新西蘭恒天然公司；大豆油：益海嘉里金龍魚糧油食品股份有限公司；磷酸鹽緩沖溶液（色譜純）：北京伊諾凱科技有限公司；氯化鈉（色譜純）：煙臺博納實驗器材有限公司；甘氨酸：北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司；三羥甲基氨基甲烷[tris-（hydroxymethyl）-aminomethane，Tris]：美國Genview公司；5，5'-二硫代-2-硝基苯甲酸：上海華藍化學科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CJM-SY-B型高能納米磨：中國秦皇島太極環(huán)納米產(chǎn)品有限公司；SY-2-6電熱恒溫水浴鍋：天津市歐諾儀器有限公司；Ultra-Turrax T25高速乳化剪切機：德國IKA公司；LC-20AT高效液相色譜儀、RF-20A紫外檢測器：日本島津公司；FL-2500熒光分光光度計：日本日立集團；MS-DWS光學微流變分析儀、Turbiscan ASG靜態(tài)多散射穩(wěn)定性分析儀：法國Formulaction公司；CKX41倒置熒光顯微鏡：日本Olympus有限責任公司；BT-2001激光粒度分布儀：丹東百特儀器有限公司；T6新世紀紫外分光光度計：北京普析通用儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 乳清濃縮蛋白的納米粉碎預(yù)處理

將1 kg乳清濃縮蛋白粉加入到高能納米磨的研磨槽中，按照質(zhì)量比6∶1加入研磨球。為了防止蛋白質(zhì)的熱變性，研磨槽中工作溫度采用冷卻循環(huán)系統(tǒng)，控制在35℃以下。將納米粉碎4 h和8 h的乳清濃縮蛋白樣品分別命名為sWPC-4h和sWPC-8h。

1.3.2 乳清濃縮蛋白微凝膠顆粒的制備

采用微?；夹g(shù)制備乳清濃縮蛋白微凝膠顆粒。具體操作流程和技術(shù)參數(shù)：分別將WPC、sWPC-4h和sWPC-8h各12 g均勻分散于100 mL去離子水中，85℃處理30 min，4℃陳化10 h，10 000 r/min高速均質(zhì)處理10 min。

WPM、sWPM-4h和 sWPM-8h分別為以 WPC、sWPC-4h和sWPC-8h為原料制備的微凝膠顆粒樣品。

1.3.3 納米粉碎對乳清濃縮蛋白及其微凝膠顆粒粒徑的影響

以去離子水為分散介質(zhì)，采用激光粒度分布儀對乳清濃縮蛋白及其微凝膠顆粒的粒徑進行測定：將樣品添加到裝有800 mL去離子水的攪拌式測量池中，為了避免蛋白質(zhì)的多重散射效應(yīng)，保證測量的準確性，遮光度應(yīng)達到10%～15%[4]。每個不同處理方式的樣品均測量3次[5]，取平均值。

1.3.4 納米粉碎對乳清濃縮蛋白及其微凝膠顆粒分子量的影響

采用高效液相色譜儀檢測各蛋白質(zhì)樣品分子量。色譜條件[6]：LC-20AT高效液相色譜儀和RF-20A紫外檢測器組成的高效液相系統(tǒng)；分析柱為Biosep-SECS4000；洗脫液為0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH6.7）；流速0.6 mL/min。洗脫液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后，超聲脫氣。將10 mg/mL樣品溶液以10 000 r/min離心10 min，取上清液，用0.45 μm水相過濾器過濾，上樣量20 μL，采用恒流洗脫。

1.3.5 納米粉碎對乳清濃縮蛋白及其微凝膠顆粒游離巰基含量的影響

參考劉鑫碩[7]的Ellman試劑分析方法，并稍作改動，稱取樣品各50 mg，加入8 mL Tris-甘氨酸緩沖液，充分溶解，8 000 r/min離心10 min。量取1 mL上清液，加入2 mL Tris-甘氨酸緩沖液，0.02 mL Ellman試劑，充分混勻，室溫反應(yīng)25 min，采用紫外分光光度計測定412 nm處吸光度。

1.3.6 納米粉碎對乳清濃縮蛋白及其微凝膠顆粒內(nèi)源性熒光光譜的影響

將乳清濃縮蛋白及其微凝膠顆粒進行冷凍干燥處理，將凍干粉溶解于5mmol/L的磷酸鹽緩沖液中，配制濃度為0.05mg/mL蛋白質(zhì)待測液，將pH值調(diào)至7備用。設(shè)置熒光分光光度計的激發(fā)波長為295nm，激發(fā)和發(fā)射的狹縫距離為5nm[8]，掃描波長范圍為300nm～400 nm。

1.3.7 O/W型乳液的制備

取適量 WPC、sWPC-4h、sWPC-8h、WPM、sWPM-4h、sWPM-8h分別與大豆油混合，置于50 mL離心管中，12 000 r/min高速乳化均質(zhì)處理3 min，即得到含油量為40%的O/W型乳液。

1.3.8 乳液微流變特性的測定

光學微流變分析儀是基于多散斑擴散光譜（multi-speckle diffusing wave spectroscopy，MS-DWS） 技術(shù)測定乳液微流變特性。光束照射到乳液中懸浮的油滴時發(fā)生多次散射[9]，散射后的光被含有軌跡分析程序的圖像處理系統(tǒng)接收并進行分析，得到散斑圖像[10]。對每個油滴的位移分析后，繪制其均方位移曲線，進而計算得到微流變特性。

取20 mL乳液樣品于測試瓶（平底圓柱形玻璃管，高140 mm，直徑16 mm）中，然后測定各乳液的黏性、彈性、固液平衡值和流動性指數(shù)。

1.3.9 乳液穩(wěn)定性的測定

采用靜態(tài)多散射穩(wěn)定性分析儀對乳液的穩(wěn)定性進行測定，采用脈沖近紅外光源（波長880 nm）自下而上掃描樣品[11]，兩個光學探測器分別同步搜集透射光（transmission，TM）和背散射光（backscattering，BS）。在一定時間連續(xù)掃描樣品，獲得透射光與背散射光信號對樣品高度的函數(shù)曲線圖，即可反映出樣品中顆粒運動趨勢，進而預(yù)測出乳液的穩(wěn)定性[12]。由于乳液均呈現(xiàn)白色不透明狀，樣品透射光量較小，本測定中主要選用背散射光強。

取20 mL乳液樣品于測試瓶（平底圓柱形玻璃管，高140 mm，直徑16 mm）中，在室溫（25℃）下每2 h掃描1次，連續(xù)掃描24 h。

1.3.10 乳液微觀形態(tài)的觀察

取少量乳液樣品置于載玻片上，小心蓋上蓋玻片，避免氣泡的產(chǎn)生。采用倒置熒光顯微鏡（400倍）進行觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 納米粉碎對乳清濃縮蛋白及其微凝膠顆粒粒徑的影響

納米粉碎對乳清濃縮蛋白及其微凝膠顆粒粒徑分布的影響見圖1。

圖1 納米粉碎對乳清濃縮蛋白及其微凝膠顆粒粒徑分布的影響Fig.1 Effect of nano grinding on particle size distribution of WPC and WPM

由圖1可知，經(jīng)過納米粉碎的乳清濃縮蛋白微凝膠顆粒的粒徑分布更加集中，有效粒徑的范圍和占比更大；各樣品粒徑分布均呈現(xiàn)正態(tài)分布，因此可以采用中位粒徑表征粒徑大小。

將各樣品中位粒徑進行匯總，結(jié)果見表1。

表1 納米粉碎對乳清濃縮蛋白及其微凝膠顆粒中位粒徑的影響Table 1 Effect of nano grinding on median particle size of WPC and WPM

由表1可知，納米粉碎和微?；夹g(shù)處理均可以顯著降低乳清濃縮蛋白的中位粒徑（p＜0.05）。且隨著納米粉碎時間的延長，中位粒徑隨之減?。╬＜0.05）。說明納米粉碎和微粒化技術(shù)均破壞了蛋白質(zhì)分子間的作用力，減小了蛋白質(zhì)的尺寸。

2.2 納米粉碎對乳清濃縮蛋白及其微凝膠顆粒分子量的影響

乳清濃縮蛋白及其微凝膠顆粒的高效液相色譜見圖2。

圖2 乳清濃縮蛋白及其微凝膠顆粒的高效液相色譜圖Fig.2High performance liquid chromatograms of WPC and WPM

由圖2可知，WPC在11、22、24 min附近分別洗脫出了3種物質(zhì)，查閱文獻可知[13]，峰1為牛血清白蛋白，峰2為β-乳球蛋白，峰3為α-乳白蛋白。與色譜圖對應(yīng)的保留時間和峰面積數(shù)據(jù)如表2所示。

表2 納米粉碎對WPC及WPM的保留時間與峰面積的影響Table 2 Effect of nano grinding on retention time and area of peaks of WPC and WPM

由表2可知，經(jīng)過納米粉碎處理后的乳清濃縮蛋白及其微凝膠顆粒出峰時間無明顯變化，說明蛋白質(zhì)的分子量無明顯差異。經(jīng)納米粉碎后，sWPC-4h和sWPC-8h的峰1、峰2和峰3的峰面積均大于WPC，且隨納米粉碎處理時間的延長總體呈現(xiàn)增大的趨勢。這可能是由于納米粉碎破壞了蛋白質(zhì)分子的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致牛血清白蛋白、β-乳球蛋白和α-乳白蛋白在流動相中的溶解性增加。

WPM中未洗脫出峰1，可能是由于蛋白質(zhì)變性形成不溶性聚集物，在流動相中溶解度降低，低于檢測限。與WPM相比，sWPM-4h、sWPM-8h峰3的面積增加是因為α-乳白蛋白為一種鈣離子結(jié)合蛋白，在經(jīng)過納米粉碎后，鈣離子仍緊密結(jié)合在蛋白質(zhì)上，導(dǎo)致其有較高的熱穩(wěn)定性。

2.3 納米粉碎對乳清濃縮蛋白及其微凝膠顆粒游離巰基含量的影響

游離巰基含量的變化會影響蛋白質(zhì)的二級、三級結(jié)構(gòu)[14]。納米粉碎對乳清濃縮蛋白及其微凝膠顆粒游離巰基含量的影響見表3。

表3 納米粉碎對乳清濃縮蛋白及其微凝膠顆粒游離巰基含量的影響Table 3 Effect of nano grinding on the content of free sulfhydryl groups in WPC and WPM

由表3可以看出，納米粉碎和微?；夹g(shù)處理均降低了乳清濃縮蛋白的游離巰基含量，這可能是由于納米粉碎和微?；夹g(shù)將大顆粒蛋白破碎成小顆粒的過程中，原本被埋藏在分子內(nèi)部的游離巰基暴露而被氧化成二硫鍵，這使得蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)更為緊密。結(jié)合高效液相色譜結(jié)果，蛋白質(zhì)分子量并無明顯差異，說明樣品經(jīng)過納米粉碎后，其一級結(jié)構(gòu)并未受到破壞，說明二硫鍵的形成是在分子內(nèi)，而不是在分子間。

2.4 納米粉碎對乳清濃縮蛋白及其微凝膠顆粒內(nèi)源性熒光光譜的影響

6種樣品的內(nèi)源性熒光光譜見圖3。

圖3 納米粉碎對乳清濃縮蛋白及其微凝膠顆粒內(nèi)源性熒光光譜的影響Fig.3 Effect of nano grinding on endogenous fluorescence spectra of WPC and WPM

由圖 3 可知，WPC、sWPC-4h、sWPC-8h、WPM、sWPM-4h、sWPM-8h的最大吸收波長（λmax） 分別為333、334、336、337、338、339 nm。說明納米粉碎和微粒化處理后的乳清濃縮蛋白及其微凝膠顆粒的λmax均出現(xiàn)不同程度的紅移。表明納米粉碎和微?；夹g(shù)處理，使得原本在WPC內(nèi)部的酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等疏水性發(fā)色基團暴露出來，蛋白質(zhì)的表面疏水性發(fā)生改變。而蛋白質(zhì)多尺度結(jié)構(gòu)的改變會進一步導(dǎo)致其功能性質(zhì)的改變，如界面性質(zhì)等。

2.5 乳液的微流變特性

采用光學微流變分析儀測定各乳液的微流變特性，結(jié)果如圖4、圖5所示。

圖4 各乳液的彈性和黏性測定結(jié)果Fig.4 Elasticity index and viscosity index of emulsions

圖5 乳液的固液平衡值和流動性指數(shù)測定結(jié)果Fig.5 Solid-liquid balance and fluidity index

由圖4可知，在考察時間內(nèi)，微凝膠顆粒乳液的黏性和彈性均大于乳清濃縮蛋白乳液。其中，sWPM-8h乳液具有最強的黏性和彈性，呈現(xiàn)出典型黏彈性流體特性。由圖4a可知，隨著時間的延長，sWPC-4h乳液的彈性逐漸大于WPC，sWPM-4h乳液的彈性逐漸接近于WPM；由圖4b可知sWPC-8h乳液的黏性略高于sWPC-4h和WPC。

天然乳清濃縮蛋白是球蛋白，疏水基團內(nèi)埋[15]，使得其在乳液中與油的作用相對較弱。由以上可知，經(jīng)過納米粉碎預(yù)處理可使蛋白質(zhì)和油結(jié)合更加緊密，這使得乳液的黏性和彈性均得到增強。

固液平衡值（solid-liquid balance，SLB）表征了樣品的相態(tài)：SLB=0.5說明樣品內(nèi)部達到固液平衡，即不呈現(xiàn)典型的固體相態(tài)或液體相態(tài)；當0＜SLB＜0.5時，說明樣品呈現(xiàn)固態(tài)主導(dǎo)的相態(tài)（凝膠態(tài)），且該數(shù)值越小，說明樣品呈現(xiàn)越典型的凝膠態(tài)特征；而如果0.5＜SLB＜1.0說明樣品呈現(xiàn)液體主導(dǎo)的相態(tài)（流態(tài)），且數(shù)值越大說明樣品的流動性越大[16]。

由圖 5可以看出，WPC、sWPC-4h、sWPC-8h 3 個樣品制備的乳液的SLB均大于0.5，呈現(xiàn)出流體特性。sWPM-4h和sWPM-8h制備的乳液的SLB值都小于0.5，說明均呈現(xiàn)類固體的凝膠態(tài)。這可能是因為sWPM-4h和sWPM-8h中親水基團和疏水基團的分布比例適中，能夠很好地在水油界面保持穩(wěn)定，形成較小的油滴，從而形成結(jié)構(gòu)致密的乳液[17-18]。圖5顯示，WPC和sWPC-4h乳液流動性指數(shù)較大且較為接近，sWPC-8h、WPM、sWPM-4h、sWPM-8h次之。說明納米粉碎能夠提高乳清濃縮蛋白的界面性質(zhì)。

2.6 乳液貯藏穩(wěn)定性分析

圖6展示了各乳液的背散射光強隨著時間的變化情況。

圖6 乳液背散射光強隨著時間的改變Fig.6 Back-scattering light profile in the function of test tube height for emulsions

WPC、sWPC-4h和sWPC-8h乳液在室溫下貯藏過程中，樣品的底部均出現(xiàn)了蛋白質(zhì)沉淀，但是并沒有出現(xiàn)油的析出。這是由于部分蛋白質(zhì)與油滴結(jié)合形成密度小于連續(xù)相的聚集體[19-20]，在貯藏過程中向頂部移動，而未與油滴結(jié)合的蛋白質(zhì)則快速向底部移動，表現(xiàn)為沉淀的發(fā)生[21-22]。WPM和sWPM-4h乳液的上層均出現(xiàn)了油的析出。這是由于此時乳液中油滴過多，蛋白質(zhì)覆蓋率不足，油相暴露，油滴為趨于穩(wěn)定會和鄰近油滴共用蛋白質(zhì)，從而導(dǎo)致絮凝。由于密度較小，油滴聚集后會快速向頂部移動，表現(xiàn)為頂層析出。由圖6可以看出，sWPM-8h乳液整體的背散射光強比較穩(wěn)定，沒有明顯變化，展示了極高的貯藏穩(wěn)定性。

2.7 乳液的微觀結(jié)構(gòu)觀察

在蛋白質(zhì)分子中，色氨酸、酪氨酸以及苯丙氨酸3個氨基酸殘基均能夠發(fā)射熒光[23]。采用倒置熒光顯微鏡觀察各乳液的微觀結(jié)構(gòu)，經(jīng)特定濾光片，會看到蛋白質(zhì)樣品呈現(xiàn)明黃色，如圖7所示。

圖7 乳液的微觀結(jié)構(gòu)Fig.7 Microstructure of emulsions

由圖7可以看出，油滴在乳液中均能夠以圓形液滴均勻存在。乳液中蛋白質(zhì)吸附在油水界面上，它能降低兩相的界面張力，促進乳液形成，并且還能形成一層保護膜，保護油滴不被破壞，使乳液處于穩(wěn)定狀態(tài)。

相同含油量的乳液油滴由大到小依次為WPC、sWPC-4h、sWPC-8h、WPM、sWPM-4h、sWPM-8h。結(jié)合微觀結(jié)構(gòu)觀察和穩(wěn)定性測定結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，油滴的大小與穩(wěn)定性成反比，這與Sun等[24]研究結(jié)果一致，表明乳液油滴粒徑的減小增加了乳液的穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

納米粉碎可以顯著減小WPC和WPM的粒徑，且隨著處理時間的延長，粒徑隨之減小，其中sWPM-8h粒徑最小。此外，納米粉碎后，WPM粒徑分布的集中程度得到增強。納米粉碎和微?；夹g(shù)處理后，蛋白質(zhì)分子量并無明顯差異。WPC和WPM的游離巰基含量減少，證明了分子內(nèi)二硫鍵的形成，這有利于蛋白質(zhì)的緊密空間結(jié)構(gòu)的形成。WPC和WPM的最大吸收波長出現(xiàn)紅移，說明納米粉碎和微?；夹g(shù)增強了蛋白質(zhì)的表面疏水性。經(jīng)納米粉碎和微?；幚砗螅橐吼椥院蛢Σ胤€(wěn)定性整體上增強，固液平衡值整體上降低，乳液油滴大小減小。其中，sWPM-8h乳液具有最強的黏性和彈性、較小的固液平衡值、最小的流動性指數(shù)和最高的貯藏穩(wěn)定性。以上結(jié)果說明納米粉碎和微粒化技術(shù)能夠改善乳清濃縮蛋白的界面性質(zhì)。