李義帥, 王 愿, 張 磊, 朱龍玉, 秦學(xué)博,段小亮, 王 敏, 李建行

(河北省胸科醫(yī)院, 1. 胸三科, 2. 腫瘤二科, 河北 石家莊, 050000;3. 河北醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院 放療科, 河北 石家莊, 050035)

非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的治療包括手術(shù)切除、化療、放療、靶向治療和免疫治療，上述治療方法均能收獲一定的效果，但患者的生存率仍較差[1]。肺腺癌(LUAD)是NSCLC最常見的類型，約占所有肺癌患者的40%[2]。近期的研究[3]也闡明了LUAD中的各種免疫細(xì)胞浸潤(rùn)。隨著對(duì)病因和發(fā)病機(jī)制的深入研究，免疫反應(yīng)被認(rèn)為對(duì)LUAD的發(fā)展至關(guān)重要，提示腫瘤免疫反應(yīng)的改善或可提高患者總生存率。免疫治療已被廣泛應(yīng)用于肺癌患者中，包括細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原抑制劑和免疫檢查點(diǎn)抑制劑[4]。

CCCH型鋅指蛋白家族由4個(gè)成員組成，即ZC3H12A、ZC3H12B、ZC3H12C和ZC3H12D[5]。具有CCCH鋅指結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)12D(ZC3H12D)主要表達(dá)于人體的巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、淋巴結(jié)、脾臟和肺組織中，該分子具有一個(gè)獨(dú)特的鋅指結(jié)構(gòu)和一段脯氨酸富集區(qū)，可能具有潛在的結(jié)合和調(diào)節(jié)RNA的活性[6]。ZC3H12D具有影響腫瘤細(xì)胞周期和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用[7-8]。作為肺癌中的一種新型抑癌基因,ZC3H12D在LUAD中的作用及機(jī)制尚不清楚。本研究探討ZC3H12D預(yù)測(cè)LUAD患者預(yù)后及免疫治療效果的價(jià)值，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 RNA測(cè)序數(shù)據(jù)和生物信息學(xué)分析

從癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫(https://portal.gdc.cancer.gov/)中下載了來自LUAD項(xiàng)目的轉(zhuǎn)錄組RNA-seq數(shù)據(jù)(level 3, FPKM, 535例LUAD, 59例癌旁)和臨床信息(包含生存狀態(tài)和生存時(shí)間)。篩選無臨床資料和隨訪時(shí)間<30 d的LUAD病例，然后將3級(jí)FPKM轉(zhuǎn)換為TPM (transcripts per million reads, 即每百萬reads中來自于某轉(zhuǎn)錄本的讀段數(shù))，以進(jìn)行量化和比較。采用基線資料表收集患者的TNM分期、病理分期、年齡、性別、吸煙情況、主要治療結(jié)果、生存狀態(tài)等特征。本研究完全滿足TCGA的出版指南(http://cancergenome.nih.gov/abouttcga/policies/publicationguidelines), 并結(jié)合GTEx正常肺組織樣本的數(shù)據(jù)，增加對(duì)照樣本的數(shù)量。最后,ZC3H12D被確定為L(zhǎng)UAD患者的預(yù)后候選基因。

1.2 多模型的預(yù)后分析

采用Kaplan-Meier生存曲線和受試者工作特征(ROC)曲線分析ZC3H12D對(duì)LUAD患者的預(yù)后和診斷價(jià)值，其中預(yù)后指標(biāo)包括總生存期(OS)、疾病特異性生存期(DSS)和無疾病進(jìn)展間期(PFI); 采用單因素和多因素回歸分析探討ZC3H12D表達(dá)與LUAD患者OS的相關(guān)性，并基于ZC3H12D水平與T分期、N分期、M分期、病理分期和腫瘤原始治療效果單變量Cox模型中的OS事件構(gòu)建列線圖。當(dāng)P<0.05時(shí), Cox回歸分析有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.3 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)及功能分析

GeneMANIA數(shù)據(jù)庫(http://genemania.org/)是一個(gè)蛋白互作網(wǎng)站，包含基因信息，分析基因列表，并使用高精度的預(yù)測(cè)算法為功能分析確定基因優(yōu)先級(jí)[9]。本研究通過該數(shù)據(jù)庫分析了與ZC3H12D相互作用的蛋白，并進(jìn)行了相關(guān)信號(hào)通路分析。

通過DAVID數(shù)據(jù)庫(https: //david. ncifcrf. gov)對(duì)與ZC3H12D相互作用的蛋白進(jìn)行基因本體論(GO)富集分析和京都基因和基因組百科全書(KEGG)通路富集分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，應(yīng)用R軟件及相應(yīng)的clusterProfiler包進(jìn)行注釋及可視化。

1.4 免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的相關(guān)性分析

腫瘤免疫估計(jì)資源(TIMER)數(shù)據(jù)庫(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)是系統(tǒng)性分析不同癌癥類型免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的在線數(shù)據(jù)庫[10]。本研究使用TIMER和單樣本基因集富集分析(ssgsGSEA)來評(píng)估ZC3H12D與腫瘤純度以及多種免疫細(xì)胞之間的關(guān)系，包括B細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞。采用Spearman相關(guān)分析法研究ZC3H12D與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的相關(guān)性。使用correlation模塊分析基因表達(dá)之間的相關(guān)性。使用GSVA軟件包檢測(cè)ZC3H12D與其他免疫細(xì)胞的相關(guān)性。本研究通過分析TISIDB(http://cis.hku.hk/TISIDB)數(shù)據(jù)庫，分析了ZC3H12D與免疫亞型的關(guān)系[11]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用R軟件(v. 3.6.3)計(jì)算數(shù)據(jù)，應(yīng)用survival包(3.2-10版本)進(jìn)行生存資料的統(tǒng)計(jì)分析, survminer包用于可視化分析, pROC包用于分析ROC曲線, ggplot2包用于可視化分析, rms包(6.2-0版本)和survival包(3.2-10版本)用于列線圖的構(gòu)建。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 ZC3H12D在LUAD中高表達(dá)

利用從TCGA數(shù)據(jù)庫下載的泛癌數(shù)據(jù)評(píng)估ZC3H12D的表達(dá)水平，結(jié)果顯示,ZC3H12DmRNA在乳腺癌、膽管癌、結(jié)直腸癌、食管癌、腎透明細(xì)胞癌、腎乳頭狀細(xì)胞癌、肝癌、LUAD、胃腺癌和胸腺瘤中高表達(dá); 與正常組織相比, LUAD組織中ZC3H12D表達(dá)水平較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。ROC曲線分析顯示, ZC3H12D診斷LUAD的曲線下面積(AUC)為0.731(95%CI: 0.669～0.792), 表明ZC3H12D對(duì)LUAD具有中等的識(shí)別能力。

A: TCGA和GTEx正常組織與泛癌組織中ZC3H12D的表達(dá); B: LUAD組織(n=513)與正常組織(n=59)中ZC3H12D表達(dá)比較; C: LUAD組織與配對(duì)癌旁組織(n=57)中ZC3H12D表達(dá)比較; D: ZC3H12D診斷LUAD的ROC曲線。圖1 ZC3H12D在不同組織中的差異表達(dá)

2.2 ZC3H12D表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

ZC3H12D與T分期、N分期、病理分期、初始治療效果和總生存預(yù)后有相關(guān)性(P<0.05), 與性別、年齡、吸煙、M分期無相關(guān)性(P>0.05)。見表1、圖2。

表1 LUAD患者ZC3H12D表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

A: ZC3H12D表達(dá)與年齡的關(guān)系; B: ZC3H12D表達(dá)與性別的關(guān)系; C: ZC3H12D表達(dá)與吸煙的關(guān)系; D: ZC3H12D表達(dá)與T分期的關(guān)系; E: ZC3H12D表達(dá)與N分期的關(guān)系; F: ZC3H12D表達(dá)與M分期的關(guān)系; G: ZC3H12D表達(dá)與病理分期的關(guān)系; H: ZC3H12D表達(dá)與初始治療效果的關(guān)系; I: ZC3H12D表達(dá)與總生存預(yù)后的關(guān)系。兩者比較, **P<0.01, ***P<0.001。圖2 ZC3H12D表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 高表達(dá)ZC3H12D與LUAD不良預(yù)后的關(guān)系

采用Kaplan-Meier生存分析評(píng)估ZC3H12DmRNA表達(dá)的預(yù)后意義，較高的ZC3H12D表達(dá)與較短的OS[HR(95%CI)為0.49(0.36～0.66),P=0.001]、DSS[HR(95%CI)為0.45(0.31～0.65),P<0.001]和PFI[HR(95%CI)為0.66(0.51～0.86),P=0.002]顯著相關(guān)。對(duì)OS進(jìn)行的單因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，除ZC3H12D外，其他臨床病理特征如T分期、N分期、M分期、病理分期、初始治療結(jié)果也與LUAD預(yù)后具有相關(guān)性(P<0.05)。納入顯著性變量，構(gòu)建OS的多變量模型，結(jié)果顯示ZC3H12D仍是LUAD預(yù)后的影響因素[HR(95%CI)為0.509(0.332～0.781),P=0.002]。本研究基于單變量Cox回歸結(jié)果構(gòu)建了列線圖，該列線圖的一致性指數(shù)為0.723(95%CI: 0.731～0.793), 有1 000次bootstrap重復(fù); 校準(zhǔn)圖表明列線圖與LUAD中觀測(cè)到的OS概率具有良好的一致性。見表2、圖3。

表2 基于OS的單因素及多因素分析

A、B、C: ZC3H12D不同表達(dá)水平者的總生存期、疾病特異性生存期、無疾病進(jìn)展間期曲線; D: 預(yù)測(cè)LUAD患者1、3、5年總生存率的列線圖; E: LUAD患者1 000次bootstrap重復(fù)的Nomogram校準(zhǔn)曲線。圖3 基于ZC3H12D的LUAD患者預(yù)后分析及Nomogram模型構(gòu)建

2.4 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與信號(hào)通路分析

GeneMANIA網(wǎng)站分析結(jié)果顯示，可能與ZC3H12D相互作用的蛋白有ZC2H12A、ZC2H12B、N4BP1、ZC2H12C、KHNYN、RPGRIP1L、NYNRIN、NYNRIN、OR2V2、GPR75、ZNF488、FCER2、ZNF280B、GRAP、P2RX5、SLAMF6、CD80、TCF7、AICDA、PARP15和TUBB1。功能富集分析結(jié)果顯示的通路包括alpha-beta T cell differentiation involved in immune response、CD4-positive，alpha-beta T cell differentiation involved in immune response、T-helper cell differentiation、alpha-beta T cell activation involved in immune response、T cell differentiation involved in immune responseCD4-positive, alpha-beta T cell differentiation和CD4-positive, alpha-beta T cell activation。見圖4。

圖4 ZC3H12D互作蛋白網(wǎng)絡(luò)及功能分析

進(jìn)一步將與ZC3H12D相互作用的蛋白進(jìn)行GO和KEGG富集分析，功能主要集中在趨化因子-趨化因子受體結(jié)合、原始免疫反應(yīng)、T細(xì)胞受體信號(hào)通路、B細(xì)胞受體信號(hào)通路、PD-L1和PD1檢查點(diǎn)信號(hào)通路以及T細(xì)胞激活、B細(xì)胞激活、淋巴細(xì)胞激活、淋巴細(xì)胞增殖等方面。見圖5。

A: 生物過程; B: 分子功能; C: 細(xì)胞組分; D: KEGG通路。圖5 ZC3H12D互作蛋白的GO和KEGG富集分析

2.5 免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的相關(guān)性分析

本研究進(jìn)一步分析了ZC3H12D表達(dá)水平與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的相關(guān)性。TIMER數(shù)據(jù)庫分析提示, ZC3H12D與B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。對(duì)LUAD腫瘤微環(huán)境中的24種免疫細(xì)胞進(jìn)行ssGSEA分析，使用GSVA軟件包檢測(cè)ZC3H12D與其他免疫細(xì)胞之間的相關(guān)性，22種免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)與ZC3H12D相對(duì)豐度呈正相關(guān), Tgd細(xì)胞和Th2細(xì)胞與ZC3H12D僅呈負(fù)相關(guān)(P<0.05), 特別是不同T細(xì)胞亞群與ZC3H12D的相關(guān)性更強(qiáng)，包括T細(xì)胞、Tfh細(xì)胞、細(xì)胞毒T細(xì)胞、Th1細(xì)胞、TReg細(xì)胞、Tem細(xì)胞和B細(xì)胞，進(jìn)一步說明了ZC3H12D與多種免疫細(xì)胞浸潤(rùn)有很強(qiáng)的相關(guān)性。利用免疫亞型的分子分型，作者研究了ZC3H12DmRNA在不同免疫亞型中的表達(dá)。在LUAD中，在C1(傷口愈合)、C2(IFN-γ占優(yōu)勢(shì))、C3(炎癥)、C4(淋巴細(xì)胞減少)和C6(TGF-β占優(yōu)勢(shì))亞型中觀察到ZC3H12D表達(dá)特征的顯著差異，在LUAD中C3亞型表達(dá)量最高，提示不同免疫亞型中ZC3H12D的差異表達(dá)可能部分解釋了ZC3H12D在癌癥的預(yù)后中發(fā)揮了不同的作用。見圖6。

A: 通過TIMER分析ZC3H12D與LUAD的腫瘤純度及免疫浸潤(rùn)水平有關(guān); B: 24種免疫細(xì)胞浸潤(rùn)與LUAD中TSPOAP1-AS1表達(dá)的總體關(guān)系; C: 通過TISIDB分析ZC3H12D表達(dá)與LUAD免疫亞型的關(guān)系。圖6 LUAD中ZC3H12D表達(dá)與免疫浸潤(rùn)水平的相關(guān)性

3 討 論

肺癌是導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的主要原因，癌癥的生存率很大程度上取決于診斷時(shí)的疾病發(fā)展階段，但40%～60%的肺癌患者直到晚期才被診斷出來[12]。本研究觀察到LUAD中ZC3H12D的表達(dá)升高，與更差的OS、DSS和PFI相關(guān)，提示ZC3H12D與LUAD的免疫浸潤(rùn)水平相關(guān)，可影響預(yù)后。ZC3H12A在T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫抑制中發(fā)揮關(guān)鍵作用。然而，轉(zhuǎn)化濾泡淋巴瘤(TFL, ZC3H12D)是屬于regnas1家族(ZC3H12A)的核糖核酸酶(RNase), 最初被報(bào)道為腫瘤抑制基因。雖然ZC3H12D尚未被廣泛研究，但其抗腫瘤特性已在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)。研究[13]發(fā)現(xiàn)ZC3H12D在3′UTR中的作用與ZC3H12A相同。有研究[14]報(bào)道了人初級(jí)記憶T淋巴細(xì)胞與ZC3H12D表達(dá)的關(guān)系。研究[15]顯示, ZC3H12D與子宮內(nèi)膜癌患者的生存密切相關(guān)。本研究分析顯示, ZC3H12D在LUAD組織中顯著上調(diào)，且診斷價(jià)值的AUC為0.731, 說明該基因的差異表達(dá)可以區(qū)分LUAD患者和健康個(gè)體，具有較高的敏感性和特異性。

本研究利用蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)鑒定了ZC3H12D的共調(diào)控蛋白，包括ZC2H12A、ZC2H12B、N4BP1、ZC2H12C、KHNYN、RPGRIP1L、NYNRIN、NYNRIN、OR2V2、GPR75、ZNF488、FCER2、ZNF280B、GRAP、P2RX5、SLAMF6、CD80、TCF7、AICDA、PARP15和TUBB1, 主要富集在與T細(xì)胞相關(guān)的免疫信號(hào)通路。ZC3H12D作為鋅指蛋白家族中的一員，在人體中主要表達(dá)于巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、淋巴結(jié)、脾臟和肺組織中。因此，當(dāng)ZC3H12D在癌細(xì)胞中表達(dá)升高時(shí)，可能通過調(diào)控免疫細(xì)胞的激活或功能來調(diào)控腫瘤細(xì)胞。本研究發(fā)現(xiàn)ZC3H12D的上調(diào)與更差的OS、DSS和PFI有關(guān)。單因素和多因素分析表明, ZC3H12D的高表達(dá)是LUAD患者OS的獨(dú)立影響因素。ZC3H12D的表達(dá)水平與T分期、N分期、病理分期、初始治療效果和總生存預(yù)后顯著相關(guān)。本研究基于上述病理特征和ZC3H12D的表達(dá)構(gòu)建預(yù)測(cè)LUAD總生存率的列線圖，其1、3、5年校準(zhǔn)曲線表明該列線圖具有準(zhǔn)確的短期和長(zhǎng)期預(yù)測(cè)能力。

近年來，腫瘤免疫治療極大地改變了腫瘤患者的管理模式，免疫系統(tǒng)在癌癥發(fā)展和進(jìn)展中的作用愈發(fā)受到重視[16-18]。探索腫瘤微環(huán)境作為預(yù)后和診斷的生物標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)是極有價(jià)值的研究領(lǐng)域[19]。免疫檢查點(diǎn)阻斷療法提高了晚期黑色素瘤、NSCLC和其他癌癥患者的生存率，但單藥程序性死亡受體-1(PD-1)抑制劑的抗腫瘤作用有限，有效應(yīng)答率低于30%[20]。本研究發(fā)現(xiàn)ZC3H12D在腫瘤免疫機(jī)制中發(fā)揮作用，而ZC3H12D的表達(dá)與LUAD的免疫浸潤(rùn)水平密切相關(guān)。在人體內(nèi)分離CD4+T細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)[21]發(fā)現(xiàn), ZC3H12D的缺乏可增加T淋巴細(xì)胞的促炎表型。本研究結(jié)果顯示, ZC3H12D的表達(dá)與B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞的水平呈顯著正相關(guān)。

在NSCLC腫瘤微環(huán)境中，浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞占很大比率，主要是T細(xì)胞，其次是B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞[22-23]。樹突狀細(xì)胞是一種特殊的抗原提呈細(xì)胞，在抗腫瘤T淋巴細(xì)胞的激活中發(fā)揮重要作用[24]。T細(xì)胞的浸潤(rùn)水平通?？梢灶A(yù)測(cè)患者更好的臨床結(jié)果[25]。此外，腫瘤浸潤(rùn)的B細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中的作用也越來越受到關(guān)注，研究[26]表明NSCLC中B細(xì)胞的浸潤(rùn)具有良好的結(jié)果。在未接受PD-1/程序性死亡受體-1配體(PD-L1)抑制劑治療的NSCLC患者中，較高的T和B漿細(xì)胞水平與較好的預(yù)后相關(guān)[27]。本研究結(jié)果顯示, ZC3H12D與肺腺狀細(xì)胞癌中的巨噬細(xì)胞相關(guān)。然而，巨噬細(xì)胞在肺癌發(fā)展和激活中的作用仍存在爭(zhēng)議[28]。一般來說, 腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAMs)起著促腫瘤的作用，但在適當(dāng)?shù)拇碳は? TAMs也可能有能力與T細(xì)胞合作發(fā)揮抗腫瘤作用[29]。本研究結(jié)果顯示, ZC3H12D在LUAD中能夠招募和調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)。研究[30]表明Th1 CD4+T細(xì)胞、Th2 CD4+T細(xì)胞、Th17 CD4+T細(xì)胞浸潤(rùn)腫瘤可介導(dǎo)晚期實(shí)體腫瘤的消退。

本研究仍存在一些局限性，例如TCGA數(shù)據(jù)庫中正常樣本數(shù)量較少、未使用動(dòng)物模型驗(yàn)證假設(shè)。當(dāng)然，這些因素需要在進(jìn)一步的研究中得到驗(yàn)證。因此，本研究將在后續(xù)研究中建立細(xì)胞和動(dòng)物模型，通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明本研究結(jié)論。

綜上所述, ZC3H12D在LUAD中高表達(dá)，是獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)，且能影響免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平，或可作為L(zhǎng)UAD潛在的診斷及預(yù)后生物標(biāo)志物。