汪 瑩, 申復(fù)進(jìn), 鄭紅云, 馮 丹

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院, 1. 婦產(chǎn)科, 2. 檢驗(yàn)科, 湖北 武漢, 430060)

卵巢癌是臨床常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤疾病，發(fā)病率和病死率分別居?jì)D科惡性腫瘤的第3位和第1位[1]。卵巢癌患者早期臨床癥狀和體征不明顯，超過(guò)75%的患者確診時(shí)已發(fā)展至晚期，其5年生存率低于25%[2]。糖類抗原125(CA125)是卵巢癌常用生物標(biāo)志物，但其也可在子宮內(nèi)膜異位癥、肺癌[3]等疾病患者中高表達(dá)，用作篩查工具缺乏特異性。人附睪蛋白4(HE4)在卵巢癌中呈高表達(dá)，在卵巢良性腫瘤或非卵巢癌中呈低表達(dá)或不表達(dá)，相較于CA125具有更高的特異性[4]。臨床醫(yī)師常用HE4聯(lián)合CA125檢測(cè)結(jié)果對(duì)卵巢癌進(jìn)行診斷，其敏感性高于單一檢測(cè)結(jié)果，但診斷早期卵巢癌仍有不足[5]。因此，臨床亟需探尋新的生物標(biāo)志物用于卵巢癌的篩查及初步診斷。近年來(lái)，外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)被逐步應(yīng)用于卵巢癌的診斷[6]、療效監(jiān)測(cè)[7]和預(yù)后判斷等方面，不僅檢測(cè)方便，而且無(wú)創(chuàng)。葉酸受體(FR)是一種糖基磷脂酰肌醇偶聯(lián)蛋白，在健康人血液細(xì)胞中一般不表達(dá)，一旦發(fā)生上皮源性細(xì)胞癌變，F(xiàn)R表達(dá)量則顯著上升，尤其是在卵巢癌、肺癌等上皮來(lái)源的腫瘤組織中[8]。本研究探討葉酸受體陽(yáng)性循環(huán)腫瘤細(xì)胞(FR+-CTC)在卵巢癌輔助診斷和治療監(jiān)測(cè)中的臨床應(yīng)用價(jià)值，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

回顧性選取武漢大學(xué)人民醫(yī)院2019年5月—2020年12月診治的31例卵巢癌患者納入卵巢癌組，年齡21～76歲，平均(54.17±7.58)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)[9]: ① 經(jīng)術(shù)后病理確診卵巢癌，符合卵巢癌診斷標(biāo)準(zhǔn)者; ② 術(shù)前未接受放療或化療等抗腫瘤治療者; ③ 治療前后均檢測(cè)FR+-CTC者; ④ 病例資料完整者。排除標(biāo)準(zhǔn): 合并其他系統(tǒng)惡性腫瘤、重要臟器疾病者。同時(shí)選取59例在婦科門診檢測(cè)FR+-CTC的健康體檢者納入對(duì)照組，年齡20～84歲，平均(59.44±12.98)歲，均無(wú)腫瘤相關(guān)病史，無(wú)心、腦、肝等重要臟器器質(zhì)性疾病。2組一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05), 具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑與儀器: FR+-CTC檢測(cè)試劑盒(格諾思博生物科技有限公司), CA125檢測(cè)試劑盒(Siments公司，批號(hào)015183), HE4檢測(cè)試劑盒(瑞典康乃格公司，批號(hào)37356001), 羅氏cobas e 801全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀，德國(guó)西門子ADVIA Centuar XP全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀。

1.2.2 標(biāo)本采集: 分別抽取卵巢癌患者(治療前后)和對(duì)照組體檢者靜脈血4 mL于6 mL真空采血管(加有EDTA 抗凝劑)內(nèi)，上下顛倒7～8次, 4～10 ℃暫存，并于24 h內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3 FR+-CTC檢測(cè): 應(yīng)用FR+-CTC檢測(cè)試劑盒檢測(cè)FR+-CTC水平。① 取全血標(biāo)本3 mL置于15 mL離心管中，加入12 mL細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，離心10 min, 棄上清。② 加入重懸細(xì)胞后，加入免疫磁珠A液、B液負(fù)向富集去除樣本中白細(xì)胞(CD45+)。③ 加入10 μL探針標(biāo)記液，室溫孵育40 min; 加入900 μL細(xì)胞洗滌液洗滌后，離心收集細(xì)胞。④ 行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增及熒光檢測(cè)，計(jì)算各校準(zhǔn)品CT值。參照多中心受試者臨床試驗(yàn)結(jié)果，將每3 mL血中FR+-CTC≥8.7葉酸單位(FU)作為FR+-CTC陽(yáng)性的判定標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.4 CA125、HE4檢測(cè): 采用化學(xué)發(fā)光雙抗體夾心法檢測(cè)CA125、HE4水平，將CA125>30.2 U/mL作為CA125陽(yáng)性的判定標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 不同臨床特征卵巢癌患者的FR+-CTC檢測(cè)結(jié)果

不同年齡、不同分期、不同組織分型、有無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的卵巢癌患者FR+-CTC陽(yáng)性率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05), 見(jiàn)表1。

表1 不同臨床特征卵巢癌患者的FR+-CTC檢測(cè)結(jié)果比較[n(%)]

2.2 對(duì)照組與卵巢癌組外周血FR+-CTC含量比較

對(duì)照組體檢者(n=59)外周血(3 mL) FR+-CTC含量為2.71～8.35 FU, 平均6.35(4.87, 7.44) FU; 卵巢癌組患者(n=31)治療前外周血(3 mL)FR+-CTC含量為5.53～31.26 FU，平均11.78(7.36，17.31) FU; 卵巢癌組患者(n=24)治療后外周血(3 mL) FR+-CTC含量為3.36～25.02 FU, 平均10.84(6.67, 20.95) FU。卵巢癌組患者治療前后外周血FR+-CTC含量均高于對(duì)照組體檢者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 治療后，卵巢癌組患者外周血FR+-CTC含量低于治療前，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 FR+-CTC與CA125、HE4對(duì)卵巢癌的診斷結(jié)果比較

31例卵巢癌患者均檢測(cè)FR+-CTC水平，且其中19例患者檢測(cè)CA125水平, 21例患者檢測(cè)HE4水平。外周血FR+-CTC診斷卵巢癌的靈敏度為87.10%, 高于血清腫瘤標(biāo)志物CA125、HE4的靈敏度63.16%、52.38%, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.934、7.669,P=0.047、0.006), 故FR+-CTC可作為卵巢癌的早期獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，見(jiàn)表2。Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示, FR+-CTC與CA125、HE4均無(wú)相關(guān)性(r=0.280、0.384,P>0.05)。

表2 FR+-CTC與糖類抗原125、人附睪蛋白4對(duì)卵巢癌的診斷結(jié)果比較

2.4 FR+-CTC陽(yáng)性、CA125陽(yáng)性卵巢癌患者分期情況比較

FR+-CTC陽(yáng)性(每3 mL外周血中FR+-CTC≥8.7 FU)卵巢癌患者中, Ⅲ～Ⅳ期者占比70.37%, 高于Ⅰ～Ⅱ期者占比， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); CA125陽(yáng)性(CA125>30.2 U/mL)卵巢癌患者中, Ⅲ～Ⅳ期者占比91.67%, 高于Ⅰ～Ⅱ期者占比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與CA125陽(yáng)性患者中Ⅰ～Ⅱ期者占比相比, FR+-CTC陽(yáng)性患者中Ⅰ～Ⅱ期者占比更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 FR+-CTC陽(yáng)性、糖類抗原125陽(yáng)性卵巢癌患者分期情況比較[n(%)]

3 討 論

卵巢癌是常見(jiàn)的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，病死率高居?jì)D科惡性腫瘤的首位，嚴(yán)重危害女性生命安全與健康[10]。全球每年約有24萬(wàn)名女性被診斷出卵巢癌，整體5年生存率低于45%[11]。卵巢癌起病隱匿，早期缺乏明顯癥狀，多數(shù)患者確診時(shí)已發(fā)展至晚期[12]，出現(xiàn)腹水、腹脹、消瘦等癥狀，預(yù)后不良。早期診斷可提高卵巢癌患者的生存率，改善不良預(yù)后，但僅15%的卵巢癌患者能在早期確診[13]。

CTC是指從惡性腫瘤原發(fā)部位或轉(zhuǎn)移部位脫落，通過(guò)血管或淋巴系統(tǒng)進(jìn)入血液循環(huán)的細(xì)胞[14], 可通過(guò)無(wú)創(chuàng)方式進(jìn)行檢測(cè)。目前, CTC已被廣泛應(yīng)用于肺癌[15]、乳腺癌[16]、結(jié)直腸癌[17]等惡性腫瘤的早期診斷、療效監(jiān)測(cè)和預(yù)后判斷中。雖然卵巢癌患者的CTC水平較其他實(shí)體瘤患者低，但近年來(lái)CTC也逐漸被應(yīng)用于卵巢癌中，且有研究[18]指出CTC與卵巢癌治療效果和預(yù)后具有相關(guān)性。KIM H等[19]檢測(cè)了13例卵巢癌患者多個(gè)時(shí)點(diǎn)的血樣，并評(píng)估CTC、CA125水平與疾病病程的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)手術(shù)、化療后CTC計(jì)數(shù)下降，且CTC相較于CA125敏感性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值更高，與治療反應(yīng)、復(fù)發(fā)的相關(guān)性更好。CHEBOUTI I等[20]對(duì)卵巢癌患者初診及化療后的配對(duì)血液樣本的CTC水平和患者生存期進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，化療后CTC高水平與生存期縮短具有相關(guān)性。由此推測(cè), CTC在卵巢癌患者療效監(jiān)測(cè)、預(yù)后判斷方面具有重要的臨床參考價(jià)值，但目前將FR+-CTC應(yīng)用于卵巢癌早期輔助診斷的研究仍較少，故有必要進(jìn)一步深入探討。

李曉利等[21]分析CTC陽(yáng)性率與卵巢癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系發(fā)現(xiàn), CTC陽(yáng)性率與年齡、病理分型無(wú)相關(guān)性，但與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)分期具有相關(guān)性。本研究結(jié)果顯示，不同年齡、不同分期、不同組織分型、有無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的卵巢癌患者FR+-CTC陽(yáng)性率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與李曉利等[21]結(jié)論不符，這可能由FIGO分期、腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的劃分標(biāo)準(zhǔn)不同而引起。劉春華等[22]研究表明，卵巢癌患者組CTC檢測(cè)陽(yáng)性率為73.33%，與健康志愿者組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。本研究中，卵巢癌組患者治療前后外周血FR+-CTC含量均高于對(duì)照組健康體檢者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 且對(duì)照組外周血FR+-CTC含量均低于陽(yáng)性界定值，提示CTC檢測(cè)結(jié)果能夠輔助鑒別卵巢癌。BANYS-PALUCHOWSKI M等[23]分析卵巢癌患者化療前和化療3、6個(gè)周期后CTC水平發(fā)現(xiàn)，化療3個(gè)周期后患者CTC陽(yáng)性率下降至4.8%, 化療6個(gè)周期后則未檢出CTC陽(yáng)性者。隨著化療周期的延長(zhǎng)，卵巢癌患者CTC陽(yáng)性率呈下降趨勢(shì)，因此FR+-CTC能夠反映患者的治療效果，可用于卵巢癌的療效監(jiān)測(cè)。本研究結(jié)果顯示，卵巢癌組患者治療后的外周血FR+-CTC含量低于治療前，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05), 這可能與本研究樣本量過(guò)少有關(guān)。

CA125是上皮細(xì)胞表達(dá)的糖蛋白[24], 在正常組織及良性病變組織中呈低表達(dá)，在卵巢癌中呈高表達(dá)，常被應(yīng)用于卵巢癌的臨床診斷和療效監(jiān)測(cè)。HE4是小分子分泌性蛋白[25], 在卵巢癌中呈高表達(dá)，可用于卵巢癌的復(fù)發(fā)診斷與預(yù)測(cè)。相關(guān)研究[26]報(bào)道, HE4聯(lián)合CA125預(yù)測(cè)卵巢癌復(fù)發(fā)的靈敏度、特異度均高于單獨(dú)應(yīng)用HE4。PEARL M L等[27]研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于Ⅰ、Ⅱ期卵巢癌而言，CTC診斷的特異度與陽(yáng)性預(yù)測(cè)值均高于CA125，且CTC與臨床因素的一致性強(qiáng)于CA125。ZHANG X H等[28]檢測(cè)14例早期(ⅠA～ⅠB期)卵巢癌患者的CTC、CA125水平發(fā)現(xiàn), CTC診斷早期卵巢癌的效果相較于CA125更突出。本研究發(fā)現(xiàn), FR+-CTC診斷卵巢癌的靈敏度為87.10%, 顯著高于CA125、HE4的診斷靈敏度63.16%、52.38%。劉春華等[22]對(duì)78例卵巢癌患者進(jìn)行CTC與CA125檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，隨著化療周期的延長(zhǎng)，患者CTC、CA125水平均呈下降趨勢(shì)，但CTC與CA125水平變化無(wú)相關(guān)性。本研究結(jié)果顯示, FR+-CTC可作為卵巢癌的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，但FR+-CTC與CA125、HE4無(wú)顯著相關(guān)性。相關(guān)研究[29]報(bào)道，卵巢癌晚期患者的平均CTC計(jì)數(shù)高于卵巢癌Ⅰ～Ⅱ期患者。本研究還發(fā)現(xiàn)，相較于Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌患者, Ⅲ～Ⅳ期卵巢癌患者中更易檢出FR+-CTC陽(yáng)性、CA125陽(yáng)性，且FR+-CTC陽(yáng)性患者中Ⅰ～Ⅱ期者占比相較于CA125陽(yáng)性患者中更高，即CTC比CA125更靈敏，可輔助診斷早期卵巢癌。

綜上所述，卵巢癌患者外周血FR+-CTC含量較健康人顯著升高，治療后外周血FR+-CTC含量較治療前有所下降，且FR+-CTC陽(yáng)性患者中Ⅰ～Ⅱ期者占比相較于CA125陽(yáng)性患者中更高，表明FR+-CTC可用于卵巢癌的早期輔助診斷和療效監(jiān)測(cè)，為卵巢癌的早診斷、早治療提供參考依據(jù)，進(jìn)而改善卵巢癌患者的預(yù)后。此外, CA125、HE4對(duì)卵巢癌具有良好的診斷價(jià)值，故推測(cè)FR+-CTC聯(lián)合CA125、HE4檢測(cè)可進(jìn)一步提高卵巢癌的早期檢出率，但未來(lái)還需開(kāi)展大量研究加以證實(shí)。