呂蒙瑩, 羅照勇, 王維民, 梁巧玲,王 楊, 錢亞云, 劉延慶

(1. 揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院/轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院, 江蘇 揚(yáng)州, 225001;2. 國家中醫(yī)藥管理局胃癌毒邪論治重點(diǎn)研究室, 江蘇 揚(yáng)州, 225001)

結(jié)直腸癌是人類常見的惡性腫瘤之一, 發(fā)病率和病死率在全球分別位居惡性腫瘤的第3位和第2位[1], 其臨床治療方法以手術(shù)為主, 且術(shù)后輔以放化療。近年來，隨著靶向生物制劑的使用，結(jié)直腸癌的治療取得了重要進(jìn)展，但轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌仍然是治療的難點(diǎn)，約35%結(jié)直腸癌患者在初次診斷時(shí)已進(jìn)入轉(zhuǎn)移期，而多達(dá)50%的非轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌最終也會(huì)進(jìn)展為轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌[2]。目前, 5-氟尿嘧啶、奧沙利鉑和伊立替康等藥物仍然是結(jié)直腸癌的主要化療用藥，但其毒副作用往往導(dǎo)致患者治療依從性較差[3]。因此，從中草藥中探尋治療效果好且副作用低的活性成分已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。扁蒴藤素作為一種天然的三萜類化合物，在自然界中主要分布于衛(wèi)矛科和翅子藤科植物中，具有抗癌、消炎、殺菌、抗瘧等藥理作用[4]。已有研究[5]表明，扁蒴藤素主要通過抑制生長，誘導(dǎo)自噬和凋亡，抑制侵襲、遷移和血管生成，逆轉(zhuǎn)耐藥和協(xié)同化療藥物等方式發(fā)揮體外抗腫瘤活性。扁蒴藤素對(duì)口腔癌[6]、結(jié)直腸癌[7]、乳腺癌[8]、肺癌[9]和前列腺癌[10]等多種腫瘤細(xì)胞具有抑制作用，但其分子機(jī)制尚未闡明。本研究探討扁蒴藤素對(duì)人結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移和細(xì)胞周期的影響及其作用機(jī)制，以期為后續(xù)深入研究分子機(jī)制和治療靶點(diǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 細(xì)胞株: 人結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞和HT29細(xì)胞，購于武漢普諾賽科技有限公司。細(xì)胞以含10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。

1.1.2 藥物與試劑: 扁蒴藤素(批號(hào)0476159-13, 純度≥98%)購自美國Cayman 化學(xué)公司, RPMI 1640培養(yǎng)基(貨號(hào)SH30 809.01)購自美國Hyclone公司，胎牛血清(貨號(hào)04-001-1ACS)購自以色列BI公司，噻唑藍(lán)(MTT)粉劑(貨號(hào)ST1537)和二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒(貨號(hào)P0012)購自上海碧云天生物公司。Transwell小室(貨號(hào)3422)購自美國Costar公司, 5-乙炔基-2′-脫氧尿苷(EdU)試劑盒(貨號(hào)C10310)購自廣州銳博生物科技有限公司。兔抗人單克隆抗體GAPDH(貨號(hào)5174s)、p21(貨號(hào)2947)、p27(貨號(hào)2552)、p53(貨號(hào)2527T)、cyclin E1(貨號(hào)20808s)、CDK2(貨號(hào)2546s)、Akt(貨號(hào)4691T)、p-Akt(貨號(hào)4060T)、PI3K(貨號(hào)4292)、mTOR(貨號(hào)2983)、p-mTOR(貨號(hào)5536)均購自美國CST公司, p-PI3K(貨號(hào)abs130868)購自上海愛必信生物科技有限公司，山羊抗兔二抗(貨號(hào)FMS-Rb01)購自中國南京福麥斯公司。

1.1.3 儀器: 恒溫培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)，蛋白電泳槽、全自動(dòng)酶標(biāo)儀、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)成像分析儀(美國Bio-Rad 公司)，倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)，流式細(xì)胞儀(美國BD公司)。

1.2 方法

1.2.1 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞存活率: 將對(duì)數(shù)生長期的HCT116細(xì)胞和HT29細(xì)胞接種于96 孔板(5×103個(gè)/孔)，實(shí)驗(yàn)分別設(shè)置對(duì)照組(不加藥物處理)、空白組(只含培養(yǎng)基)和藥物組(分別加入不同濃度扁蒴藤素)，每組均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。藥物組加入無血清培養(yǎng)基配置的不同濃度(0.5、1、2、4、8 μmol/L)扁蒴藤素孵育12、24、36、48、60 h后，每孔加入20 μL 0.5% MTT繼續(xù)培養(yǎng) 4 h。棄上清，每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO), 于搖床上低速振蕩10 min, 用多功能酶標(biāo)儀于490 nm處測(cè)量各孔吸光度(A)值。根據(jù)公式計(jì)算存活率，存活率=[1-(A對(duì)照組-A藥物組)/(A對(duì)照組-A空白組)]×100%。

1.2.2 EdU實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖: 將HCT116細(xì)胞和HT29細(xì)胞接種于24孔板(8×103個(gè)/孔)，實(shí)驗(yàn)分別設(shè)置對(duì)照組和藥物組，每組均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。根據(jù)HCT116細(xì)胞、HT29細(xì)胞24 h半數(shù)抑制濃度(IC50)(0.85、2.89 μmol/L), HCT116細(xì)胞分別用0.5、1、2 μmol/L扁蒴藤素處理24 h, HT29細(xì)胞分別用1、2、4 μmol/L扁蒴藤素處理24 h。待細(xì)胞貼壁后，嚴(yán)格按照EdU試劑盒說明書操作，每孔加入100 μL含EdU探針的培養(yǎng)基(50 pmol/L), 37 ℃、5%CO2孵育2 h后，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗, 4%多聚甲醛固定，每孔隨機(jī)選取5個(gè)視野于顯微鏡下分別計(jì)數(shù)視野下EdU探針標(biāo)記的帶有紅色熒光的細(xì)胞和Hoechst 33342標(biāo)記的帶有藍(lán)色熒光的細(xì)胞，每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。陽性細(xì)胞率=EdU標(biāo)記的細(xì)胞數(shù)/Hoechst 33342標(biāo)記的細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.3 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移: 將對(duì)數(shù)生長期的HCT116細(xì)胞和HT29細(xì)胞于Transwell上層小室中接種(5×104個(gè)/孔)，向下層小室中加入600 μL培養(yǎng)基(含10%FBS), 上下層之間防止氣泡產(chǎn)生。2種細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)分別設(shè)置對(duì)照組和藥物組，每組均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。HCT116細(xì)胞分別用0.5、1、2 μmol/L扁蒴藤素處理24 h，HT29細(xì)胞分別用1、2、4 μmol/L扁蒴藤素處理24 h。將Transwell小室取出，用PBS清洗，用棉簽輕輕去除上室膜表面的細(xì)胞，于甲醇中進(jìn)行固定，并用結(jié)晶紫進(jìn)行染色, PBS清洗3遍。每孔隨機(jī)選取5個(gè)視野于倒置顯微鏡下進(jìn)行拍照分析。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期: 將對(duì)數(shù)生長期HCT116細(xì)胞和HT29細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，接種于直徑60 mm的培養(yǎng)皿中。HCT116細(xì)胞-對(duì)照組、HT29細(xì)胞-對(duì)照組細(xì)胞均不加藥物處理, HCT116細(xì)胞-扁蒴藤素組細(xì)胞以0.85 μmol/L扁蒴藤素處理，HT29細(xì)胞-扁蒴藤素組細(xì)胞以2.89 μmol/L 扁蒴藤素處理。24 h后，收集細(xì)胞至離心管內(nèi)并進(jìn)行固定，每管加入碘化丙啶(PI)染色液(500 μL)在37 ℃條件下避光孵育30 min后，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，并應(yīng)用FlowJo 7.6軟件進(jìn)行細(xì)胞DNA含量分析。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測(cè)蛋白表達(dá): 將對(duì)數(shù)生長期的HCT116細(xì)胞和HT29細(xì)胞接種于直徑100 mm的培養(yǎng)皿中。待細(xì)胞貼壁后, HCT116細(xì)胞、HT29細(xì)胞的對(duì)照組均不加藥物處理, HCT116細(xì)胞的扁蒴藤素組以0.85 μmol/L扁蒴藤素處理, HT29細(xì)胞的扁蒴藤素組以2.89 μmol/L扁蒴藤素處理。24 h后提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。細(xì)胞總蛋白經(jīng)蛋白變性后再進(jìn)行SDS-PAGE, 然后電轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，室溫下用TBST溶液(含有5%脫脂奶粉)封閉 2 h, 加入一抗(濃度1∶1 000), 放置于4 ℃搖床上孵育過夜，再用TBST清洗3遍，二抗(濃度1∶5 000)室溫孵育2 h, 應(yīng)用電化學(xué)發(fā)光(ECL)系統(tǒng)檢測(cè)蛋白表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 扁蒴藤素對(duì)HCT116細(xì)胞和HT29細(xì)胞存活率的影響

12 h時(shí), 1、2、4、8 μmol/L扁蒴藤素處理的HCT116細(xì)胞存活率低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001); 24、36、48、60 h時(shí)，0.5、1、2、4、8 μmol/L扁蒴藤素處理的HCT116細(xì)胞存活率低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001); 12 h時(shí)，2、4、8 μmol/L扁蒴藤素處理的HT29細(xì)胞存活率低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001); 24 h時(shí)，1、2、4、8 μmol/L扁蒴藤素處理的HT29細(xì)胞存活率低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001); 36、48、60 h時(shí), 0.5、1、2、4、8 μmol/L扁蒴藤素處理的HT29細(xì)胞存活率低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001), 見圖1。由此表明，扁蒴藤素對(duì)HCT116細(xì)胞和HT29細(xì)胞活力有明顯抑制作用，且呈時(shí)間和濃度依賴性。此外，扁蒴藤素對(duì)HCT116細(xì)胞作用24 h的IC50為0.85 μmol/L, 對(duì)HT29細(xì)胞作用24 h的IC50為2.89 μmol/L。

A: 不同濃度扁蒴藤素對(duì)HCT116細(xì)胞存活率的影響(與對(duì)照組比較 ,***P<0.001);B: 不同濃度扁蒴藤素對(duì)HT29細(xì)胞存活率的影響(與對(duì)照組比較, ***P<0.001)。圖1 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度扁蒴藤素對(duì)人結(jié)直腸癌細(xì)胞存活率的影響

2.2 扁蒴藤素對(duì)HCT116細(xì)胞和HT29細(xì)胞增殖的影響

EdU實(shí)驗(yàn)(藍(lán)色熒光代表以Hoechst 33342標(biāo)記的活細(xì)胞，紅色熒光代表以EdU標(biāo)記的正在進(jìn)行DNA復(fù)制的增殖細(xì)胞)結(jié)果顯示，經(jīng)0.5、1、2 μmol/L扁蒴藤素處理24 h后, HCT116細(xì)胞中陽性細(xì)胞率低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001); 經(jīng)1、2、4 μmol/L扁蒴藤素處理24 h后，HT29細(xì)胞中陽性細(xì)胞率低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001), 見圖2。由此表明，扁蒴藤素能夠抑制HCT116細(xì)胞和HT29細(xì)胞增殖，并具有濃度依賴性。

A: 不同濃度扁蒴藤素對(duì)HCT116細(xì)胞增殖的影響(與對(duì)照組比較, ***P<0.001); B: 不同濃度扁蒴藤素對(duì)HT29細(xì)胞增殖的影響(與對(duì)照組比較, ***P<0.001)。圖2 EdU實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度扁蒴藤素對(duì)人結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的影響

2.3 扁蒴藤素對(duì)HCT116細(xì)胞和HT29細(xì)胞遷移的影響

Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，加入0.5、1、2 μmol/L 扁蒴藤素作用24 h后, HCT116細(xì)胞穿透小室底膜的數(shù)量變少，且細(xì)胞遷移率低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001); 加入1、2、4 μmol/L扁蒴藤素作用24 h后, HT29細(xì)胞穿透小室底膜的數(shù)量變少，且細(xì)胞遷移率低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001), 見圖3。由此表明，扁蒴藤素能夠抑制HCT116細(xì)胞和HT29細(xì)胞遷移，且具有濃度依賴性。

A: 不同濃度扁蒴藤素對(duì)HCT116細(xì)胞遷移的影響(與對(duì)照組比較, ***P<0.001); B: 不同濃度扁蒴藤素對(duì)HT29細(xì)胞遷移的影響(與對(duì)照組比較, ***P<0.001)。圖3 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度扁蒴藤素對(duì)人結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移的影響

2.4 扁蒴藤素對(duì)HCT116細(xì)胞和HT29細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示, HCT116-扁蒴藤素組、HT29-扁蒴藤素組處于G0/G1期的細(xì)胞百分比分別高于HCT116-對(duì)照組、HT29-對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 說明扁蒴藤素可阻滯細(xì)胞周期于G0/G1期，見圖4。Western blot結(jié)果顯示, HCT116細(xì)胞、HT29細(xì)胞的扁蒴藤素組p53、p21、p27蛋白表達(dá)量均分別高于HCT116細(xì)胞、HT29細(xì)胞的對(duì)照組, cyclin E1、CDK2蛋白表達(dá)量均分別低于HCT116細(xì)胞、HT29細(xì)胞的對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01或P<0.001), 說明扁蒴藤素能夠上調(diào)人結(jié)直腸癌細(xì)胞周期蛋白p53、p21、p27表達(dá)并抑制cyclin E1、CDK2表達(dá)，見圖5。

A: HCT116-對(duì)照組細(xì)胞周期百分比; B: HCT116-扁蒴藤素組細(xì)胞周期百分比; C: HT29-對(duì)照組細(xì)胞周期百分比; D: HT29-扁蒴藤素組細(xì)胞周期百分比。圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)扁蒴藤素對(duì)HCT116細(xì)胞和HT29細(xì)胞周期的影響

A: 扁蒴藤素對(duì)HCT116細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)的影響(與對(duì)照組比較, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001); B: 扁蒴藤素對(duì)HT29細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)的影響(與對(duì)照組比較, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001)。圖5 Western blot檢測(cè)扁蒴藤素對(duì)人結(jié)直腸癌細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.5 扁蒴藤素對(duì)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響

Western blot結(jié)果顯示, HCT116細(xì)胞、HT29細(xì)胞的扁蒴藤素組p-Akt、p-PI3K、mTOR、p-mTOR蛋白表達(dá)量均分別低于HCT116細(xì)胞、HT29細(xì)胞的對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01或P<0.001), 見圖6。由此提示，扁蒴藤素可能通過調(diào)控PI3K/Akt/mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮抑制HCT116細(xì)胞、HT29細(xì)胞增殖和遷移的作用。

A: 扁蒴藤素對(duì)HCT116細(xì)胞PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響(與對(duì)照組比較, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001); B: 扁蒴藤素對(duì)HT29細(xì)胞PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響(與對(duì)照組比較, **P<0.01, ***P<0.001)。圖6 Western blot檢測(cè)扁蒴藤素對(duì)人結(jié)直腸癌細(xì)胞PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

盡管結(jié)直腸癌治療方案眾多，如手術(shù)、放療、化療、靶向治療和基因治療等，但轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者的5年總生存率仍僅維持在10%[11]。

結(jié)直腸癌早期(Ⅰ期和Ⅱ期)患者通常采用無輔助治療的標(biāo)準(zhǔn)結(jié)腸切除術(shù)(伴淋巴結(jié)切除術(shù))進(jìn)行治療，而晚期(Ⅲ期和Ⅳ期)患者大多采用放化療進(jìn)行治療，以降低復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，但大部分晚期患者都會(huì)發(fā)展為轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌(主要轉(zhuǎn)移至肝臟)，這是目前結(jié)直腸癌治療中的難點(diǎn)[12]。化療藥物副作用較大，且價(jià)格昂貴，因此有必要從天然植物中尋找副作用小且價(jià)格低廉的新型抗腫瘤藥物。

結(jié)直腸癌屬中醫(yī)“積聚”“腸覃”“鎖肛痔”等范疇，其主要病機(jī)為七情內(nèi)傷、飲食不節(jié)、肝腎虧虛以致外邪乘虛而入或毒邪積聚而內(nèi)[13]。中醫(yī)理論將結(jié)直腸癌辨證分為脾虛濕毒、脾腎兩虛、肝腎陰虛、氣血虧虛和濕熱瘀毒5種類型[14]。扁蒴藤素是衛(wèi)矛科南蛇藤屬植物的主要活性成分之一，該類植物主要特征為性辛溫，具有祛風(fēng)除濕、行氣散血、消腫解毒的功效，故推測(cè)扁蒴藤素可能更適用于濕熱瘀毒型腫瘤?！端貑枴ぶ琳嬉笳摗分赋? “主病之謂君，佐君之謂臣，應(yīng)臣之謂使?！本幨侵兴幏絼┲袑?duì)疾病起主要治療作用的藥物[15], 扁蒴藤素作為一種天然的五環(huán)三萜類化合物，對(duì)多種腫瘤細(xì)胞均有明顯抑制作用，按照中藥方劑“君臣佐使”的思想，其或可行“君藥”之效。

本研究MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, HT29細(xì)胞24 h的IC50值是HT116細(xì)胞的3倍以上，說明HCT116細(xì)胞相較于HT29細(xì)胞對(duì)扁蒴藤素更為敏感，但隨著藥物作用時(shí)間的延長, 2種細(xì)胞的細(xì)胞活力均受到顯著抑制; EdU實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, HCT116細(xì)胞的增殖和遷移能力均強(qiáng)于HT29細(xì)胞，但隨著扁蒴藤素濃度的增加，2種細(xì)胞的增殖和遷移均受到顯著抑制; 流式細(xì)胞術(shù)和Western blot結(jié)果表明，扁蒴藤素對(duì)HCT116細(xì)胞和HT29細(xì)胞的作用機(jī)制可能與調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程和影響PI3K/Akt/mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。鑒于扁蒴藤素可阻滯HCT116細(xì)胞和HT29細(xì)胞周期于G0/G1期，本研究進(jìn)一步采用Western blot對(duì)關(guān)鍵的細(xì)胞周期調(diào)控因子如細(xì)胞周期蛋白(cyclin)、細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶(CDKs)和細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶抑制物(CKIs)表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)[16]。CDK2的活性依賴于與cyclin E結(jié)合形成的cyclin E-CDK2復(fù)合物，可調(diào)控細(xì)胞周期中的G1/S期過渡[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，扁蒴藤素能夠降低cyclin E1和CDK2的表達(dá)，使細(xì)胞周期不能進(jìn)展到S期，而被阻滯在G0/G1期。p21和p27均屬于CKIs, 其中p21可被p53誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄，也可抑制cyclin E-CDK2蛋白復(fù)合物的活性，而p27可抑制CDK2的活性[18-19]。本研究結(jié)果顯示，扁蒴藤素能顯著上調(diào)p21、p27和p53蛋白表達(dá)，說明扁蒴藤素可通過調(diào)控cyclins/CDKs/CKIs網(wǎng)絡(luò)影響人結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116和HT29的細(xì)胞周期進(jìn)程。

PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路是人類癌癥中常見的信號(hào)通路之一，控制著許多關(guān)鍵的細(xì)胞過程，如生長、增殖、代謝和遷移等。Akt是這一信號(hào)級(jí)聯(lián)的關(guān)鍵效應(yīng)分子，在細(xì)胞生長、增殖、存活和代謝中發(fā)揮關(guān)鍵作用[20]。PI3K的磷酸化可以修飾Akt的蛋白結(jié)構(gòu)，進(jìn)而激活A(yù)kt, 調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移[21]。mTOR是PI3K/Akt通路的下游靶點(diǎn), p-Akt可通過激活mTOR而調(diào)控細(xì)胞代謝，如抑制細(xì)胞增殖和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，參與腫瘤進(jìn)程和化療耐藥，已有臨床研究[22-23]將靶向mTOR的抑制劑應(yīng)用于腫瘤治療中，并發(fā)現(xiàn)具有PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路抑制作用的天然產(chǎn)物具有重要意義。PI3K/Akt/mTOR失調(diào)與許多實(shí)體腫瘤的發(fā)展有關(guān)，相關(guān)研究[24-25]發(fā)現(xiàn)，抑制PI3K/Akt/mTOR通路能夠誘導(dǎo)胃癌和肝癌細(xì)胞G1期阻滯。此外，扁蒴藤素可通過降低PI3K/Akt/mTOR通路相關(guān)蛋白p-Akt、p-mTOR的表達(dá)而抑制骨肉瘤細(xì)胞的生長[26]。在葡萄膜黑色素瘤UM-1細(xì)胞中，扁蒴藤素可通過抑制PI3K/Akt/FoxO3a信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[27]。本研究Western blot結(jié)果顯示，扁蒴藤素能夠顯著降低HCT116細(xì)胞、HT29細(xì)胞中的p-PI3K、p-Akt、p-mTOR表達(dá)水平，表明扁蒴藤素可能通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的激活而抑制HCT116細(xì)胞、HT29細(xì)胞的增殖和遷移。

綜上所述，扁蒴藤素能夠抑制人結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞和HT29細(xì)胞的增殖和遷移，并阻滯細(xì)胞周期于G0/G1期，其分子機(jī)制可能與影響細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)和調(diào)控PI3K/Akt/mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。今后，研究人員將應(yīng)用PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)抑制劑進(jìn)行反向驗(yàn)證，并深入開展相應(yīng)的體內(nèi)研究，從而進(jìn)一步證實(shí)扁蒴藤素的生物學(xué)作用。