劉艷秋, 范海迪, 孫 健, 薛 蓮, 孟 月, 林 寧

(1. 江蘇省淮安市第一人民醫(yī)院分院 檢驗科, 江蘇 淮安, 223002;2. 南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院 檢驗科, 江蘇 淮安, 223300)

2型糖尿病(T2DM)的特點是胰島β細(xì)胞功能失調(diào)或者胰島素抵抗，傳統(tǒng)的危險因素有高血壓、肥胖和血脂異常等，慢性炎性反應(yīng)也是其發(fā)病機制之一[1-2]。作為新的輔助型T淋巴細(xì)胞(Th細(xì)胞)亞群, Th22細(xì)胞主要分泌白細(xì)胞介素22 (IL-22)。Th22細(xì)胞與IL-22在惡性腫瘤、自身免疫性疾病及多種炎癥疾病中發(fā)揮著重要作用[3]。蔣茂芹等[4]研究報道，胃癌組織中IL-22、白細(xì)胞介素22結(jié)合蛋白(IL-22BP)呈高表達(dá)，且二者表達(dá)水平與胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)，或可協(xié)同促進胃癌的發(fā)生發(fā)展。在高糖導(dǎo)致的胰島素抵抗和糖尿病并發(fā)癥中，炎性介質(zhì)起重要的作用[5]。研究[6-7]報道，當(dāng)發(fā)生糖尿病和胰島素抵抗時, c-Jun氨基末端激酶(JNK)和IKKβ/NF-κB 會激活，引起白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-18、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和IL-1β等炎癥因子的大量釋放。大量的炎癥因子會造成胰腺中β細(xì)胞破壞以及胰島素抵抗的發(fā)生，因此炎癥因子被認(rèn)為是導(dǎo)致糖尿病并發(fā)癥的主要因素[8-9]。本研究對2型糖尿病患者血液中Th22細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子芳香烴受體(AhR) mRNA水平及其功能分子IL-22進行檢測，并分析其相關(guān)因素，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年7月—2020年7月在淮安市第一人民醫(yī)院分院就診的患者為研究對象并分為3組。① T2DM組納入48例，患者均符合2010年中國糖尿病協(xié)會發(fā)布的糖尿病防治指南的診斷標(biāo)準(zhǔn); 男25例，女23例，年齡37～78歲，平均(57.24±10.83)歲; 空腹血糖(FPG)≥ 7.0 mmol/L、餐后2 h血糖(2 hPG)≥ 11.1 mmol/L為糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)。② 糖尿病前期組納入49例，男24例，女25例，年齡35～75歲，平均(54.86±9.01)歲; 患者疾病類型分為空腹血糖受損(IGF)和糖耐量異常(IGT), IGF的診斷標(biāo)準(zhǔn)為FPG為6.1～6.9 mmol/L且 2 hPG<7.8 mmol/L, IGT的診斷標(biāo)準(zhǔn)為FPG<7.0 mmol/L且2 hPG為7.8～11.1 mmol/L。③ 選取同期在本院體檢的健康者50例為對照組，男25例，女25例，年齡34～77歲，平均(55.12±10.99)歲。排除抗谷氨酸脫羧酶抗體(GAD-Ab)、抗胰島素抗體(IAA)、抗胰島細(xì)胞抗體(ICA)陽性的成人隱匿性自身免疫性糖尿病(LADA)和1型糖尿病患者，排除合并糖尿病并發(fā)癥、感染、腫瘤等患者。

1.2 研究方法

記錄各組患者的身高、體質(zhì)量，計算體質(zhì)量指數(shù)(BMI); 應(yīng)用Bio-Rad血紅蛋白測試系統(tǒng)及離子交換高壓液相法(HPLC)檢測受試者全血中的糖化血紅蛋白(HbA1c)水平。采用日立7600型自動生化分析儀測定空腹血清FPG、甘油三酯(TG)、膽固醇(CHO)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、餐后血糖(PPG)和超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)含量。血清空腹胰島素(FINS)水平采用深圳新產(chǎn)業(yè)MAGLUMIX8型全自動化學(xué)發(fā)光儀檢測。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定各組血清IL-22水平，血清IL-22檢測試劑盒購自美國Rapidbio(RB)公司。采集外周靜脈血5 mL于EDTA抗凝管中，采用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法及淋巴細(xì)胞分離液分離出單個核細(xì)胞(PBMCs)，利用Trizol法提取 PBMCs總RNA。

采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)法測定全血單個核細(xì)胞中AhRmRNA水平的表達(dá)，實時熒光定量PCR儀為美國NanoDrop公司ND-1000型，使用美國invitrogen公司RNA提取試劑盒，采用日本Takara公司生產(chǎn)的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及PCR定量反應(yīng)試劑盒，測定試劑包括總RNA提取試劑Trizol、第1鏈cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR熒光定量試劑盒等。引物序列由上海生工生物技術(shù)有限公司設(shè)計并合成，序列如下:AhRmRNA的上游引物為5′-ACTCCACTTCAGCCACCATC-3′, 下游引物為 5′-ATGGGACTCGGCACAATAAA-3′, 擴增片段204 bp。內(nèi)參采用β-actin: 上游引物為5′-CACGAAACTACCTTCAACTCC-3′, 下游引物為5′-CATACTCCTGCTTGCTGATC-3′, 擴增片段262 bp。

PCR實驗結(jié)束后，設(shè)置閾值和基線，得出Ct值; Ct值是熱循環(huán)儀檢測到反應(yīng)體系中熒光信號到達(dá)設(shè)定閾值所經(jīng)歷循環(huán)數(shù), ΔCt實驗組=(Ct實驗組目的基因-Ct實驗組內(nèi)參基因), ΔCt對照組= (Ct對照組目的基因-Ct對照組內(nèi)參基因), 2-ΔCt即為各組目的基因的相對表達(dá)含量。PCR擴增產(chǎn)物的特異性通過溶解曲線分析，以此排除其他副反應(yīng)產(chǎn)物(例如二聚體)的影響。計算各組目的基因AhRmRNA的相對表達(dá)含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析和處理。計量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，各指標(biāo)間相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 3組一般資料比較

糖尿病前期組、T2DM組FBG、TG、PPG、HbA1c、hs-CRP均高于對照組, T2DM組HDL-C低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01); T2DM組FBG、TG、PPG、HbA1c高于糖尿病前期組, HDL-C低于糖尿病前期組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。見表1。

表1 各組一般資料比較

2.2 各組FINS、IL-22、AhR mRNA相對表達(dá)量比較

目的基因AhRmRNA與內(nèi)參基因β-actin的溶解曲線均呈現(xiàn)單峰，證明引物的特異性良好，見圖1。糖尿病前期組FINS、血清IL-22高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01); 糖尿病前期組AhRmRNA相對表達(dá)含量較對照組升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05); T2DM組FINS、血清IL-22、AhRmRNA相對表達(dá)含量均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01); T2DM組FINS、IL-22、AhRmRNA相對表達(dá)含量高于糖尿病前期組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表2。

圖1 AhR mRNA擴增曲線及溶解曲線

表2 各組FINS、IL-22、AhR mRNA相對表達(dá)量比較

2.3 Pearson相關(guān)性分析

AhRmRNA、IL-22與年齡、CHO、TG、LDL-C、BMI均無相關(guān)性(P>0.05), 與FBG、FINS、PPG、HbA1c、hs-CRP呈正相關(guān)(P<0.05或P<0.01), 見表3。

表3 AhR mRNA、IL-22與臨床指標(biāo)的相關(guān)性

3 討 論

T2DM作為代謝性疾病之一，其發(fā)病率逐年上升，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。因此，預(yù)防和治療糖尿病意義重大。有關(guān)研究[10-12]表明，在存在胰島素抵抗的糖尿病患者中, Th22細(xì)胞的數(shù)量及外周血IL-22 水平明顯升高。有學(xué)者[13-14]研究發(fā)現(xiàn), Th22細(xì)胞及其相關(guān)因子IL-22可促進糖尿病患者肥胖及脂肪組織炎癥的發(fā)展，并參與胰島素抵抗及加重血管壁損傷。唐雪嬌等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在高糖誘導(dǎo)心肌肥大的過程中，心肌細(xì)胞AhR的表達(dá)增加可能參與維持正常糖代謝過程，并且高糖環(huán)境能激活A(yù)hR轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)，從而上調(diào)細(xì)胞色素P450家族成員1A1(CYP1A1)的表達(dá)，以促進活性氧(ROS)的生成，這可能是導(dǎo)致高糖誘導(dǎo)心肌肥大的重要機制之一。AhR是一種被配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，其在細(xì)胞生長、分化、免疫、凋亡等方面發(fā)揮功能，尤其在調(diào)控藥物方面發(fā)揮非常重要的功能[16-17]。由于Th22細(xì)胞亞群主要效應(yīng)細(xì)胞因子IL-22 的受體主要分布的部位是外周組織，因此被認(rèn)為是直接向周圍組織傳遞炎癥效應(yīng)信號的重要細(xì)胞亞群。BAKER N A等[18]、BILJES D等[19]實驗證明AhR的表達(dá)異常將導(dǎo)致糖脂代謝失衡，說明AhR在機體調(diào)節(jié)糖脂代謝過程中起關(guān)鍵作用, AhR可能是糖尿病發(fā)病的關(guān)鍵因素。

研究[20-22]顯示外周血Th22細(xì)胞除了特異性分泌IL-22以外，也可分泌IL-17、TNF-α等炎癥因子，在自身免疫性疾病、炎癥性疾病、惡性腫瘤患者血液中明顯升高，并與病情嚴(yán)重程度及預(yù)后相關(guān)。IL-22在T2DM中的確切作用和機制尚不清楚，可能通過抑制氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激以及保護胰島B細(xì)胞等調(diào)節(jié)葡萄糖代謝，也可能誘導(dǎo)免疫細(xì)胞分泌炎癥因子而加劇慢性炎癥反應(yīng)[23]。HERDER C等[24]采用多因素調(diào)查顯示IL-22水平與糖尿病的不同代謝狀態(tài)不是獨立相關(guān)的，血清IL-22水平也不是T2DM發(fā)病風(fēng)險的獨立相關(guān)因素, IL-22基因缺失并不會加重高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖和胰島素抵抗。FABBRINI E等[11]認(rèn)為IL-22可減輕胰島素介導(dǎo)的抑制肝細(xì)胞葡萄糖生成作用，可以干擾肝臟的糖代謝，通過增加肝臟葡萄糖的產(chǎn)生而升高血糖。IL-22在2型糖尿病中的確切作用機制尚不完全明確，有可能通過抑制氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激以及保護胰島B細(xì)胞來調(diào)節(jié)葡萄糖的代謝能力。本研究結(jié)果顯示, T2DM組血清IL-22的表達(dá)水平高于糖尿病前期組及對照組，糖尿病前期組IL-22高于對照組，提示IL-22在糖尿病的發(fā)病機制中起著重要的作用;AhRmRNA、IL-22水平與FBG、FINS、PPG、HbA1c、hs-CRP呈正相關(guān),AhRmRNA、IL-22可能與糖尿病的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。

綜上所述，通過檢測AhRmRNA、IL-22水平對T2DM患者進行病情評估和預(yù)后判斷具有一定的臨床意義,AhRmRNA、IL-22或可成為糖尿病治療研究的新靶標(biāo)。