高新躍, 馮羽敬, 包 蓉, 黃朝朝, 貢 瞻, 周宇杰

(上海市浦東新區(qū)浦南醫(yī)院 麻醉科, 上海, 200125)

炎癥是機(jī)體抵御外來病原體感染發(fā)生各種病理反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)，會(huì)造成組織細(xì)胞損害[1]。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)主要由單核巨噬細(xì)胞分泌，可誘導(dǎo)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)和巨噬細(xì)胞表達(dá)白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)，在免疫細(xì)胞功能調(diào)節(jié)中有重要作用，其中IL-1β是反映全身和局部炎癥反應(yīng)的重要物質(zhì)[2]。相關(guān)研究[3]表明，過度的炎癥反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致線粒體功能受損，生成大量活性氧(ROS), 加重炎癥反應(yīng)，嚴(yán)重時(shí)還會(huì)導(dǎo)致線粒體凋亡和細(xì)胞死亡。血紅素加氧酶-1(HO-1)是體內(nèi)重要的誘導(dǎo)型抗氧化酶，正常情況下表達(dá)極少，在內(nèi)毒素脂多糖(LPS)、炎癥因子、ROS等刺激下可大量表達(dá)[4]。相關(guān)研究[5-7]發(fā)現(xiàn), RAW264.7巨噬細(xì)胞可表達(dá)HO-1, 抑制TNF-α、IL-1β和IL-6等炎癥因子的釋放。但HO-1抑制炎癥反應(yīng)是否與線粒體功能有關(guān)目前尚未完全闡明，鑒于此，本研究分析了HO-1抑制TNF-α、IL-1β、ROS合成與線粒體分裂的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料

RAW264.7巨噬細(xì)胞(批號(hào)FH0318), 購(gòu)自富衡生物科技有限公司; LPS(批號(hào)HY-D1056)、HO-1誘導(dǎo)劑血紅素(Hemin, 批號(hào)HY-19424)、HO-1拮抗劑鋅原卟啉-IX(ZnPP-IX, 批號(hào)HY-101193)、線粒體自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA, 批號(hào)HY-19312)、線粒體自噬促進(jìn)劑雷帕霉素(RAPA, 批號(hào)AY-22989), 購(gòu)自美國(guó)NCE生物公司; HO-1抗體(批號(hào)AF5393)、IL-1β抗體(批號(hào)AF5103)、TNF-α抗體(批號(hào)AF7014)、購(gòu)自中國(guó)Affinity生物公司; 自噬標(biāo)志物微管相關(guān)蛋白1A/1B輕鏈3B(LC3B, 批號(hào)AF5402), 購(gòu)自美國(guó)Proteintech生物公司; ROS檢測(cè)試劑盒(批號(hào)S0033S)、Western及IP細(xì)胞裂解液(批號(hào)P0013)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量分析試劑盒(增強(qiáng)型)(批號(hào)P0010)，購(gòu)自中國(guó)碧云天生物技術(shù)公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組與處理

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，將其隨機(jī)分為空白對(duì)照組(C組)、LPS造模組(CL組)、Hemin+LPS組(HL組)、ZnPP-IX+LPS組(ZL組)、3-MA+LPS組(ML組)、RAPA+LPS組(RL組)，共計(jì)6組。C組: 繼續(xù)培養(yǎng)，不做任何處理; CL組: 加入1 μg/mL LPS孵育; HL組: 加入30 mol/L Hemin孵育1 h后，加入1 μg/mL LPS孵育; ZL組: 加入5 μmo1/L ZnPP-IX孵育0.5 h后，加入1 μg/mL LPS孵育; ML組: 加入5 mmo1/L 3-MA孵育0.5 h后，加入1 μg/mL LPS孵育; RL組: 加入12.5 nmo1/L RAPA孵育0.5 h后，加入1 μg/mLLPS孵育。各組于培養(yǎng)后LPS孵育48 h后，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定。

1.3 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測(cè)蛋白表達(dá)量

采用凝膠電泳法進(jìn)行HO-1、IL-1β、TNF-α、線粒體動(dòng)力蛋白1(DRP1)、受體裂變蛋白1(FIS1)、LC3B、磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)檢測(cè)，使用Image J軟件分析各組目標(biāo)條帶灰度值與GAPDH灰度值的比值代表HO-1、IL-1β、TNF-α、LC3B、FIS1、DRP1的表達(dá)量。

1.4 ROS檢測(cè)

使用ROS檢測(cè)試劑盒進(jìn)行測(cè)定，采用熒光倒置顯微鏡觀察并拍照，以Image J 軟件分析ROS含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

與C組比較，另5組的HO-1、LC3B、ROS表達(dá)量均增加, DRP1表達(dá)量均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 與C組比較, CL組、ZL組和ML組的FIS1表達(dá)量均增加, HL組、RL組的FIS1表達(dá)量均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 與C組比較, HL組的IL-1β、TNF-α表達(dá)量均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與CL組比較, HL組的LC3B表達(dá)量降低, ZL組、ML組和RL組的LC3B表達(dá)量均增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 與CL組比較，HL組的TNF-α、IL-1β表達(dá)量均降低, RL組的IL-1β表達(dá)量增加、TNF-α表達(dá)量降低, ML組的TNF-α、IL-1β表達(dá)量增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 與CL組比較, HL組、RL組的ROS表達(dá)量降低, ZL組、ML組的ROS表達(dá)量增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。HL組的TNF-α、IL-1β、DRP1表達(dá)量低于另5組, HO-1表達(dá)量高于另5組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); RL組的FIS1表達(dá)量低于HL組, LC3B表達(dá)量高于HL組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。RL組的IL-1β、TNF-α、FIS1、DRP1、ROS表達(dá)量低于ML組, LC3B表達(dá)量高于ML組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 6組HO-1、IL-1β、TNF-α、LC3B、FIS1、DRP1和ROS表達(dá)量比較

3 討 論

控制過度的炎癥反應(yīng)，對(duì)于減少炎癥相關(guān)疾病和組織細(xì)胞損傷意義重大[8]。本研究中，實(shí)驗(yàn)采用的RAW264.7巨噬細(xì)胞是目前檢測(cè)抗炎癥反應(yīng)影響的最常用細(xì)胞[9]。離體實(shí)驗(yàn)和在體研究[10-11]證明, Hemin作為一種活性蛋白，可誘導(dǎo)HO-1大量表達(dá)，生成有活性的代謝物質(zhì)和重要的分子信號(hào)通路，顯著提高細(xì)胞和機(jī)體的存活率。本研究結(jié)果顯示，與C組、CL組、ZL組比較，HL組HO-1表達(dá)量增加, IL-1β、TNF-α、ROS表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 表明HO-1大量表達(dá)可減輕炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，與相關(guān)研究[12]結(jié)論一致。

線粒體自噬是維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要機(jī)制之一，可以消滅各種外來有害物質(zhì)和抑制氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、衰老和死亡等，其重要標(biāo)志是細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)自噬小體[13]。線粒體功能改變，往往表現(xiàn)為DRP1和FIS1增加。線粒體動(dòng)力學(xué)平衡，包括分裂/融合平衡[14]。相關(guān)研究[15]指出，F(xiàn)IS1作為一種重要的受體，可協(xié)助DRP1完成裂變事件。本研究結(jié)果顯示, RL組LC3B表達(dá)量高于C組、CL組、ML組, FIS1、DRP1表達(dá)量低于C組、CL組、ML組, IL-1β、TNF-α表達(dá)量低于ML組, ROS表達(dá)量低于CL組、HL組、ML組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 表明線粒體自噬有利于減輕氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。本研究還發(fā)現(xiàn), HL組的FIS1表達(dá)量低于ML組、高于RL組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 說明HO-1可以抑制線粒體分裂。

相關(guān)研究[14]證明, HO-1可抑制炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，調(diào)節(jié)線粒體分裂/融合平衡過程，減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)，HO-1和線粒體自噬均有利于減輕炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，說明HO-1有保護(hù)線粒體功能的作用。

綜上所述, HO-1可抑制線粒體分裂而降低炎癥因子表達(dá)，且效果優(yōu)于線粒體自噬。但本研究?jī)H觀察了FIS1的變化，并未綜合研究分裂/融合平衡的變化，說服力可能較弱，且僅從HO-1抑制LC3B、FIS1表達(dá)方面難以證明HO-1可以調(diào)節(jié)線粒體功能，進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng)，未來還需進(jìn)一步深入研究。