杜偉嬌，張家麗，于文文，沈夢(mèng)，曹水

大量研究已經(jīng)證實(shí)，乳腺癌、肺癌等多種實(shí)體腫瘤免疫微環(huán)境存在高度異質(zhì)性［1-3］。隨著抗腫瘤免疫治療的日益發(fā)展，通過(guò)腫瘤免疫評(píng)分來(lái)判斷預(yù)后及療效是研究的熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)髓系來(lái)源抑制細(xì)胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）可能有一定的預(yù)后預(yù)測(cè)作用［4-5］，乳腺癌腫瘤浸潤(rùn)MDSCs的預(yù)后意義尚不明確。有研究報(bào)道，即使早期乳腺癌也可以通過(guò)激活γ干擾素（interferon γ，IFNγ）信號(hào)通路的方式誘導(dǎo)系統(tǒng)性免疫改變，繼而影響外周血髓系及淋巴系細(xì)胞，提示這些免疫細(xì)胞可能反映了乳腺癌患者的總體免疫狀態(tài)［6］。乳腺癌腫瘤浸潤(rùn)MDSCs與外周血白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)及單核細(xì)胞/淋巴細(xì)胞比值（monocyte-tolymphocyte ratio，MLR）、中性粒細(xì)胞/淋巴細(xì)胞比值（neutrophil-to-lymphocyte ratio，NLR）相關(guān)性的研究尚鮮見報(bào)道。本課題組前期研究觀察到乳腺癌患者腫 瘤 組 織 中 浸 潤(rùn) 的 MDSCs 表 型 為L(zhǎng)in-CD33+CD13+CD14-CD15-［7］。本研究通過(guò)回顧性分析Ⅰ～Ⅲ期乳腺癌術(shù)后患者的腫瘤浸潤(rùn)MDSCs比例、血常規(guī)指標(biāo)及臨床病理特征，初步探索MDSCs與患者預(yù)后的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 回顧性分析天津市腫瘤醫(yī)院2009年2月—12月接受根治性乳腺癌手術(shù)及腫瘤組織MDSCs檢測(cè)的32例乳腺癌患者的血常規(guī)指標(biāo)、臨床病理資料，MDSCs 表型為L(zhǎng)in-CD33+CD13+CD14-CD15-，MDSCs比例指其在腫瘤單細(xì)胞懸液CD45+細(xì)胞中所占比例。具體檢測(cè)方法參照本課題組已發(fā)表的文獻(xiàn)［8］。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）組織病理學(xué)確定為原發(fā)性乳腺癌。（2）接受根治性手術(shù)治療的患者。（3）按照同期治療原則接受術(shù)后放化療及內(nèi)分泌治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）近1個(gè)月內(nèi)有感染癥狀。（2）自身免疫性疾病病史。（3）應(yīng)用激素治療。（4）失訪。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（批件號(hào)：

Ek2019143）。

32例患者均為女性，年齡30～65歲，中位年齡52歲。未絕經(jīng)17例，絕經(jīng)15例。病理類型（參照世界衛(wèi)生組織2003年分類標(biāo)準(zhǔn)）：浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌非特殊型26 例，浸潤(rùn)性小葉癌3例，浸潤(rùn)性乳頭狀癌1例，浸潤(rùn)性微小乳頭狀癌1例，小管癌1例。組織學(xué)分級(jí)：Ⅰ級(jí)1 例，Ⅱ級(jí)21 例，Ⅲ級(jí)4 例，未分級(jí)6例。根據(jù)美國(guó)腫瘤聯(lián)合會(huì)制定的第七版分期標(biāo)準(zhǔn)：ⅠA 期8例，ⅡA 期8 例，ⅡB 期4 例，ⅢA 期6 例，ⅢB 期1 例，ⅢC 期5期。T 分期：T1期9 例，T2期21 例，T3期1 例，T4期1 例。N 分期：N0期17例，N1期4例，N2期6例，N3期5例。脈管瘤栓陽(yáng)性1 例、陰性31 例。雌激素受體（ER）≥1%24 例、＜1%8 例；孕激素受體（PR）≥1% 27 例、＜1%5 例，人表皮生長(zhǎng)因子受體（HER）-2（-/+/++）28 例、HER-2（+++）4 例。Luminal A 型10例，Luminal B型15例，HER-2過(guò)表達(dá)型4例，三陰性3例。30例行乳腺癌根治術(shù)，2例行保乳手術(shù)。新輔助化療2例，術(shù)后輔助化療31 例。術(shù)后輔助放療11 例，術(shù)后輔助內(nèi)分泌治療20例。主要復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移部位：胸壁、肝、肺、骨。

1.2 隨訪 所有患者均通過(guò)電話或門診隨訪，隨訪截止時(shí)間2019年12月31日，隨訪5.9～125.7個(gè)月，中位隨訪時(shí)間122.2個(gè)月。無(wú)復(fù)發(fā)生存期（recurrence free survival time，RFS）定義為從手術(shù)切除到首次復(fù)發(fā)時(shí)間。5 年或10 年無(wú)復(fù)發(fā)生存率定義：從手術(shù)時(shí)間開始5 年或10 年無(wú)復(fù)發(fā)患者例數(shù)/總患者例數(shù)×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 26.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料服從正態(tài)分布用±s描述，不符合正態(tài)分布用中位數(shù)及四分位數(shù)［M（P25，P75）］表示；計(jì)數(shù)資料用例（%）表示。不同臨床病理特征患者M(jìn)DSCs 比較應(yīng)用非參數(shù)檢驗(yàn)Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。通過(guò)Spearman法分析MDSCs與外周血白細(xì)胞的相關(guān)性。應(yīng)用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，采用Logrank 檢驗(yàn)比較不同分組患者RFS 差異，雙側(cè)P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌腫瘤浸潤(rùn)MDSCs 比例與臨床病理特點(diǎn)的關(guān)系 32 例乳腺癌患者腫瘤浸潤(rùn)MDSCs 比例為0.4%～24.9%，中位數(shù)4.4%。不同臨床病理特征患者中，臨床分期Ⅲ期MDSCs 比例高于Ⅰ～Ⅱ期（P＜0.05），而不同N 分期、絕經(jīng)狀態(tài)、T 分期、病理類型、分子分型、Ki-67 狀態(tài)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）狀態(tài)患者M(jìn)DSCs 比例差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

2.2 乳腺腫瘤浸潤(rùn)MDSCs 與外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)等相關(guān)性分析 32 例乳腺癌患者外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)（5.9±1.4）×109/L，單核細(xì)胞計(jì)數(shù)（0.4±0.1）×109/L，中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)3.2（2.8，3.9）×109/L，淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)1.8（1.5，2.2）×109/L、MLR（0.2±0.1）、NLR1.6（1.4，2.0）。腫瘤浸潤(rùn)MDSCs 與外周血單核細(xì)胞計(jì)數(shù)（rs=0.405）及MLR（rs=0.408）呈正相關(guān)（均P＜0.05），見圖1；與白細(xì)胞計(jì)數(shù)（rs=0.233）、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)（rs=0.224）、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)（rs=-0.051）、單核細(xì)胞百分比（rs=0.162）、中性粒細(xì)胞百分比（rs=0.073）、淋巴細(xì)胞百分比（rs=-0.212）、NLR（rs=0.136）無(wú)相關(guān)性（均P＞0.05）。根據(jù)Luminal 分型結(jié)果進(jìn)行分層分析，25 例Luminal A/B型Ⅰ～Ⅲ期乳腺癌患者腫瘤浸潤(rùn)MDSCs與外周血單核細(xì)胞計(jì)數(shù)（rs=0.486）、MLR（rs=0.530）呈正相關(guān)（均P＜0.05），7 例HER-2 過(guò)表達(dá)型/三陰性乳腺癌中腫瘤浸潤(rùn)MDSCs 與外周血單核細(xì)胞計(jì)數(shù)（rs=0.429）、MLR（rs=0.036）無(wú)相關(guān)性（均P＞0.05）。根據(jù)有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移進(jìn)一步分層分析，17例無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者腫瘤浸潤(rùn)MDSCs 與外周血單核細(xì)胞計(jì)數(shù)（rs=0.651）呈正相關(guān)（P＜0.01），與MLR（rs=0.390）無(wú)相關(guān)性（P＞0.05）；15例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者腫瘤浸潤(rùn)MDSCs與外周血單核細(xì)胞計(jì)數(shù)（rs=0.147）、MLR（rs=0.361）均無(wú)相關(guān)性（均P＞0.05）。

Tab.1 Comparison of MDSCs%in breast cancer tissues between patients with different clinicopathological characteristics表1 不同臨床病理特征患者的乳腺癌組織浸潤(rùn)MDSCs比例比較 ［%，M（P25，P75）］

2.3 Ⅰ～Ⅲ期乳腺癌術(shù)后患者RFS的影響因素 截至隨訪結(jié)束，32 例患者中共11 例（34.4%）出現(xiàn)術(shù)后復(fù)發(fā)進(jìn)展，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期分別為0、7、4 例。32 例患者總體5 年、10 年無(wú)復(fù)發(fā)生存率分別為84%、62%。按照Ⅰ～Ⅲ期MDSCs中位數(shù)4.4%將患者分為高M(jìn)DSCs 組（≥4.4%，16 例）和低MDSCs 組（＜4.4%，16 例），2 組5 年無(wú)復(fù)發(fā)生存率分別為80%、88%，10年無(wú)復(fù)發(fā)生存率分別為58%、66%。生存分析結(jié)果顯示有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者RFS較無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者更短（P＜0.05），其余分組患者RFS 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表2。對(duì)32例患者分析發(fā)現(xiàn)，高、低MDSCs 平均RFS 分別為（102.7±9.1）個(gè)月、（107.9±8.3）個(gè)月，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖2A。分層分析發(fā)現(xiàn)，25 例Luminal A/B 型患者中，高M(jìn)DSCs 和低MDSCs 平均RFS 分別為（100.6±10.8）個(gè)月、（113.7±6.3）個(gè)月，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖2B；17 例無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者高、低MDSCs 平均RFS 分別為（97.4±31.9）個(gè)月、（117.8±15.9）個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2C。

Tab.2 Univariate analyses on factors associated with RFS in patients with breast cancer表2 不同臨床病理特征患者RFS比較

3 討論

腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞的數(shù)量及時(shí)間、空間分布均存在高度異質(zhì)性［1］，是探索新型免疫治療靶點(diǎn)及生物標(biāo)志物的理論基礎(chǔ)。探索新型免疫評(píng)分體系是腫瘤研究的熱點(diǎn)及難點(diǎn)。肺癌、乳腺癌、尿路上皮癌等實(shí)體腫瘤中的MDSCs 顯示了一定的潛在預(yù)后預(yù)測(cè)價(jià)值［9-12］，由于標(biāo)本難以獲取，目前大部分相關(guān)研究針對(duì)的是外周血中的MDSCs。Yamauchi 等［13］報(bào)道外周血MDSCs 是非小細(xì)胞肺癌術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)因素。目前乳腺癌術(shù)后患者腫瘤浸潤(rùn)MDSCs 對(duì)于RFS的預(yù)后意義尚少見文獻(xiàn)報(bào)道。

Fig.1 Correlation of MDSCs with monocyte count(A)and MLR(B)in 32 patients with breast cancer圖1 32例乳腺腫瘤浸潤(rùn)MDSCs與單核細(xì)胞計(jì)數(shù)（A）、MLR（B）的相關(guān)性分析

Fig.2 RFS curves of high and low MDSCs in the whole group of patients,Luminal A/B type patients and patients without lymph node metastasis圖2 全組患者、Luminal A/B型患者和無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者高M(jìn)DSCs和低MDSCs組RFS曲線

根據(jù)表型不同可將MDSCs 分為3 種亞型：?jiǎn)魏思?xì) 胞 樣MDSCs（CD15-CD14+）、多 形 核MDSCs（CD15+CD14-）以及早期MDSCs（CD15-CD14-）［14-17］。Safarzadeh 等［4］入組20 例Ⅰ～Ⅳ期乳腺癌患者，發(fā)現(xiàn)外周血HLA-DR-CD33+MDSCs 及單核細(xì)胞樣MDSCs、多形 核MDSCs、早 期MDSCs 3 種 亞 型 的MDSCs 均與臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示乳腺癌外周血MDSCs 是預(yù)后的影響因素。Barrera 等［11］發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌患者中特定細(xì)胞因子聯(lián)合外周血多形核樣MDSCs 是一項(xiàng)有潛力的疾病進(jìn)展預(yù)測(cè)指標(biāo)。本課題組前期在乳腺癌患者腫瘤組織中觀察到一群表型為L(zhǎng)in-CD33+CD13+CD14-CD15-的早期MDSCs［7-8］，本研究發(fā)現(xiàn)Ⅲ期患者腫瘤浸潤(rùn)MDSCs比例高于Ⅰ～Ⅱ期患者，與De Giorgi 等［6］研究結(jié)果一致，且MDSCs 與腫瘤的轉(zhuǎn)移進(jìn)展相關(guān)，但并未觀察到腫瘤浸潤(rùn)MDSCs 比例與病理類型、分子分型有關(guān)。

腫瘤浸潤(rùn)MDSCs 的募集及誘導(dǎo)分化與白細(xì)胞介素（IL）-6、IL-10等多種細(xì)胞因子及細(xì)胞趨化因子受體5（cell chemokine receptor type 5，CCR5）等趨化因子在內(nèi)的全身性炎癥狀態(tài)密切相關(guān)［15］。外周血單核細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、MLR 也是反映乳腺癌等實(shí)體腫瘤患者總體免疫狀態(tài)的重要生物標(biāo)志物［18-20］。一項(xiàng)入組516 例轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的臨床研究發(fā)現(xiàn)外周血單核細(xì)胞計(jì)數(shù)、MLR 及循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)目均為總生存時(shí)間的獨(dú)立影響因素［6］。Sheng等［10］發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移性尿路上皮癌患者的循環(huán)MDSCs 與外周血炎性指標(biāo)NLR 呈負(fù)相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，Ⅰ～Ⅲ期患者腫瘤浸潤(rùn)早期MDSCs 與外周血單核細(xì)胞及MLR呈正相關(guān)，而未觀察到與中性粒細(xì)胞等的相關(guān)性。亞型分析發(fā)現(xiàn)25 例Luminal A/B 型患者早期MDSCs與外周血單核細(xì)胞及MLR呈正相關(guān)，而其余7 例HER-2 過(guò)表達(dá)型或三陰性乳腺癌患者無(wú)此現(xiàn)象，有待增加例數(shù)進(jìn)一步分析。

本研究結(jié)果顯示有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者RFS 更短，Ⅰ～Ⅱ期與Ⅲ期患者、T1與T2～4期患者RFS差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。目前腫瘤浸潤(rùn)MDSCs 評(píng)估預(yù)后的cut-off 值選取尚無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，筆者通過(guò)中位數(shù)4.4%進(jìn)行分組，生存分析結(jié)果顯示高、低MDSCs 組患者RFS 無(wú)明顯差異。根據(jù)分子分型分層后發(fā)現(xiàn)，在25例Luminal A/B 型患者中，高、低MDSCs 患者RFS 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。17 例無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中，低MDSCs組無(wú)進(jìn)展病例，而高M(jìn)DSCs組3例復(fù)發(fā)進(jìn)展，高M(jìn)DSCs 組患者RFS 更差（P＜0.05）。15 例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（N1～3）患者組，N1為4例，N2為6例，N3為5例，N 分期是乳腺癌患者預(yù)后影響因素，各個(gè)N 分期的樣本量較小，未能進(jìn)一步分析淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者M(jìn)DSCs對(duì)RFS的預(yù)測(cè)作用。

綜上，本研究觀察到乳腺癌腫瘤浸潤(rùn)MDSCs 比例與外周血單核細(xì)胞計(jì)數(shù)、MLR 呈正相關(guān)，在無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移乳腺癌患者中觀察到高M(jìn)DSCs 患者RFS更短。