陳學鋒，趙明，張瑜，郝自強，白文樓，孟存良，齊曉勇△

心力衰竭（HF）是多種原因引起心臟結(jié)構(gòu)和（或）功能的異常改變，進而導致心室收縮和（或）舒張功能發(fā)生障礙。盡管HF 的治療近年來取得較大進展，但患者病死率和再住院率仍較高［1］。鈉葡萄糖共轉(zhuǎn)運蛋白2（SGLT2）抑制劑（SGLT2i）是一種新型降糖藥物，通過抑制腎臟近曲小管介導葡萄糖重吸收的SGLT2 而促進葡萄糖從尿液中排出。關(guān)于SGLT2i 心血管安全性的研究顯示SGLT2i 可以減少主要不良心血管事件和降低心力衰竭再住院風險，且此獲益的出現(xiàn)時間明顯早于降糖作用所致獲益的時間，表明其機制可能并非通過降糖所致［2-4］。對非糖尿病患者亞組的分析結(jié)果顯示，SGLT2i達格列凈仍可降低主要心血管事件包括因心血管疾病死亡、心力衰竭再住院及心力衰竭急性發(fā)作的發(fā)生率［5］。鑒于上述研究結(jié)果，2021年歐洲急性和慢性心力衰竭診斷和治療指南將達格列凈和恩格列凈列為射血分數(shù)降低的HF 患者治療的Ⅰ類推薦以降低心力衰竭患者住院和死亡的風險［6］。然而，目前有關(guān)其改善心力衰竭患者預后的主要機制方面的研究較少，尚未達成共識。本研究采用升主動脈縮窄法建立非糖尿病慢性心力衰竭兔模型，探討達格列凈對其心功能的影響及作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 18 只6 月齡普通級健康成年雄性新西蘭大白兔，體質(zhì)量3.0～3.5 kg，購自河北省望都縣彤輝養(yǎng)殖有限公司，許可證號：SCXK（冀）2016-002。實驗動物均于河北省人民醫(yī)院臨床醫(yī)學研究中心動物室單籠飼養(yǎng)，室溫（17±3）℃，攝水攝食不限。

1.2 主要試劑和儀器 戊巴比妥鈉、4%多聚甲醛購自北京索萊寶公司；生理鹽水購自石家莊四藥有限公司；青霉素鈉購自華北制藥有限公司，達格列凈（10 mg/片）購自阿斯利康制藥有限公司；兔N端前腦鈉肽（NT-proBNP）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒購自江蘇晶美生物科技有限公司；膠原纖維（Collagen）Ⅰ、CollagenⅢ抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。EPIQ7 超聲診斷系統(tǒng)購自美國Philip 公司，光學顯微鏡購自日本尼康公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗分組及模型建立 將18只大白兔按隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組、心力衰竭組和達格列凈組，每組6只。兔經(jīng)3%戊巴比妥鈉（1 mL/kg）麻醉后仰臥位固定于動物手術(shù)臺上，取胸骨左緣第二、三肋間，逐層切開胸部組織，暴露升主動脈。假手術(shù)組只開胸不手術(shù)，心力衰竭組和達格列凈組開胸后，以絲線標記并使用游標卡尺精確測量升主動脈周長，在距離升主動脈根部以遠1.0 cm處結(jié)扎升主動脈，使縮窄后周長為原周長的60%。逐層關(guān)胸至皮膚。術(shù)后常規(guī)青霉素80萬單位肌內(nèi)注射3 d。術(shù)后12周行超聲心動圖檢查，以左心室射血分數(shù)（LVEF）≤0.40 視為心力衰竭模型制作成功。術(shù)后13周，達格列凈組滿足上述心力衰竭標準的實驗動物經(jīng)強飼法予以達格列凈1 mg/（kg·d），假手術(shù)組及心力衰竭組給予等量生理鹽水經(jīng)口強飼，共干預10 周。對各組動物的精神、活動及進食等一般情況進行觀察。

1.3.2 超聲心動圖檢查 分別于術(shù)前、術(shù)后12周、干預10周后對各組動物行超聲心動圖檢查，測定室間隔厚度（IVS）、左心室舒張末內(nèi)徑（LVEDD）、左心室后壁厚度（LVPW）、左心室收縮末內(nèi)徑（LVESD）和LVEF。以上各測量值均取連續(xù)3次測量的平均值。

1.3.3 血液學指標檢測 藥物干預10周后，從各組兔耳緣靜脈取血3～4 mL，使用全自動血細胞分析儀檢測兔血白細胞計數(shù)、血紅蛋白含量。使用生化分析儀檢測總蛋白、白蛋白、鉀、鈉、隨機血糖、血漿滲透壓水平。分別于術(shù)后12周及藥物干預10 周后，經(jīng)耳緣靜脈取血，使用ELISA 法測定各組NTproBNP水平。

1.3.4 體質(zhì)量和心臟質(zhì)量測量 藥物干預10周后，測量各組實驗動物體質(zhì)量。處死動物后取出心臟精確測量全心質(zhì)量，剪去左心房、右心房及右心室后測量左心室質(zhì)量，并計算左心室質(zhì)量/體質(zhì)量比值。

1.3.5 病理學染色 實驗末處死實驗動物，取左心室前壁近心尖處心肌組織于4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋，生物切片機切取4μm 厚組織切片，行HE 染色觀察心肌細胞形態(tài)；Masson染色觀察心肌纖維化程度，染色結(jié)果中膠原纖維呈藍色，細胞質(zhì)、肌纖維、紅細胞呈紅色；免疫組化染色觀察心肌組織CollagenⅠ、CollagenⅢ表達水平，其蛋白陽性表達產(chǎn)物呈棕黃色顆粒。應用Image J 軟件分析圖像，計算膠原組織分數(shù)（心肌纖維化面積/心肌組織面積×100%）以及CollagenⅠ或CollagenⅢ陽性面積百分比（CollagenⅠ或CollagenⅢ陽性面積/心肌組織面積×100%）。

1.4 統(tǒng)計學方法 使用SPSS 26.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)使用±s表示，方差齊時多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Tukey檢驗；若方差不齊，多組間比較采用Welch 方差分析，組間多重比較使用Games-Howell 檢驗，組內(nèi)干預前后NT-proBNP 比較使用配對t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組一般情況 假手術(shù)組6只大白兔均存活至實驗結(jié)束；心力衰竭組和達格列凈組術(shù)中、術(shù)后無死亡。術(shù)后12周經(jīng)超聲心動圖篩選，心力衰竭組和達格列靜組各5只符合實驗標準，并存活至實驗結(jié)束。所有動物術(shù)后均出現(xiàn)食欲減退、精神萎靡、活動減少、呼吸急促；假手術(shù)組術(shù)后3 d上述癥狀逐漸恢復；心力衰竭組從術(shù)后3 d始上述癥狀亦有所好轉(zhuǎn)，至實驗結(jié)束；心力衰竭組的精神狀態(tài)、活動情況均較假手術(shù)組差，達格列凈組一般情況介于心力衰竭組和假手術(shù)組之間。

2.2 各組超聲心動圖檢查結(jié)果比較 各組術(shù)前IVS、LVEDD、LVPW、LVESD、LVEF 比較差異均無統(tǒng)計學意義。術(shù)后12 周，與假手術(shù)組相比，心力衰竭組和達格列凈組LVESD 增加，LVEF 降低（P＜0.05），而心力衰竭組和達格列凈組差異無統(tǒng)計學意義。藥物干預10 周，達格列凈組LVEF 較心力衰竭組明顯升高，且較術(shù)后12 周明顯升高（t=7.140，P＜0.05）。見表1。

2.3 各組血液學指標比較 3 組間白細胞計數(shù)、總蛋白、白蛋白、血清鉀、鈉、隨機血糖、血漿滲透壓比較差異均無統(tǒng)計學意義。與假手術(shù)組相比，心力衰竭組及達格列凈組血紅蛋白降低（P＜0.01），達格列凈組與心力衰竭組血紅蛋白差異無統(tǒng)計學意義。見表2。

Tab.1 Comparison of cardiac ultrasound results before operation,12 weeks after operation and 10 weeks after drug intervention between the three groups表1 各組術(shù)前、術(shù)后12周及藥物干預10周心臟超聲結(jié)果比較 （±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與假手術(shù)組比較；b與心力衰竭組比較；c與術(shù)后12周比較，P＜0.05。

組別假手術(shù)組心力衰竭組達格列凈組F n 6 5 5術(shù)前IVS（mm）2.83±0.09 3.02±0.29 2.89±0.14 1.317 LVEDD（mm）13.05±1.27 12.88±0.85 13.19±3.12 0.032 LVPW（mm）2.77±0.19 3.02±0.17 2.71±0.28 2.840 LVESD（mm）7.97±0.85 7.88±0.51 8.33±2.29 0.149 LVEF 0.73±0.04 0.74±0.02 0.71±0.05 0.427組別假手術(shù)組心力衰竭組達格列凈組F術(shù)后12周IVS（mm）2.81±0.11 2.97±0.17 3.09±0.21 7.436 LVEDD（mm）13.18±1.33 13.16±0.78 12.70±1.20 0.295 LVPW（mm）2.79±0.09 2.91±0.24 2.84±0.06 7.459 LVESD（mm）8.29±0.87 11.02±0.61a 10.62±0.99a 17.235＊＊LVEF 0.71±0.02 0.38±0.01a 0.38±0.01a 1 326.354＊＊組別假手術(shù)組心力衰竭組達格列凈組F藥物干預10周IVS（mm）2.92±0.17 2.92±0.17 2.79±0.30 0.594 LVEDD（mm）12.07±1.16 13.24±1.81 12.86±2.84 0.496 LVPW（mm）2.79±0.09 2.79±0.10 2.71±0.23 7.578 LVESD（mm）7.65±0.71 11.16±1.54a 9.55±2.57 5.713＊LVEF 0.71±0.03 0.37±0.02a 0.56±0.06abc 120.097＊＊

Tab.2 Comparison of blood indexes between the three groups表2 各組血液學指標比較 （±s）

Tab.2 Comparison of blood indexes between the three groups表2 各組血液學指標比較 （±s）

＊＊P＜0.01；a與假手術(shù)組比較，P＜0.05。

組別假手術(shù)組心力衰竭組達格列凈組F n 6 5 5白細胞計數(shù)（×109/L）8.59±1.59 8.86±1.96 8.92±1.16 0.069血紅蛋白（g/L）129.83±4.71 116.40±7.44a 116.80±2.17a 12.174＊＊總蛋白（g/L）60.18±7.65 61.62±4.51 58.94±4.50 0.257白蛋白（g/L）38.02±3.41 39.96±2.25 38.32±1.89 0.804組別假手術(shù)組心力衰竭組達格列凈組F鉀（mmol/L）4.62±0.46 4.14±0.34 4.54±0.25 2.520鈉（mmol/L）143.17±1.47 143.00±1.58 141.60±1.14 1.927隨機血糖（mmol/L）6.13±0.50 6.08±0.28 6.38±0.42 0.757血漿滲透壓（mOsm/L）305.81±3.58 307.88±3.38 304.09±5.10 1.084

2.4 各組NT-proBNP 比較 術(shù)后12 周，心力衰竭組和達格列凈組NT-proBNP 水平較假手術(shù)組均明顯升高（P＜0.05），而達格列凈組和心力衰竭組間差異無統(tǒng)計學意義。藥物干預10周，心力衰竭組NTproBNP 水平較術(shù)后12 周升高，達格列凈組NTproBNP 水平較術(shù)后12 周下降，但仍高于假手術(shù)組，而較心力衰竭組則明顯降低（P＜0.05）。見表3。

Tab.3 Comparison of NT-proBNP levels 12 weeks after operation and 10 weeks after drug intervention between the three groups表3 各組術(shù)后12周及藥物干預10周NT-proBNP水平比較 （ng/L，±s）

Tab.3 Comparison of NT-proBNP levels 12 weeks after operation and 10 weeks after drug intervention between the three groups表3 各組術(shù)后12周及藥物干預10周NT-proBNP水平比較 （ng/L，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a 與假手術(shù)組比較，b 與心力衰竭組比較，P＜0.05。

組別假手術(shù)組心力衰竭組達格列凈組F n6 5 5術(shù)后12周99.88±12.80 366.97±42.66a 379.56±59.55a 81.864＊＊藥物干預10周104.40±9.72 449.70±21.26a 298.55±14.31ab 692.032＊＊t 0.900 3.824＊2.887＊

2.5 各組體質(zhì)量及心臟質(zhì)量比較 心力衰竭組較假手術(shù)組心臟外形增大、變形，達格列凈組心臟外形較假手術(shù)組增大，但明顯小于心力衰竭組，見圖1。各組體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學意義。心力衰竭組的全心質(zhì)量、左心室質(zhì)量以及左心室質(zhì)量/體質(zhì)量較假手術(shù)組明顯升高（P＜0.05），而達格列凈組上述指標均低于心力衰竭組（P＜0.05），與假手術(shù)組相比，達格列凈組全心質(zhì)量、左心室質(zhì)量以及左心室質(zhì)量/體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學意義。見表4。

Tab.4 Comparison of body weight and heart weight between the three groups表4 各組體質(zhì)量及心臟質(zhì)量比較 （±s）

Tab.4 Comparison of body weight and heart weight between the three groups表4 各組體質(zhì)量及心臟質(zhì)量比較 （±s）

＊＊P＜0.01；a與假手術(shù)組比較，b與心力衰竭組比較，P＜0.05。

組別假手術(shù)組心力衰竭組達格列凈組F n 6 5 5體質(zhì)量（kg）3.58±0.17 3.49±0.23 3.45±0.19 0.639全心質(zhì)量（g）7.78±0.83 12.31±1.21a 8.31±0.26b 6.700＊＊左心室質(zhì)量（g）6.05±0.62 9.74±1.17a 6.56±0.27b 7.069＊＊左心室質(zhì)量/體質(zhì)量（g/kg）1.69±0.22 2.79±0.39a 1.84±0.07b 6.621＊＊

2.6 各組心臟病理染色結(jié)果 HE染色示假手術(shù)組心肌纖維排列有序，細胞形態(tài)一致，胞質(zhì)染色均勻；而心力衰竭組心肌纖維粗大，心肌細胞排列不整齊，心肌細胞間連接松散；與假手術(shù)組比較，達格列凈組心肌細胞增粗，但較心力衰竭組明顯改善，見圖2。Masson 染色示假手術(shù)組心肌組織膠原纖維含量較少，而心力衰竭組膠原纖維明顯增多，達格列凈組心肌組織膠原纖維較心力衰竭組明顯減少，見圖3。心力衰竭組膠原組織分數(shù)高于假手術(shù)組，而達格列凈組膠原組織分數(shù)則較心力衰竭組明顯降低（P＜0.05），見表5。免疫組化染色顯示，與假手術(shù)組相比，心力衰竭組心肌組織中CollagenⅠ及CollagenⅢ陽性表達產(chǎn)物明顯增加，達格列凈組CollagenⅠ及CollagenⅢ陽性表達產(chǎn)物比心力衰竭組明顯減少，見圖4、5。心力衰竭組CollagenⅠ、CollagenⅢ陽性面積百分比均明顯高于假手術(shù)組，而達格列凈組心肌組織CollagenⅠ、CollagenⅢ陽性面積百分比較心力衰竭組降低（P＜0.05），見表5。

Fig.1 Cardiac shape of each group圖1 各組心臟外形

Fig.2 HE staining of myocardial tissue in each group(×200)圖2 各組心肌組織HE染色（×200）

Fig.3 Masson staining of myocardial tissue in each group(×200)圖3 各組心肌組織Masson染色（×200）

Fig.4 Collagen Ⅰimmunohistochemical staining of myocardial tissue in each group(×200)圖4 各組心肌組織CollagenⅠ免疫組化染色（×200）

Fig.5 Collagen Ⅲimmunohistochemical staining of myocardial tissue in each group(×200)圖5 各組心肌組織CollagenⅢ免疫組化染色（×200）

Tab.5 Comparison of myocardial collagen tissue fraction and positive area percentages of Collagen Ⅰ,Collagen Ⅲbetween the three groups表5 各組心肌膠原組織分數(shù)和CollagenⅠ、CollagenⅢ陽性面積百分比比較

3 討論

目前有研究［7-8］認為，SGLT2i保護心臟的機制可能與降低血糖和體質(zhì)量、減輕炎癥反應、改善貧血、改善心臟能量代謝等因素相關(guān)。但具體機制并未達成一致。SGLT2i 恩格列凈可通過抑制糖尿病小鼠心肌纖維化而改善心臟結(jié)構(gòu)和功能，其機制可能與激活核轉(zhuǎn)錄因子E2/抗氧化反應原件（Nrf2/ARE）通路及抑制轉(zhuǎn)化生長因子β（TGFβ）/SMAD 通路有關(guān)［9］。Santos-Gallego 等［10］研究顯示，恩格列凈可以促使心肌從主要利用葡萄糖供能轉(zhuǎn)向主要利用酮體、游離脂肪酸和支鏈氨基酸以增加心肌腺苷三磷酸含量，改變心肌能量代謝，改善非糖尿病豬缺血性心力衰竭的左心室重構(gòu)，增強左心室收縮功能。Lee等［11］使用球囊擴張導管對高膽固醇飼料喂養(yǎng)的非糖尿病新西蘭大白兔腹主動脈擴張并損傷后，使用達格列凈或安慰劑干預8 周，結(jié)果顯示達格列凈可以通過抑制炎癥反應和巨噬細胞活性發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用。體外研究表明，恩格列凈可以抑制心臟成纖維細胞（CF）產(chǎn)生細胞基質(zhì)CollagenⅠ，并抑制α-平滑肌肌動蛋白、組織生長因子和基質(zhì)金屬蛋白酶等促纖維化標志物的表達［12］。而目前有關(guān)SGLT2i對心肌重構(gòu)的研究較少。

心肌重構(gòu)在慢性心力衰竭的進展中起著非常重要的作用并且與預后密切相關(guān)［13］。心肌重構(gòu)包括心臟幾何形狀和功能的改變，體現(xiàn)為LVEF 降低和左心室體積或質(zhì)量增加［14］。心臟大小、形狀的改變可預測心力衰竭的預后并評估對治療的反應［15-16］。左心室質(zhì)量與體質(zhì)量的比值稱為左心室質(zhì)量指數(shù)，左心室質(zhì)量指數(shù)較單純的左心室質(zhì)量更能反映心肌重構(gòu)的程度，也可預測心力衰竭的長期預后［17］。本研究采用主動脈縮窄法建立非糖尿病兔心力衰竭模型，其病理生理改變類似于高血壓性心力衰竭患者。結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，心力衰竭組LVEF 降低，NT-proBNP升高，心臟外形增大、細胞連接松散，全心質(zhì)量、左心室質(zhì)量以及左心室/體質(zhì)量比值均明顯增加，使用達格列凈干預10 周，可改善動物心力衰竭相關(guān)癥狀，提高LVEF 并降低NT-proBNP，與臨床研究結(jié)果一致［18］。進一步研究顯示，達格列凈可減輕心臟外形增大，降低全心質(zhì)量、左心室質(zhì)量和左心室質(zhì)量指數(shù)，表明其可通過抑制心力衰竭動物心肌重構(gòu)來改善預后。

心肌纖維化是心肌重構(gòu)的重要機制之一，其主要特征是心肌中細胞外基質(zhì)（ECM）的過度沉積，心肌纖維化的程度與左心室功能受損的程度密切相關(guān)［19］。心臟ECM 主要由CollagenⅠ和CollagenⅢ組成［20］。CollagenⅠ約占心肌膠原蛋白的85%，主要構(gòu)成厚纖維以負責心臟抗拉強度；CollagenⅢ約占總膠原蛋白的11%，其直徑相對較小，主要構(gòu)成細纖維以維持心肌的彈性［21］。CF 是產(chǎn)生ECM 的主要細胞，負責ECM的動態(tài)平衡，然而在心臟損傷或應激刺激下，靜止的CF 向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化，表現(xiàn)出更強的增殖、遷移和收縮能力，且產(chǎn)生ECM 的能力顯著增強［22］，ECM 過度沉積，從而導致心肌纖維化并損傷心臟功能。心肌纖維化還可導致心臟代謝需要的底物和氧氣向心肌細胞的擴散距離增大，對心肌能量供需平衡產(chǎn)生負面影響。此外，心肌纖維化形成的瘢痕組織可因絕緣而形成折返的組織學基礎，并誘發(fā)惡性心律失常，從而使心力衰竭的患者發(fā)生心臟性猝死［23-24］。本研究通過對心肌細胞HE 及Masson染色顯示，達格列凈可以顯著抑制心肌細胞肥大、變性，改變其排列狀態(tài)；抑制心肌膠原組織的增加，從而降低心肌間質(zhì)纖維化程度。免疫組化染色顯示，達格列凈可通過抑制心肌纖維化以及心肌中CollagenⅠ和CollagenⅢ蛋白表達，進而抑制心肌重構(gòu)，這可能是此類藥物減少心力衰竭患者主要不良心血管事件的機制之一。

此外，本研究同時探討了達格列凈對心力衰竭動物模型體質(zhì)量及常見血液學指標的影響，結(jié)果顯示達格列凈組與假手術(shù)組及心力衰竭組相比，體質(zhì)量、白細胞計數(shù)、總蛋白、白蛋白、鉀、鈉、血糖、血漿滲透壓差異無統(tǒng)計學意義，提示達格列凈改善心力衰竭的機制可能與降低體質(zhì)量、降糖、利尿等因素關(guān)系不大。心力衰竭組和達格列凈組血紅蛋白降低，可能由于實驗動物心力衰竭后胃腸道水腫、食欲下降所致。然而，達格列凈組和心力衰竭組相比，血紅蛋白差異無統(tǒng)計學意義，提示達格列凈改善心力衰竭的機制可能與糾正貧血關(guān)系不大。

綜上，本研究驗證了達格列凈改善非糖尿病慢性心力衰竭兔心功能的作用，并發(fā)現(xiàn)達格列凈可顯著抑制心力衰竭后的心肌重構(gòu)，其機制可能與抑制心肌組織中CollagenⅠ和CollagenⅢ的表達和心肌纖維化有關(guān)。但因本研究技術(shù)條件所限，未能揭示達格列凈對心力衰竭動物動脈血壓變化的影響；此外，未對達格列凈抑制心肌纖維化的分子機制行深入探討。因此，達格列凈對心肌成纖維細胞活化過程中相關(guān)細胞信號轉(zhuǎn)導通路及基因表達水平的影響有待今后進一步研究。