伊萬萍，馬德壽

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，雖然近年來乳腺癌的治療已取得了極大的進(jìn)步，但患者預(yù)后仍然很差［1］。化療是目前治療乳腺癌的一種有效手段，但順鉑（cisplatin，DDP）等化療藥物的長期使用會產(chǎn)生耐藥性，因此尋找克服化療藥物耐藥性的方法十分重要［2］。高強(qiáng)度聚焦超聲（high-intensity focused ultrasound，HIFU）作為一種無創(chuàng)性的新興治療技術(shù)，可利用超聲波靶向腫瘤實(shí)體，在不損傷鄰近組織的情況下誘導(dǎo)腫瘤組織蛋白質(zhì)變性及凝固壞死，已用于良惡性腫瘤的治療［2］。近期有研究發(fā)現(xiàn)，HIFU 能夠通過滲透細(xì)胞膜增強(qiáng)DDP 向癌組織的傳遞，增強(qiáng)肺癌細(xì)胞對DDP的敏感性［3］。但關(guān)于HIFU對DDP 耐藥乳腺癌細(xì)胞的作用及機(jī)制尚未闡明。研究顯示，下調(diào)β干擾素TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白（TIRdomain- containing adaptor inducing interferon- β，TRIF）表達(dá)或抑制其所介導(dǎo)的途徑激活是超聲熱增強(qiáng)口腔鱗狀細(xì)胞癌對化療藥物敏感性的機(jī)制之一［4］。細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）通路是細(xì)胞內(nèi)的一個(gè)重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在耐藥腫瘤細(xì)胞中被顯著激活［5］，而TRIF則可通過抑制該途徑減輕巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)［6］。但關(guān)于TRIF 調(diào)控該通路在腫瘤化療耐藥性中作用的相關(guān)研究少見報(bào)道。本研究旨在探究HIFU 通過TRIF 介導(dǎo)的ERK 通路在乳腺癌患者對DDP 化療敏感性中的作用，為尋找克服乳腺癌化療耐藥性的方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 購自南方醫(yī)科大學(xué)的6周齡BALB/c裸鼠20只，SPF級，體質(zhì)量20～22 g，于通風(fēng)良好且12 h/12 h晝夜交替環(huán)境中飼養(yǎng)1周，許可證號SCXK（粵）2016-0041。

1.2 試劑和儀器 乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231、MCF-7（上海蓋寧生物科技有限公司）；RPMI-1640培養(yǎng)基（上海博爾森生物科技有限公司）；順鉑（廣東嶺南制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20143124）；Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（上海晶風(fēng)生物科技有限公司）；CCK-8試劑盒（深圳紐邦生物技術(shù)有限公司）；蛋白提取試劑盒（北京雅安達(dá)生物技術(shù)有限公司）；BCA蛋白檢測試劑盒［攸碧艾（上海）貿(mào)易有限公司］；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的IgG 二抗、兔抗TRIF、多藥耐藥基因1（multidrug resistance 1，MDR1）、Bcl-2 關(guān)聯(lián)X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）、GAPDH、ERK1/2、p-ERK1/2抗體（Cell Signaling Technology）；兔抗B 淋巴細(xì)胞瘤-2 基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Ki-67 抗體（Proteintech）；兔抗p-糖蛋白（p-glycoprotein，p-gp）抗體（上海柯雷生物科技有限公司）；漆黃素（fisetin，西安旭煌生物技術(shù)有限公司）免疫組化染色試劑盒（上海茁彩生物科技有限公司）；BD FACSCANTO Ⅱ流式細(xì)胞儀（上?；┥锟萍加邢薰荆?；GelView 1500Plus智能凝膠成像系統(tǒng)（廣州博鷺騰生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 MDA-MB-231及MCF-7細(xì)胞培養(yǎng) 在含有100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素和10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中接種MDA-MB-231 及MCF-7 細(xì)胞后，培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱，直至細(xì)胞融合度達(dá)80%左右。

1.3.2 DDP 耐藥細(xì)胞系的建立 將已培養(yǎng)至對數(shù)生長期的MDA-MB-231及MCF-7細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后接種到培養(yǎng)瓶培養(yǎng)24 h，然后加入1μmol/L DDP 再培養(yǎng)48 h 后棄培養(yǎng)液，用不含DDP的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞直至MDA-MB-231及MCF-7細(xì)胞能夠穩(wěn)定生長并進(jìn)行傳代。繼續(xù)使用含1μmol/L DDP 的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，如此反復(fù)3次，增加0.2μmol/L DDP的細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，依次增加DDP 濃度，當(dāng)細(xì)胞在含3μmol/L DDP 的細(xì)胞培養(yǎng)液中能夠穩(wěn)定生長、傳代時(shí)，即可得DDP耐藥細(xì)胞MDA-MB-231/DDP及MCF-7/DDP。

1.3.3 CCK-8 檢測各組細(xì)胞活力 將親本MDA-MB-231、MCF-7 細(xì)胞及MDA-MB-231/DDP 和MCF-7/DDP 細(xì)胞（2×103個(gè)/孔，100μL/孔）接種至96孔板中培養(yǎng)，分別使用1、2、4、8、16、32、64 和128μmol/L DDP 處理細(xì)胞48 h（3 個(gè)復(fù)孔），添加10μL CCK-8 溶液培養(yǎng)4 h 后，于450 nm 波長處檢測光密度（OD），并計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50）；細(xì)胞存活率=（實(shí)驗(yàn)組OD-空白組OD）/（對照組OD-空白組OD）×100%。

MDA-MB-231/DDP、MCF-7/DDP細(xì)胞（2×103個(gè)/孔）接種至96 孔板中培養(yǎng)（5 個(gè)復(fù)孔），經(jīng)培養(yǎng)24 h 后將MDA-MB-231/DDP、MCF-7/DDP細(xì)胞分為control組、HIFU組、HIFU+二甲基亞砜（DMSO）組（5 μmol/L DMSO）、HIFU+fisetin 組（5 μmol/L ERK通路激活劑fisetin）。將除control組外的其他3 組的MDA-MB-231/DDP、MCF-7/DDP 細(xì)胞置于試管中，并以頻率1.048 MHz、超聲強(qiáng)度1 000 W/cm2的HIFU暴露9 s后，用5μmol/L DMSO及fisetin分別處理相應(yīng)組細(xì)胞，檢測0、24、48和72 h的OD值及計(jì)算IC50。

1.3.4 集落形成實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞增殖情況 在6孔板中接種處理48 h 后的各組細(xì)胞（500 個(gè)/孔），培養(yǎng)1 周后使用結(jié)晶紫溶液染色（500μL），顯微鏡觀察并記錄菌落數(shù)（50 個(gè)細(xì)胞以上記為1個(gè)菌落），實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞周期及凋亡情況 細(xì)胞周期檢測：轉(zhuǎn)移細(xì)胞（1×106個(gè)/mL）至離心管，PBS洗滌后乙醇固定過夜，1 000 r/min 離心5 min，棄上清，PBS 洗滌，添加PI 染色30 min后流式儀檢測細(xì)胞周期，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞凋亡檢測：將經(jīng)PBS 洗滌后的細(xì)胞中添加Binding Buffer（100μL）重懸，添加5 μL 的Annexin-V-FITC 及5 μL 的PI，避光孵育15 min后，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.6 Western blot 檢測細(xì)胞TRIF 蛋白、耐藥相關(guān)蛋白及ERK 通路蛋白表達(dá) 收集細(xì)胞及腫瘤組織，RIPA 蛋白裂解液裂解細(xì)胞及組織以提取總蛋白，14 000 r/min 離心15 min，棄細(xì)胞碎片，BCA 法定量蛋白質(zhì)濃度；取約50μg 的蛋白，通過SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)移到PVDF膜（0.22μm），5%脫脂奶粉溶液40 mL封閉1 h，滴加兔抗TRIF、p-gp、MDR1、Bax、Bcl-2、GAPDH、ERK1/2、p-ERK1/2抗體（1∶1 000），4 ℃下過夜，洗滌后滴加HRP偶聯(lián)的IgG二抗（1∶1 000），孵育2 h，ECL試劑顯色，凝膠成像儀觀察各條帶，Quantity One 軟件分析灰度值，計(jì)算TRIF、p-gp、MDR1、Bax、Bcl-2、ERK1/2、p-ERK1/2 蛋白表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.7 體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn) 將處理48 h后的MCF-7/DDP各組細(xì)胞以6×106個(gè)注入BALB/c裸鼠皮下（每組5只），常規(guī)飼養(yǎng)，每周測量1 次腫瘤體積，4 周后處死小鼠，取出瘤體，稱質(zhì)量。本動物實(shí)驗(yàn)經(jīng)過青海大學(xué)附屬醫(yī)院動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.3.8 免疫組化法檢測腫瘤組織Ki-67的表達(dá) 將所得腫瘤組織制成常規(guī)石蠟切片，烤片60 min 后脫蠟、水化，使用3%H2O2處理去除內(nèi)源性過氧化物酶活性，滴加枸櫞酸緩沖液熱修復(fù)抗原，牛血清白蛋白封閉20 min 后添加Ki-67一抗（1 h），PBS 洗滌后添加生物素標(biāo)記的二抗（30 min），經(jīng)DAB液染色、蘇木素復(fù)染及HCl分化后進(jìn)行沖洗、脫水，二甲苯透明、封片觀察（×200），棕黃色為Ki-67 陽性細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，Image-Pro Plus 6.0軟件分析Ki-67 OD值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Graph Pad Prism 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以±s描述，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行2 組間均數(shù)比較，one-way ANOVA 進(jìn)行多組間比較，SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 親本細(xì)胞株與耐藥細(xì)胞株細(xì)胞活力比較 與親本MDA-MB-231 及MCF-7 細(xì)胞相比，MDA-MB-231/DDP 及MCF-7/DDP 細(xì)胞活力在相同濃度DDP處理下更高，且MDA-MB-231/DDP 細(xì)胞IC50顯著高于MDA-MB-231（單位：μmol/L；41.60±4.76vs.6.71±1.08，n=3，t=12.381，P＜0.05），MCF-7/DDP 細(xì)胞IC50顯著高于MCF-7（單位：μmol/L；30.94±3.28vs.5.29±0.85，n=3，t=11.112，P＜0.05），表示穩(wěn)定的MDAMB-231/DDP 及MCF-7/DDP 細(xì)胞系建立成功，見圖1。

Fig.1 Comparison of cell viability between parental cell lines and drug resistant cell lines圖1 親本細(xì)胞株與耐藥細(xì)胞株細(xì)胞活力比較

2.2 HIFU 對MDA-MB-231/DDP 及MCF-7/DDP 細(xì)胞增殖的影響 與control 組相比，HIFU 組MDAMB-231/DDP 及MCF-7/DDP 細(xì)胞IC50、OD450值、克隆細(xì)胞數(shù)顯著降低（P＜0.05）；與HIFU 組相比，HIFU+DMSO 組細(xì)胞IC50、OD450值、克隆細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），HIFU+fisetin 組細(xì)胞IC50、OD450值、克隆細(xì)胞數(shù)顯著增加（P＜0.05），見表1，圖2、3。

2.3 HIFU 對MDA-MB-231/DDP 及MCF-7/DDP 細(xì)胞周期的影響 與control 組相比，HIFU 組MDAMB-231/DDP及MCF-7/DDP細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞百分比顯著增加，S期細(xì)胞百分比顯著降低（P＜0.05）；與HIFU 組相比，HIFU+DMSO 組G0/G1 期、S 期細(xì)胞百分比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），HIFU+fisetin 組G0/G1期細(xì)胞百分比顯著降低、S期細(xì)胞百分比顯著增加（P＜0.05），見表2、圖4。

Tab.1 Comparison of IC50 and clone number of MDA-MB-231/DDP and MCF-7/DDP cells between the four groups表1 各組MDA-MB-231/DDP及MCF-7/DDP細(xì)胞IC50及克隆細(xì)胞數(shù)比較 （n=3，±s）

Tab.1 Comparison of IC50 and clone number of MDA-MB-231/DDP and MCF-7/DDP cells between the four groups表1 各組MDA-MB-231/DDP及MCF-7/DDP細(xì)胞IC50及克隆細(xì)胞數(shù)比較 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a與control組比較，b與HIFU組比較，c與HIFU+DMSO組比較，P＜0.05。

組別control組HIFU組HIFU+DMSO組HIFU+fisetin組F IC50（μmol/L）MDA-MB-231/DDP 38.31±4.14 15.21±1.92a 16.31±1.98a 31.80±3.42bc 43.256＊＊MCF-7/DDP 29.82±3.42 11.61±1.32a 10.92±1.18a 21.45±2.65abc 44.251＊＊克隆細(xì)胞數(shù)（個(gè)）MDA-MB-231/DDP 166.39±18.72 76.36±7.95a 72.88±7.63a 128.65±14.81abc 34.911＊＊MCF-7/DDP 152.73±17.29 70.73±7.84a 66.96±6.92a 123.73±14.75bc 33.502＊＊

Fig.2 Effects of HIFU on OD450 value of MDA-MB-231/DDP and MCF-7/DDP cells圖2 HIFU對MDA-MB-231/DDP及MCF-7/DDP細(xì)胞OD450值的影響

2.4 HIFU 對MDA-MB-231/DDP 及MCF-7/DDP 細(xì)胞凋亡及Bax、Bcl-2 表達(dá)水平的影響 與control 組相比，HIFU 組MDA-MB-231/DDP 及MCF-7/DDP 細(xì)胞凋亡率、Bax 表達(dá)水平顯著增加，Bcl-2 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；與HIFU 組相比，HIFU+DMSO組細(xì)胞凋亡率、Bax及Bcl-2表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），HIFU+fisetin 組細(xì)胞凋亡率、Bax 表達(dá)水平顯著降低，Bcl-2 表達(dá)水平顯著增加（P＜0.05），見表3，圖5、6。

2.5 HIFU 對MDA-MB-231/DDP 及MCF-7/DDP 細(xì)胞TRIF蛋白、耐藥相關(guān)蛋白及ERK通路蛋白表達(dá)的影響 與control組相比，HIFU組MDA-MB-231/DDP及MCF-7/DDP 細(xì)胞TRIF、p-gp、MDR1、p-ERK1/2/ERK1/2 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；與HIFU 組相比，HIFU+DMSO 組TRIF、p-gp、MDR1、p-ERK1/2/ERK1/2表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），HIFU+fisetin 組TRIF、p-gp、MDR1、p-ERK1/2/ERK1/2 表達(dá)水平顯著增加（P＜0.05），見表4、5，圖7。

Tab.2 Comparison of cell cycle between MDA-MB-231/DDP and MCF-7/DDP in each group表2 各組MDA-MB-231/DDP及MCF-7/DDP細(xì)胞周期比較 （n=3，%，±s）

＊＊P＜0.01；a與control組比較，b與HIFU組比較，c與HIFU+DMSO組比較，P＜0.05。

組別control組HIFU組HIFU+DMSO組HIFU+fisetin組F MDA-MB-231/DDP G0/G1期54.09±6.12 79.16±8.76a 78.12±8.15a 60.14±6.32bc 9.360＊＊S期32.18±3.72 7.80±0.97a 10.06±1.32a 26.12±3.09bc 65.941＊＊G2/M期13.73±1.65 12.84±1.52 11.82±1.38 13.44±1.76 0.852 MCF-7/DDP G0/G1期50.17±5.83 71.47±7.61a 72.85±7.69a 56.37±6.16bc 9.308＊＊S期34.87±4.09 15.99±2.15a 13.96±1.87a 28.48±3.26bc 33.981＊＊G2/M期14.96±1.75 12.54±1.36 13.19±1.48 15.14±1.82 1.921

Fig.4 The cell cycle detected by flow cytometry圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞周期

Tab.3 Comparison of apoptosis rate and Bcl-2 and Bax protein expression of MDA-MB-231/DDP and MCF-7/DDP cells between the four groups表3 各組MDA-MB-231/DDP及MCF-7/DDP細(xì)胞凋亡率及Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)水平比較 （n=3，±s）

Tab.3 Comparison of apoptosis rate and Bcl-2 and Bax protein expression of MDA-MB-231/DDP and MCF-7/DDP cells between the four groups表3 各組MDA-MB-231/DDP及MCF-7/DDP細(xì)胞凋亡率及Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)水平比較 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a與control組比較，b與HIFU組比較，c與HIFU+DMSO組比較，P＜0.05。

組別control組HIFU組HIFU+DMSO組HIFU+fisetin組F MDA-MB-231/DDP凋亡率（%）6.04±1.02 19.79±2.16a 20.03±2.53a 11.12±1.54abc 39.037＊＊Bax 1.00±0.01 2.68±0.32a 2.66±0.36a 1.32±0.18bc 35.259＊＊Bcl-2 1.00±0.02 0.47±0.07a 0.49±0.06a 0.81±0.09abc 46.794＊＊MCF-7/DDP凋亡率（%）8.32±1.64 17.39±1.96a 17.64±2.08a 10.06±1.43bc 21.965＊＊Bax 1.00±0.02 2.24±0.25a 2.40±0.27a 1.35±0.19bc 32.230＊＊Bcl-2 1.00±0.01 0.49±0.06a 0.50±0.07a 0.84±0.10bc 41.608＊＊

Fig.5 Effects of HIFU on apoptosis of MDA-MB-231/DDP and MCF-7/DDP cells圖5 HIFU對MDA-MB-231/DDP及MCF-7/DDP細(xì)胞凋亡的影響

Fig.6 Effects of HIFU on apoptosis related proteins of MDA-MB-231/DDP and MCF-7/DDP cells圖6 HIFU對MDA-MB-231/DDP及MCF-7/DDP細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響

2.6 HIFU 對腫瘤生長及蛋白表達(dá)的影響 與control 組相比，HIFU 組腫瘤質(zhì)量、TRIF 及p-ERK1/2/ERK1/2表達(dá)水平、腫瘤體積、Ki-67陽性表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；與HIFU 組相比，HIFU+DMSO 組腫瘤體積、腫瘤質(zhì)量、TRIF 及p-ERK1/2/ERK1/2 表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），Ki-67 陽性表達(dá)無明顯變化；HIFU+fisetin 組腫瘤體積、腫瘤質(zhì)量、TRIF 及p-ERK1/2/ERK1/2 表達(dá)水平、Ki-67 陽性表達(dá)顯著增加（P＜0.05），見表6，圖8-10。

Tab.4 Comparison of TRIF protein,drug resistancerelated protein and ERK pathway protein expression between the four groups of MDA-MB-231/DDP cells表4 各組MDA-MB-231/DDP細(xì)胞TRIF蛋白、耐藥相關(guān)蛋白及ERK通路蛋白表達(dá)水平比較（n=3，±s）

Tab.4 Comparison of TRIF protein,drug resistancerelated protein and ERK pathway protein expression between the four groups of MDA-MB-231/DDP cells表4 各組MDA-MB-231/DDP細(xì)胞TRIF蛋白、耐藥相關(guān)蛋白及ERK通路蛋白表達(dá)水平比較（n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a與control 組比較，b與HIFU 組比較，c與HIFU+DMSO組比較，P＜0.05。

組別control組HIFU組HIFU+DMSO組HIFU+fisetin組F TRIF 1.00±0.02 0.34±0.08a 0.33±0.07a 0.82±0.09bc 70.076＊＊p-gp 1.00±0.01 0.38±0.02a 0.35±0.09a 0.81±0.08abc 82.693＊＊組別control組HIFU組HIFU+DMSO組HIFU+fisetin組F MDR1 1.00±0.01 0.44±0.01a 0.42±0.08a 0.84±0.09abc 68.871＊＊p-ERK1/2/ERK1/2 1.00±0.02 0.48±0.04a 0.46±0.05a 0.81±0.08abc 76.138＊＊

Tab.5 Comparison of TRIF protein,drug resistancerelated protein and ERK pathway protein expression between the four groups of MCF-7/DDP cells表5 各組MCF-7/DDP細(xì)胞TRIF蛋白、耐藥相關(guān)蛋白及ERK通路蛋白表達(dá)水平比較 （n=3，±s）

Tab.5 Comparison of TRIF protein,drug resistancerelated protein and ERK pathway protein expression between the four groups of MCF-7/DDP cells表5 各組MCF-7/DDP細(xì)胞TRIF蛋白、耐藥相關(guān)蛋白及ERK通路蛋白表達(dá)水平比較 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a與control 組比較，b與HIFU 組比較，c與HIFU+DMSO組比較，P＜0.05。

組別control組HIFU組HIFU+DMSO組HIFU+fisetin組F TRIF 1.00±0.01 0.43±0.02a 0.44±0.08a 0.83±0.09abc 65.307＊＊p-gp 1.00±0.02 0.46±0.01a 0.43±0.07a 0.84±0.08abc 80.975＊＊組別control組HIFU組HIFU+DMSO組HIFU+fisetin組F MDR1 1.00±0.02 0.54±0.02a 0.53±0.03a 0.85±0.09abc 66.694＊＊p-ERK1/2/ERK1/2 1.00±0.02 0.56±0.06a 0.57±0.04a 0.88±0.09bc 43.175＊＊

Fig.7 Effects of HIFU on the expression of MDA-MB-231/DDP and MCF-7/DDP cell related proteins圖7 HIFU對MDA-MB-231/DDP及MCF-7/DDP細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討論

乳腺癌是目前女性死亡率最高的癌癥，盡管已有了有效的治療方法，但仍有許多患者無法得到完全治愈［7］。DDP 作為一種有效的化療藥物，已被廣泛用于乳腺癌的治療［8］，其可通過促進(jìn)MCF-7 細(xì)胞DNA損傷來加速細(xì)胞凋亡，從而起到抗癌作用［9］，但由于患者產(chǎn)生DDP 耐藥可降低癌細(xì)胞內(nèi)的DDP 積聚，引起抗凋亡蛋白及促凋亡蛋白表達(dá)失調(diào)，造成多數(shù)患者癌癥復(fù)發(fā)，嚴(yán)重影響患者預(yù)后［3］。而目前對DDP 耐藥機(jī)制的認(rèn)知尚不清楚，因此有必要進(jìn)行探討，并尋找可提高乳腺癌對DDP 化療敏感性的方法。

Tab.6 Comparison of tumor mass and tissue protein expression between the four groups表6 各組腫瘤質(zhì)量及組織蛋白表達(dá)水平比較（n=5，±s）

Tab.6 Comparison of tumor mass and tissue protein expression between the four groups表6 各組腫瘤質(zhì)量及組織蛋白表達(dá)水平比較（n=5，±s）

＊＊P＜0.01；a與control 組比較，b與HIFU 組比較，c與HIFU+DMSO組比較，P＜0.05。

組別control組HIFU組HIFU+DMSO組HIFU+fisetin組F腫瘤質(zhì)量（g）0.70±0.08 0.32±0.06a 0.34±0.05a 0.58±0.07abc 39.655＊＊TRIF 1.00±0.02 0.48±0.05a 0.51±0.06a 0.85±0.09abc 89.772＊＊組別control組HIFU組HIFU+DMSO組HIFU+fisetin組F p-ERK1/2/ERK1/2 1.00±0.02 0.55±0.05a 0.53±0.06a 0.91±0.08bc 56.024＊＊Ki-67平均光密度0.199±0.011 0.120±0.010a 0.121±0.009a 0.174±0.012abc 69.791＊＊

Fig.8 Effects of HIFU on tumor growth圖8 HIFU對腫瘤生長的影響

Fig.9 Effects of HIFU on the expression of TRIF protein and ERK pathway protein in tumor tissue圖9 HIFU對腫瘤組織TRIF蛋白及ERK通路蛋白表達(dá)的影響

Fig.10 Effects of HIFU on the positive expression of Ki-67 in tumor tissues(×200)圖10 HIFU對腫瘤組織Ki-67陽性表達(dá)的影響（×200）

3.1 HIFU在腫瘤治療中的應(yīng)用效果 HIFU作為一種微創(chuàng)消融技術(shù)，可通過聚焦高能量的超聲靶向破壞癌細(xì)胞，使腫瘤組織凝固性壞死，具有降低麻醉風(fēng)險(xiǎn)、保留乳房完整性、避免臨近組織破壞以及簡化操作過程的優(yōu)點(diǎn)，已被應(yīng)用于乳腺癌的治療［10-11］。與單獨(dú)使用動脈粥樣硬化斑塊特異性肽-1 包裹DDP治療多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤相比，其與聚焦超聲聯(lián)合化療抑制瘤體生長的效果更佳［12］。HIFU 已被證實(shí)可通過阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程、抑制抗凋亡蛋白表達(dá)來誘導(dǎo)肺癌A549/DDP細(xì)胞凋亡［3］，還可通過降低p-gp蛋白表達(dá)來抑制A549 細(xì)胞對DDP 的耐藥性［13］。本研究通過構(gòu)建穩(wěn)定的MDA-MB-231/DDP及MCF-7/DDP 耐藥細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)HIFU 可有效抑制MDA-MB-231/DDP 及MCF-7/DDP 細(xì)胞增殖及腫瘤生長，阻滯細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，降低細(xì)胞對DDP 的耐藥性，與Zhang等［3］得出的HIFU抑制細(xì)胞增殖、腫瘤生長研究結(jié)果相似。

3.2 TRIF 在腫瘤中的作用機(jī)制 TRIF 信號通路作為一個(gè)重要的炎癥信號介質(zhì)［14］，與前列腺癌［15］、乳腺癌［16］等的發(fā)生有關(guān)。抑制TRIF 表達(dá)可減輕胰腺癌惡病質(zhì)模型小鼠的癌癥惡病質(zhì)［14］。姜黃素可通過下調(diào)TRIF 信號通路激活抑制乳腺癌細(xì)胞（MCF-7、MDA-MB-231）活力及細(xì)胞炎癥反應(yīng)［16］。還有研究表明，超聲熱療能夠通過抑制TRIF途徑促進(jìn)口腔鱗狀細(xì)胞癌（CAL-27和SCC-4細(xì)胞）的化療敏感性［4］。TRIF 能夠介導(dǎo)其下游多個(gè)信號途徑參與癌癥的進(jìn)程。ERK通路是其下游信號途徑之一，TRIF可通過抑制該通路來降低巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)［4］。ERK由ERK1和ERK2組成，與腫瘤細(xì)胞存活、增殖、轉(zhuǎn)移及癌癥藥物敏感性有關(guān)，阻斷該通路是促使細(xì)胞死亡的有效途徑［17］。有研究報(bào)道ERK 信號的激活能夠使乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231產(chǎn)生抵抗放療的作用，獲得抗放療的細(xì)胞系，抑制該通路可誘導(dǎo)MDAMB-231 細(xì)胞死亡，降低細(xì)胞放射抗性［18］。雌激素受體-α（estrogen receptor-α，ER-α）36 可通過激活ERK 信號通路降低乳腺癌小鼠及MCF-7 和MDAMD-231 細(xì)胞對DPP 的敏感性［19］。本研究發(fā)現(xiàn)，HIFU可顯著降低MDA-MB-231/DDP及MCF-7/DDP細(xì)胞及體外腫瘤組織中TRIF、p-ERK1/2/ERK1/2 表達(dá)水平；此外，還發(fā)現(xiàn)ERK通路激活劑fisetin可逆轉(zhuǎn)HIFU增強(qiáng)MCF-7和MDA-MD-231細(xì)胞及乳腺癌小鼠對DDP 敏感性的效應(yīng)，表明HIFU 可抑制TRIF 介導(dǎo)的ERK 通路的激活，并且HIFU 對乳腺癌細(xì)胞DDP化療敏感性的增強(qiáng)作用可能與抑制該通路激活有關(guān)。

綜上所述，HIFU 可通過抑制TRIF 表達(dá)來抑制其介導(dǎo)的ERK 通路，從而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖，增強(qiáng)DDP 化療敏感性。本研究為了解乳腺癌對DDP 化療耐藥性的機(jī)制提供了參考，有助于尋找克服DDP 化療耐藥性的新方法，但HIFU 對ERK 通路下游機(jī)制的影響還未進(jìn)行深入探討，這將成為今后研究的方向。