劉秋穎,李曉妍*,張亞云,張 鳳

(1.河北省保定市第二中心醫(yī)院婦科,河北 保定 072750;2.河北省石家莊市第八醫(yī)院內(nèi)科,河北 石家莊 050051;3.河北省第八人民醫(yī)院外一科,河北 石家莊 050011)

子宮內(nèi)膜癌具有發(fā)病率高、致死率高的特點，目前有越來越多的年輕女性患病[1]。目前臨床上對于子宮內(nèi)膜癌的主要發(fā)病機制尚不完全明確，但部分研究認為此病的發(fā)生與多數(shù)細胞因子表達異常相關(guān)[2]。微小RNA(microRNA,miR-205-5p)對子宮內(nèi)膜癌的抑癌基因具有抑制作用，從而促進了子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生[3]。程序性細胞壞死因子5(programmed cell necrosis factor 5,PDCD5)是與細胞凋亡存在聯(lián)系的一種基因，對抑癌細胞的增殖可通過細胞內(nèi)的內(nèi)吞作用進行抑制，促進癌細胞凋亡[4]。Beclin1是抑癌基因的一種，與自噬存在聯(lián)系，Beclin1水平下降會使自噬活性降低，進而引起子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生[5]。目前，關(guān)于miR-205-5p、PDCD5、Beclin1在子宮內(nèi)膜癌中表達研究甚少，因此，在本研究研究子宮內(nèi)膜癌組織中miR-205-5p、PDCD5、Beclin1的表達情況，明確三者是否參與此病的發(fā)生，為臨床上子宮內(nèi)膜癌的早期診斷提供有效依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2019年10月—2020年10月河北省保定市第二中心醫(yī)院病理科留存的75例子宮內(nèi)膜癌組織和距離癌組織邊緣5 cm癌旁組織，年齡35～57歲，平均(43.70±5.00)歲；臨床分期：Ⅰ期20例，Ⅱ期30例，Ⅲ～Ⅳ期25例；組織學(xué)分級：中低分化30例，高分化45例；病理類型：內(nèi)膜樣腺癌20例，鱗癌26例，腺鱗癌29例；淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移40例，淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移35例；肌層浸潤<1/2 45例，肌層浸潤≥1/2 35例。

本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準通過。

納入標準：①所有患者均符合《子宮內(nèi)膜癌診斷與治療指南(第四版)》[6]中對子宮內(nèi)膜癌的診斷標準；②患者病例資料完整。

排除標準：①子宮形態(tài)存在異常者；②合并心腦血管疾病者；③患有子宮肌瘤、子宮內(nèi)膜息肉、子宮不典型增生者；④合并血栓病史、哮喘疾病者；⑤術(shù)前接受過放療、化療者。

1.2指標檢測

1.2.1免疫組織化學(xué)檢測miR-205-5p、PDCD5、Beclin1表達情況 采用免疫組織化學(xué)檢測癌組織、癌旁組織標本miR-205-5p、PDCD5、Beclin1表達情況，做組織樣本固定、脫水、包埋后，制作4 μm組織切片，恒溫箱設(shè)置溫度為58 ℃，烘烤時間為2 h，在二甲苯中進行脫蠟處理30 min，之后浸在梯度乙醇中各5 min，再用無菌蒸餾水洗滌5 min。加入檸檬酸鈉抗原修復(fù)液在沸水中水浴20 min，冷卻到室溫采用PBS沖洗3次，每次持續(xù)5 min。分別滴加miR-205-5p、PDCD5、Beclin1抗體(1∶200)，在4 ℃的濕盒中過夜保存，第2天將濕盒取出后復(fù)溫處理1 h，采用PBS洗片3次，每次持續(xù)5 min。之后加入二氨基聯(lián)苯胺(1∶50)進行顯色處理1 min，最后加入蒸餾水反應(yīng)終止。加入蘇木素給予復(fù)染，鹽酸乙醇分化后，采用梯度乙醇進行脫水，采用二甲苯?jīng)_洗片3次一直到透明，采用中性樹脂封片處理，顯微鏡下觀察免疫組織化學(xué)染色情況。隨機在400倍鏡下選取5個視野，根據(jù)染色強度及陽性細胞百分率進行評分[7]：陽性細胞數(shù)0～1分為(-)，2分為(+)，3～4分為(++)，5～6分為(+++)。

1.2.2實時熒光定量法檢測miR-205-5p、PDCD5、Beclin1 表達情況 采用實時熒光定量法檢測癌組織、癌旁組織中的miR-205-5p、PDCD5、Beclin1 表達情況，采用Trizol法提取樣本RNA，使用Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將子宮內(nèi)膜組織中的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用Primer5.0軟件設(shè)計引物序列，啟動PCR儀，反應(yīng)體系：0.4 μL上下游引物、1 μL cDNA模板、10 μL SYBGreen，加蒸餾水至20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性1 s、95 ℃ 5 s、60 ℃ 31 s，共進行40個循環(huán)，采用2-△△Ct方法計算miR-205-5p、PDCD5、Beclin1表達量。miR-205-5p上游引物序列：5′-ACACTCCAGCTGGGTCCTTCATTCC-A-3′，下游引物序列：5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′；PDCD5上游引物序列：5′-CAACAGGAAGCA-AAGCACAG-3′，下游引物序列：5′-GTTGTCC-ATATCTTGCCATCTG-3′；Beclin1上游引物序列：5′-CCAGATGCGTTATGCCCAGAC-3′，下游引物序列：5′-CATTCCATTCCACGGGAACAC-3′；miR-205-5p內(nèi)參基因U6上游引物序列：5′-ATTGGAACGATACAGAGAGAAGATT-3′，下游引物序列：5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′；PDCD5內(nèi)參內(nèi)參基因β-actin上游引物序列：5′-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3′，下游引物序列：5′-GGGCACGAAGGCTCATCATCATT-3′；Beclin1內(nèi)參基因GAPDH上游引物序列：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游引物序列：5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS26.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料比較采用t檢驗和單因素方差分析。miR-205-5p、PDCD5、Beclin1之間相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性分析。繪制受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve,ROC)，分析miR-205-5p、PDCD5、Beclin1及三項聯(lián)合對子宮內(nèi)膜癌的診斷價值。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1癌組織、癌旁組織中miR-205-5p、PDCD5、Beclin1表達情況比較 miR-205-5p在癌旁組織中未見增生，隨著病情的增加miR-205-5p在癌組織的蛋白表達上升，產(chǎn)生子宮內(nèi)膜增生性病變，PDCD5在癌旁組織中表達較高，未見組織增生，PDCD5在癌組織中產(chǎn)生子宮內(nèi)膜增生性病變，Beclin1在癌旁細胞組織中表達為陰性，未見增生，Beclin1在癌組織中表達為陽性，產(chǎn)生子宮內(nèi)膜增生性病變，見圖1。癌組織中miR-205-5p表達高于癌旁組織，PDCD5、Beclin1表達低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

圖1 miR-205-5p、PDCD5、Beclin1在癌組織、癌旁組織中的表達(免疫組織化學(xué) ×400)A.癌旁組織miR-205-5表達;B.癌組織miR-205-5表達;C.癌旁組織PDCD5表達;D.癌組織PDCD5表達;E.癌旁組織Beclin1表達;F.癌組織Beclin1表達Figure 1 Expression of miR-205-5p, PDCD5 and Beclin1 in cancer tissues and adjacent tissues(immunohistochemistry ×400)

表1 癌組織、癌旁組織中miR-205-5p、PDCD5、Beclin1表達情況比較Table 1 Comparison of miR-205-5p, PDCD5 and Beclin1 expression in cancer tissues and adjacent tissues

2.2不同子宮內(nèi)膜癌臨床特征miR-205-5p、PDCD5、Beclin1表達情況比較 不同組織學(xué)分級、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肌層浸潤子宮內(nèi)膜癌患者miR-205-5p、PDCD5、Beclin1表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，Ⅲ～Ⅳ期、中低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、≥1/2肌層浸潤子宮內(nèi)膜癌患者miR-205-5p表達升高，PDCD5、Beclin1表達降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。不同年齡、病理類型子宮內(nèi)膜癌患者miR-205-5p、PDCD5、Beclin1表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 miR-205-5p、PDCD5、Beclin1與子宮內(nèi)膜癌臨床特征的關(guān)系分析Table 2 Relationship between miR-205-5p, PDCD5, Beclin1 and clinical features of endometrial cancer

2.3miR-205-5p、PDCD5、Beclin1之間的相關(guān)性分析 相關(guān)性分析顯示，miR-205-5p、PDCD5之間呈負相關(guān)(r=-0.666，P<0.001)；miR-205-5p、Beclin1之間呈負相關(guān)(r=-0.539，P<0.001)；PDCD5、Beclin1之間呈正相關(guān)(r=0.565，P<0.001)(圖2)。

圖2 miR-205-5p、PDCD5、Beclin1之間的相關(guān)性分析Figure 2 Correlation analysis among miR-205-5p, PDCD5 and Beclin1

2.4miR-205-5p、PDCD5、Beclin1對子宮內(nèi)膜癌的診斷價值 繪制ROC曲線結(jié)果顯示，三項聯(lián)合對子宮內(nèi)膜癌的診斷價值高于miR-205-5p、PDCD5、Beclin1單項診斷(P<0.05)。以正確診斷指數(shù)最大對應(yīng)的miR-205-5p、PDCD5、Beclin1值作為最佳診斷分界點。見表3、圖3。

表3 ROC曲線分析miR-205-5p、PDCD5、Beclin1對子宮內(nèi)膜癌的診斷價值Table 3 ROC curve analysis of the diagnostic value of miR-205-5p, PDCD5 and Beclin1 in endometrial cancer

圖3 miR-205-5p、PDCD5、Beclin1診斷子宮內(nèi)膜癌的ROC曲線Figure 3 ROC curve of miR-205-5p, PDCD5 and Beclin1 in the diagnosis of endometrial cancer

3 討 論

子宮內(nèi)膜癌屬女性生殖系統(tǒng)中發(fā)病率較高的一種惡性腫瘤，子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生與肥胖、月經(jīng)不調(diào)、雌激素長期服用、初潮過早等因素存在密切聯(lián)系，其發(fā)病過程極其復(fù)雜，致使大部分患者在確診時已經(jīng)是癌癥晚期，治療效果降低、生存率下降[8-10]。調(diào)查顯示，近年來年輕女性患病例數(shù)增多，患者預(yù)后生存率較低，因此尋找特異性診斷此病的指標對改變預(yù)后具有重要的意義[11]。

miR-205-5p是miRNA的一員，miRNA在人體細胞中有著廣泛的存在，在一些病毒細胞中也有其存在，可以通過對原癌或抑癌基因的調(diào)節(jié)對腫瘤的發(fā)生與發(fā)展造成影響[12]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-205-5p可通過抑制PTEN表達而促進子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生進展[13]。本研究結(jié)果顯示，在子宮內(nèi)膜癌中miR-205-5p的表達升高，且隨著淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移及浸潤程度的增加，miR-205-5p的升高加劇。miR-205-5p可能在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)展中發(fā)揮著促癌基因的作用，高表達的miR-205-5p對患者的病情發(fā)展具有促進作用，與時宗芬等[14]的研究結(jié)果一致。miR-205-5p對ESRRG具有抑制作用，ESRRG是一種雌性激素相關(guān)受體，ESRRG在子宮內(nèi)膜癌患者體內(nèi)發(fā)揮著抑癌基因的作用，其可明顯抑制惡性腫瘤細胞增殖，可對子宮內(nèi)膜細胞的侵襲能力、增殖、遷移進行調(diào)節(jié)，經(jīng)miR-205-5p抑制后，ESRRG的抑癌作用減弱，進而促進了子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生[15]。

PDCD5是一種在人體各組織中廣泛存在的一種程序性細胞死亡蛋白[16]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，PDCD5經(jīng)重組后可通過細胞內(nèi)吞作用對肝癌細胞凋亡，使肝癌細胞的克隆形成及體外增殖得到抑制，從而對肝癌的發(fā)生、發(fā)展進行調(diào)控[17]。本研究結(jié)果顯示，PDCD5在Ⅰ期中表達最高，在Ⅲ～Ⅳ期中表達降低，PDCD5的低表達會導(dǎo)致子宮內(nèi)膜癌細胞增殖，進而引起子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生，表明PDCD5表達降低對子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生具有促進作用。PDCD5在細胞癌變過程中，經(jīng)與p53結(jié)合，對p53蛋白酶的降解及出核作用進行抑制，使p53的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)能力得到增強，同時PDCD5對具有誘導(dǎo)癌細胞發(fā)生副凋亡的TAJ/TROY具有誘導(dǎo)作用，進而抑制子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生[18]。另外PDCD5經(jīng)重組誘導(dǎo)線粒體膜通透轉(zhuǎn)運孔開放，導(dǎo)致線粒體的損傷，進而使腫瘤細胞的凋亡速度加快[19]。

Beclin1是可以刺激自噬的一種抑癌基因，Beclin1的表達上升對自噬具有促進作用，自噬與凋亡不同，自噬可以通過血管生成、影響凋亡相關(guān)因子等多層面對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展發(fā)揮作用，當Beclin1的表達下調(diào)時自噬活性會降低，進而導(dǎo)致自噬對癌前期細胞生長的抑癌作用減弱，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生[20-21]。本研究結(jié)果顯示，不同組織學(xué)分級、臨床分期、肌層浸潤子宮內(nèi)膜癌患者Beclin1表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義，在深層浸潤、Ⅲ～Ⅳ期、中低分化中的表達最低，表明Beclin1的表達降低可使子宮內(nèi)膜癌患者病情加重。Beclin1可以促進自噬的細胞形成與成熟，促進吞噬泡的聚集與組裝，進而促進自噬細胞的形成，同時Beclin1可與UVRAG相結(jié)合，促進自噬的成熟，進而參與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程[22]。

雖然本文證實了miR-205-5p、PDCD5、Beclin1和子宮內(nèi)膜癌的關(guān)系，但因樣本過少，因此還需后續(xù)研究大樣本多中心的分析miR-205-5p、PDCD5、Beclin1的具體作用機制，造福于更多的患者。

綜上所述，miR-205-5p在子宮內(nèi)膜癌中高表達，PDCD5、Beclin1在子宮內(nèi)膜癌中低表達，隨著疾病的發(fā)展，miR-205-5p表達升高加劇，PDCD5、

Beclin1降低加劇，參與子宮內(nèi)膜癌的演變進程，臨床可根據(jù)上述指標對子宮內(nèi)膜癌進行早期評估。