馬微微，李玟玟，馬青，張振華，黃莉莉

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱，150040)

益生菌是一類對(duì)宿主有益的活性微生物，能產(chǎn)生確切的健康功效從而改善宿主微生態(tài)平衡。近年來，我國對(duì)益生菌的研究不斷深入，益生菌產(chǎn)業(yè)已成為我國食品工業(yè)中增長較快、創(chuàng)新密集的產(chǎn)業(yè)[1]。雙歧桿菌是益生菌研究和使用的主要對(duì)象之一，也是人體空腸中發(fā)現(xiàn)的最為重要的細(xì)菌，其數(shù)量可隨著腸道延伸不斷增加，在腸道中其他菌的數(shù)量也與雙歧桿菌的生長直接相關(guān)[2-3]。乳雙歧桿菌XLTG11是1株分離自健康嬰兒腸道具有優(yōu)良益生特性的雙歧桿菌，目前國內(nèi)外對(duì)于乳雙歧桿菌XLTG11的免疫調(diào)節(jié)作用未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)使用環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide, CTX)建立免疫抑制模型小鼠，通過檢測(cè)模型小鼠的全血白細(xì)胞數(shù)目、血清溶血素水平(HC50值)和脾淋巴細(xì)胞亞群百分比，探討乳雙歧桿菌XLTG11對(duì)宿主體液免疫和細(xì)胞免疫功能的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

6～8周齡健康SPF級(jí)雄性BALB/c小鼠(18～22 g)，遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于屏障環(huán)境動(dòng)物室，期間自由飲水、攝食，溫度控制在20～23 ℃，12 h明暗交替；乳雙歧桿菌XLTG11菌粉，葵花藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司；注射用CTX凍干粉，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；鹽酸左旋咪唑(levamisole hydrochloride，LEV)，山西太原藥業(yè)有限公司；綿羊紅細(xì)胞(sheep red blood cell，SRBC)、都氏試劑和SA緩沖液，上海源葉生物科技有限公司；補(bǔ)體(豚鼠血清)，玉環(huán)市南方試劑有限公司；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和膠原酶Ⅳ(>160 U/mg)，美國Gibco公司；磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)和中性蛋白酶(50 U/mg)，北京索萊寶科技有限公司；小鼠熒光單抗CD3-FITC(100203)、CD4-APC-Cy5.5(100433)、CD8a-PE(100707)和CD19-APC(115512)，安諾論(北京)生物科技有限公司。

MLS-3751L-PC高壓蒸汽滅菌器、MDF-382E -80 ℃冰箱，日本Panasonic公司；SORVALL ST8/8R低溫離心機(jī)，美國TOMOS公司；NovoCyte3110流式細(xì)胞儀，美國Agilent公司；SMATBCD Synergy MX全自動(dòng)酶標(biāo)儀，美國BIOTEK公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及受試樣品給予

所有動(dòng)物操作均按照黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理審批代碼：2020110401)。BALB/c小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為空白組、CTX組、LEV組、4個(gè)乳雙歧桿菌XLTG11不同劑量組，共計(jì)7組，每組8只。各組小鼠于每日上午8點(diǎn)半分別灌胃給予生理鹽水(空白組和環(huán)磷酰胺組)，LEV(鹽酸左旋咪唑組，10 mg/kg)，以及乳雙歧桿菌XLTG11(2.5×106、2.5×107、2.5×108和2.5×109CFU/mL組)，連續(xù)給予28 d。除空白組外，其余各組小鼠分別于灌胃的第23，24天腹腔注射CTX(40 mg/kg)，建立免疫功能低下模型。

1.2.2 檢測(cè)指標(biāo)

1.2.2.1 白細(xì)胞總數(shù)的測(cè)定

在末次給藥0.5 h后，采集小鼠眼球全血，加入含有抗凝劑的離心管中，用全血細(xì)胞分析儀檢測(cè)白細(xì)胞總數(shù)。

1.2.2.2 血清溶血素的測(cè)定

于灌胃給予后第24天，各組小鼠腹腔注射體積分?jǐn)?shù)2%的SRBC 0.2 mL進(jìn)行免疫。5 d后，即灌胃給予的第28天，摘除眼球取血于離心管內(nèi)，放置約1 h，2 000 r/min離心10 min，收集血清，將血清與生理鹽水按1∶100體積比稀釋。具體步驟參考文獻(xiàn)[4]，最后使用全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定各孔混合溶液光密度值。溶血素的量以半數(shù)溶血值(HC50)表示，HC50計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

1.2.2.3 脾淋巴細(xì)胞亞群百分比檢測(cè)

末次給藥0.5 h后，頸椎脫臼處死小鼠，分離脾臟放入生理鹽水中清洗，用濾紙去掉多余水分，立即放入組織保存液中待用。

單細(xì)胞懸液制備：將小鼠脾臟剪碎，使用酶混液消化，37 ℃孵育1 h，加入10% FBS，研磨過濾后于4 ℃離心5 min，棄上清液。加入10倍細(xì)胞體積的紅細(xì)胞裂解液，輕輕吹打混勻，裂解2 min后于4 ℃離心5 min，棄上清液。加入適量PBS，重懸沉淀，于4 ℃離心5 min，棄上清液，洗滌1～2次。最后用100 μL的PBS重懸細(xì)胞沉淀后進(jìn)行染色。

流式細(xì)胞儀檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞膜表面標(biāo)志物：將CD3-FITC、CD19-APC、CD4-APC-Cy5.5和CD8a-PE表面抗體按照一定的稀釋比例加入細(xì)胞懸液中，4 ℃避光孵育30 min，染色后的細(xì)胞于4 ℃離心5 min，棄上清液。加入500 μL的PBS重懸細(xì)胞沉淀，過0.22 μmol/L濾網(wǎng)后上機(jī)。擇通道FITC、APC、PE和PerCP/Cyanine 5.5，上機(jī)1×105個(gè)細(xì)胞，進(jìn)行分析。結(jié)果以CD3+、CD19+、CD4+CD8-和CD4-CD8+的百分比表示乳雙歧桿菌XLTG11對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞亞群的影響。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 白細(xì)胞總數(shù)的測(cè)定

乳雙歧桿菌XLTG11不同劑量對(duì)CTX小鼠全血白細(xì)胞(white blood cell,WBC)總數(shù)的影響如圖1所示。與空白組比較，CTX組小鼠白細(xì)胞總數(shù)顯著降低(P<0.001)。與CTX組比較，LEV組小鼠全血白細(xì)胞總數(shù)增加(P<0.05)，乳雙歧桿菌(2.5×109CFU/mL)組小鼠全血白細(xì)胞總數(shù)顯著增加(P<0.01)。

圖1 XLTG11不同劑量組對(duì)CTX小鼠全血白細(xì)胞數(shù)目的影響Fig.1 Effect of different doses of XLTG11 on total white blood cell of CTX mice 注:*** P<0.001，與空白組相比；#P<0.05，## P<0.01，與模型組相比

2.2 血清溶血素的測(cè)定

乳雙歧桿菌XLTG11不同劑量對(duì)CTX小鼠HC50的影響如圖2所示。與空白組比較，CTX組小鼠HC50值顯著降低(P<0.001)。與CTX組比較，LEV組小鼠HC50值增加(P<0.01)，乳雙歧桿菌XLTG11(2.5×106CFU/mL)和(2.5×107CFU/mL)組小鼠HC50值增加(P<0.05)，XLTG11(2.5×108CFU/mL)和(2.5×109CFU/mL)組小鼠HC50值顯著增加(P<0.001)。

圖2 XLTG11不同劑量組對(duì)CTX小鼠HC50的影響Fig.2 Effect of different doses of XLTG11 on HC50 of CTX mice 注:*** P<0.001，與空白組相比；#P<0.05，##P<0.01, ##P<0.001，與模型組相比

2.3 脾淋巴細(xì)胞亞群百分比的測(cè)定

乳雙歧桿菌XLTG11不同劑量組對(duì)CTX小鼠脾淋巴細(xì)胞亞群百分比的影響如表1和圖3所示。與空白組比較，CTX組小鼠脾淋巴細(xì)胞CD3+、CD19+、CD4+CD8-和CD4-CD8+百分比均明顯降低(P<0.05)。與CTX組比較，LEV組小鼠脾淋巴細(xì)胞CD3+、CD4+CD8-和CD4-CD8+百分比明顯增加(P<0.05)，乳雙歧桿菌XLTG11各劑量組小鼠脾淋巴細(xì)胞CD3+、CD4+CD8-和CD4-CD8+百分比顯著增加(P<0.05)，乳雙歧桿菌XLTG11(2.5×109CFU/mL)組小鼠脾淋巴細(xì)胞CD19+百分比增加(P<0.01)。

表1 XLTG11不同劑量組對(duì)CTX小鼠脾淋巴細(xì)胞亞群百分比的影響 單位：%Table 1 Effect of different doses of XLTG11 on percentage of splenic lymphocyte subsets of CTX mice

a-CD4+CD8-和CD4-CD8+ T淋巴細(xì)胞；b-CD19+ T淋巴細(xì)胞圖3 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)各組小鼠脾淋巴細(xì)胞亞群百分比Fig.3 Percentage of splenic lymphocyte subsets of mice in various groups detected by flow cytometry注：A-空白組；B-模型組；C-LEX組；D-XLTG11(2.5×106 CFU/mL)組；E-XLTG11(2.5×107 CFU/mL)組；F-XLTG11(2.5×108 CFU/mL)組；G-XLTG11(2.5×109 CFU/mL)組

3 討論

免疫系統(tǒng)是機(jī)體內(nèi)一系列生物學(xué)結(jié)構(gòu)和進(jìn)程所組成的疾病防御系統(tǒng)，是人體健康的保障[5]。隨著人們生活節(jié)奏加快，普遍人群免疫力低下，據(jù)世界衛(wèi)生組織數(shù)據(jù)顯示，全球約75%的人都處于亞健康狀態(tài)[6]，亞健康影響人們的生活，降低生活質(zhì)量。因此，提高機(jī)體免疫力尤為重要。研究表明，腸道內(nèi)的益生菌可以直接或間接地刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)成熟，影響機(jī)體單核細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞功能，提高機(jī)體免疫力[7-8]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，乳雙歧桿菌XLTG11在2.5×106CFU/mL時(shí)可以增加免疫低下小鼠的HC50值，提高脾淋巴細(xì)胞CD3+、CD19+、CD4+CD8-和CD4-CD8+百分比。作為保健食品攝入體內(nèi)的益生菌在機(jī)體復(fù)雜的消化系統(tǒng)面前，其存活率大大降低，在體內(nèi)存活時(shí)間變短，不能達(dá)到預(yù)期的健康功效[9]，面對(duì)此問題往往通過加大劑量實(shí)現(xiàn)益生菌的增免作用。然而，乳雙歧桿菌XLTG11具有優(yōu)良益生特性，其在pH 8.0的人工消化液中消化11 h，存活率仍然高達(dá)89.75%，能夠以活的狀態(tài)進(jìn)入人體腸道發(fā)揮健康功效。因此，乳雙歧桿菌XLTG11在相對(duì)較低濃度2.5×106CFU/mL時(shí)，表現(xiàn)出免疫增強(qiáng)作用。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，40 mg/kg CTX連續(xù)腹腔注射2 d可顯著降低小鼠全血白細(xì)胞總數(shù)和HC50值。在灌胃給予28 d不同劑量乳雙歧桿菌XLTG11后，乳雙歧桿菌XLTG11各劑量組小鼠的血清溶血素水平明顯提高。乳雙歧桿菌XLTG11(2.5×109CFU/mL組)小鼠的血液白細(xì)胞數(shù)目明顯增加。白細(xì)胞數(shù)目與機(jī)體非特異性免疫功能密切相關(guān)，血清溶血素的含量可以反映小鼠特異性體液免疫功能。以往研究表明，一種由雙歧桿菌為主要成分的益生菌可以明顯增加健康小鼠的血液白細(xì)胞數(shù)目[10]。雙歧桿菌菌株BifidobacteriumadolescentisBB-2 和BifidobacteriumlongumBB-3可以增高健康小鼠的血清溶血素吸光值，且隨著劑量升高，溶血素含量逐漸增強(qiáng)[11]。綜上可見，乳雙歧桿菌XLTG11具有增強(qiáng)小鼠非特異性和特異性免疫功能的作用，且具有劑量依賴性。

T淋巴細(xì)胞是特異性免疫的主要效應(yīng)細(xì)胞，其細(xì)胞膜表面分子與T細(xì)胞功能相關(guān)，用以分離鑒定不同亞群。T淋巴細(xì)胞按表面分化抗原不同(cluster differentiation，CD)大致分為具有協(xié)助細(xì)胞免疫和體液免疫功能的輔助性T細(xì)胞 (helper T cell, Th) 以及具有殺傷靶細(xì)胞功能的細(xì)胞毒性T細(xì)胞 (cytotoxic T lymphocyte, Tc)。T淋巴細(xì)胞亞群相互協(xié)作，反映機(jī)體免疫調(diào)控狀態(tài)和免疫水平，是免疫調(diào)節(jié)的關(guān)鍵所在[12-13]。CD3+分子是T淋巴細(xì)胞標(biāo)志物, 按照T淋巴細(xì)胞表面抗原決定簇不同分為CD4+CD8-T淋巴細(xì)胞和CD4-CD8+T淋巴細(xì)胞2個(gè)亞群[14]。CD4+CD8-T淋巴細(xì)胞為Th型淋巴細(xì)胞，參與細(xì)胞因子分泌，促進(jìn)B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞增殖分化，發(fā)揮固有免疫應(yīng)答作用。CD4-CD8+T淋巴細(xì)胞為Tc型淋巴細(xì)胞，具有特異性殺傷功效和細(xì)胞毒作用，可殺傷靶細(xì)胞[15-16]。CD4+CD8-和CD4-CD8+T淋巴細(xì)胞與細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ、TNF-α呈正相關(guān)關(guān)系[17]。CD19+參與B淋巴細(xì)胞發(fā)育再生，在成熟B淋巴細(xì)胞分化為合成和分泌抗體的漿細(xì)胞過程中，其表面CD19+丟失，并可發(fā)生免疫球蛋白的類別轉(zhuǎn)換，被激活的B細(xì)胞膜表面表達(dá)和分泌的免疫球蛋白類別從產(chǎn)生IgM轉(zhuǎn)換為產(chǎn)生IgG、IgA或IgE，升高血清中免疫球蛋白IgA和IgG表達(dá)水平，發(fā)揮體液免疫調(diào)節(jié)功能[18]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，乳雙歧桿菌XLTG11對(duì)CTX致免疫低下小鼠的脾臟T淋巴細(xì)胞亞群平衡具有調(diào)節(jié)作用，可提高小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞CD3+、CD19+、CD4+CD8-和CD4-CD8+百分比。這與本實(shí)驗(yàn)前期研究結(jié)果相一致，即乳雙歧桿菌XLTG11可以提高小鼠血清中免疫球蛋白IgA、IgG和細(xì)胞因子IL-2、IL-6、IFN-γ、TNF-α的水平，參與小鼠特異性免疫應(yīng)答作用調(diào)節(jié)。另有研究表明，乳雙歧桿菌M8可提高大鼠全血CD3+T淋巴細(xì)胞、CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞及NK細(xì)胞百分比[19]。包含多種乳雙歧桿菌的復(fù)合益生菌可拮抗CTX造成的小鼠免疫低下狀態(tài)，提高CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞占脾細(xì)胞的比例，減少脾淋巴細(xì)胞凋亡[20]。因此，推測(cè)乳雙歧桿菌XLTG11可通過刺激T淋巴細(xì)胞增殖分化，發(fā)揮其增強(qiáng)小鼠細(xì)胞與體液免疫的能力。

綜上可見，乳雙歧桿菌XLTG11因其具有良好穩(wěn)定性和腸道耐受性，相對(duì)較低濃度亦具有增強(qiáng)免疫作用，在益生菌保健食品開發(fā)方面具有成本低的優(yōu)勢(shì)。目前對(duì)于乳雙歧桿菌的增強(qiáng)免疫作用機(jī)制研究多集中在腸道壁壘和腸道菌群等方面，乳雙歧桿菌XLTG11表現(xiàn)出明顯的免疫增強(qiáng)作用，今后可對(duì)其進(jìn)行全面評(píng)價(jià)，為益生菌保健食品的開發(fā)提供藥理學(xué)基礎(chǔ)。