茶新有 李嘉哲 楊建坤 殷緣 張榮沭

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

熱激轉(zhuǎn)錄因子(Hsfs)是熱脅迫下可以激活熱基因表達(dá)的一類(lèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因，是高等植物轉(zhuǎn)錄水平上熱脅迫響應(yīng)基因的中心調(diào)控因子，在植物熱脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和耐熱性的生產(chǎn)過(guò)程中起著重要的作用[1]。Hsf結(jié)構(gòu)一般包括4個(gè)部分：N端DNA結(jié)合域(DNA bindingdomain，DBD)、寡聚化結(jié)構(gòu)域(OD或HR-A/B)、核定位信號(hào)(NLS)和核輸出信號(hào)(NES)。此外，少數(shù)Hsf還有1個(gè)最不保守的從C端激活域(CTD)。DBD結(jié)合于靶基因上游啟動(dòng)子區(qū)域的保守?zé)峒ぴ?GAAnnTTC)并募集其他轉(zhuǎn)錄因子形成寡聚體激活靶基因的表達(dá)[2]。在植物體內(nèi)HSF最早是在番茄(Solanumlycopersicum)中克隆到[3]。隨著全基因組的測(cè)序和研究的進(jìn)一步完善，在水稻(OryzasativaL.)和擬南芥(Arabidopsisthaliana)等模式植物中克隆到了相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子基因。近些年來(lái)，植物Hsfs功能的研究主要集中在其響應(yīng)逆境脅迫上，發(fā)現(xiàn)Hsfs基因在植物中不僅通過(guò)自身表達(dá)來(lái)抵抗逆境脅迫，而且能通過(guò)結(jié)合其互作蛋白或調(diào)控下游基因的表達(dá)來(lái)參與植物對(duì)逆境脅迫的抵抗，如參與調(diào)控冷、熱、重金屬、高鹽等脅迫相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)提高植物的抗逆性[4-5]。Hsf通過(guò)與基因啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)保守的熱激元件(HSE)序列的相互作用來(lái)調(diào)節(jié)基因表達(dá)，以實(shí)現(xiàn)植物對(duì)非生物脅迫的應(yīng)激響應(yīng)。

楊樹(shù)(Populus)是木本植物研究的模式種[6-7]。山新楊(Populusdavidiana×P.albavar.Pyramidalis)是以山楊為母本、新疆楊為父本雜交得到的優(yōu)良樹(shù)種。山新楊具有樹(shù)冠狹窄，樹(shù)干通直，葉形優(yōu)美，生長(zhǎng)快、抗逆性較強(qiáng)等特點(diǎn)，是我國(guó)北方首選的最耐寒的園林綠化和防護(hù)用的樹(shù)種。由于品質(zhì)優(yōu)良，很受人們重視。迄今為止，山新楊熱激轉(zhuǎn)綠因的生物信息學(xué)分析、組織表達(dá)模式和生物脅迫應(yīng)答的相關(guān)研究未見(jiàn)報(bào)道。本研究團(tuán)隊(duì)已建立良好的山新楊遺傳轉(zhuǎn)化體系[8-9]?；跇?gòu)建的山新楊與植物益生菌棘孢木霉和致病菌鏈格孢菌互作的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得一條特異表達(dá)基因Potri.014G141400.1的cDNA全長(zhǎng)序列，該基因含有典型的HSF-DNA-binding功能域。在Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLASTx比對(duì)，與已命名的銀白楊HSF基因一致性最高，將其命名為PdPapHSF-A4b。在這基礎(chǔ)上擬對(duì)該基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析。利用RT-qPCR(Real-time Quantitative polymerase chain reaction)技術(shù)揭示PdPapHSF-A4b在莖尖、葉、莖和根中的表達(dá)模式，以此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究山新楊根部進(jìn)行鹽、堿和高滲透壓脅迫、接種5種植物土傳病害病原菌或植物激素誘導(dǎo)48 h后，PdPapHSF-A4b的不同組織表達(dá)變化，為進(jìn)一步揭示該基因的調(diào)控功能和進(jìn)行山新楊基因工程育種獲得高抗山新楊新品種提供依據(jù)，具有重要的研究意義。

1 材料與方法

供試植物為山新楊組培苗，由本實(shí)驗(yàn)室保存。繼代培養(yǎng)基：WPM(木本植物培養(yǎng)基)+NAA 0.1 mg/L+6-BA 0.5 mg/L；生根培養(yǎng)基為：WPM+IBA 0.4 mg/L。在人工氣候箱培養(yǎng)和完成各種處理。

供試微生物：核盤(pán)菌NECC20005(SclerotiniasclerotiorumNECC20005)、立枯絲核菌NECC20006(RhizoctoniasolaniNECC20006)、尖孢鐮刀菌NECC20007(FusariumoxysporumNECC20007)、金黃殼囊孢菌C29(CytosporachrysospermaC29)、鏈格孢菌NECCFP002(AlternariaalternateNECCFP002)。

1.1 PdPapHSF-A4b基因的PCR擴(kuò)增及測(cè)序

基于本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的山新楊與棘孢木霉菌和鏈格孢菌互作的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)(北京，百邁客公司)[10]，采用Gang et al.[11]的方法進(jìn)行有參轉(zhuǎn)錄組差異基因表達(dá)分析。經(jīng)篩選獲得特異表達(dá)基因Potri.004G109200.1的cDNA全長(zhǎng)序列。依據(jù)此序列信息，利用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)克隆該基因的全長(zhǎng)引物(表1)，采用CTAB裂解法提取山新楊葉片總RNA。并用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser,TaKaRa)合成cDNA。以cDNA為模板，TaKaRa Primer STAR?Max DNA Polymerase為反應(yīng)試劑，使用表1中“HSF_A4bF”和“HSF_A4bR”引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，條件為：98 ℃預(yù)變性3 min，98 ℃ 10 s，60 ℃ 8 s，72 ℃ 5 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸2 min。將擴(kuò)增片段進(jìn)行純化并按照說(shuō)明書(shū)將其連接到pMD18-T載體上，送交哈爾濱市擎科嘉美生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

表1 PCR引物序列

1.2 PdPapHSF-A4b基因的生物信息學(xué)分析

利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的ORFFinder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)分析PdPapHSF-A4b的開(kāi)放讀框長(zhǎng)度；利用NCBI的BLASTx程序(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)比對(duì)獲得PdPapHSF-A4b同源蛋白序列；運(yùn)用PsortII prediction(http://psort.hgc.jp/form2.html)進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)；利用TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預(yù)測(cè)PdPapHSF-A4b蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域；利用ExPASy網(wǎng)站中ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)分析PdPapHSF-A4b的氨基酸組分及理化性質(zhì)；利用Prot Scale(http://web.expasy.org/protscale/)進(jìn)行PdPapHSF-A4b蛋白疏水性分析；利用MEME軟件(https://meme-suite.org/meme/)對(duì)PdPapHSF-A4b同源序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)；利用NCBI的Conserve Domains(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)預(yù)測(cè)蛋白保守區(qū)；應(yīng)用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)在線預(yù)測(cè)PdPapHSF-A4b蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，并用Mega6.0軟件采用鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)(Bootstrap=1000)。

1.3 PdPapHSF-A4b基因在組織中的差異表達(dá)量

將40 d的山新楊組培苗接到生根液體培養(yǎng)基的玻璃試管中培養(yǎng)15 d，培養(yǎng)條件為23 ℃，相對(duì)濕度75%，16 h光照/8 h黑暗。

分別取組培生根苗莖尖(頂芽未展開(kāi)葉及莖(S))、幼莖即帶第1和第2完全展開(kāi)葉片的兩個(gè)節(jié)間(J1)、木質(zhì)化的莖即莖中部的兩個(gè)節(jié)間(J2)、發(fā)育中的莖即莖最下面兩個(gè)節(jié)間(J3)、嫩葉即J1上的兩片葉(L1)、成熟葉即莖中部的兩個(gè)節(jié)間為S2、S2上的兩片葉(L2)、相對(duì)老的葉片即J3的兩片葉(L3)、根(R)等8個(gè)部位的樣品，進(jìn)行磨樣并提取總RNA，分析PdPapHSF-A4b基因在不同組織中的差異表達(dá)量。

1.4 PdPapHSF-A4b基因在非生物、生物脅迫及激素誘導(dǎo)下組織表達(dá)量

無(wú)菌條件下將6周齡山新楊組培苗(不定根長(zhǎng)度在10～20 cm)分別置于含有NaCl(200 mmol/L)、Na2CO3溶液(pH=10)和含有聚乙二醇6000(PEG6000)30%的液體WPM培養(yǎng)基中，進(jìn)行鹽、堿和高滲透壓3種非生物脅迫試驗(yàn)。處理48 h后，分別收集莖尖(S)、成熟葉(L2)和根部(R)樣品。

無(wú)菌條件下將活化后的5種植物土傳致病真菌接種到PDA培養(yǎng)基中，在26 ℃條件下培養(yǎng)10 d獲得大量分生孢子或菌絲體。細(xì)致刮取立枯絲核菌PDA培養(yǎng)基(1 cm×4 cm×3塊)上的菌絲溶于WPM液體培養(yǎng)基中制備菌絲體懸浮液。其他4種真菌用血球計(jì)數(shù)器計(jì)算分生孢子懸浮液體積，備用。再將6周齡組培苗的根部分別接種尖孢鐮刀菌、核盤(pán)菌、金黃殼囊孢菌和鏈格孢菌分生孢子，使其終體積為1×105CFU/mL，或接種已配制的立枯絲核菌的菌絲體。接種48 h后，分別收集莖尖(S)、成熟葉(L2)和根部(R)樣品。

無(wú)菌條件下將6周齡山新楊組培苗分別置于含有100 μmol/L ABA(脫落酸)、JA(茉莉酸)或SA(水楊酸)的液體WPM培養(yǎng)基中，處理48 h后，分別收集莖尖(S)、成熟葉(L2)和根部(R)樣品。

上述樣品以同齡非處理山新楊組培苗為對(duì)照，分別分析PdPapHSF-A4b基因在3種非生物脅迫、5種生物脅迫和3種激素誘導(dǎo)下的組織差異表達(dá)量。每個(gè)試驗(yàn)組設(shè)3株苗，每處理3次重復(fù)。

1.5 RT-qPCR分析

收集的山新楊各個(gè)樣品采用CTAB法提取總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser，TaKaRa)參照說(shuō)明書(shū)合成cDNA。以cDNA為模板，利用北京全式金生物公司(TransGen Biotech)的TransStart Top Green qPCR SuperMix酶和羅氏公司的熒光定量RT-qPCR儀器(LightCycler 96；Roche)進(jìn)行熒光定量RT-qPCR反應(yīng)。3個(gè)內(nèi)參基因及其GenBank登錄號(hào)分別為：PdPapACT2(MN196665)、PdPapEF1-α(MN196666)和PdPapTub(MN196667)?；虻囊镄蛄幸?jiàn)表1。實(shí)時(shí)定量qPCR的反應(yīng)體系為：20 μL(2×Taq Master Mix 10 μL；10 μmol/L雙向引物各0.8 μL；模板2 μL；DEPC處理水6.4 μL)。為了確保試驗(yàn)結(jié)果的重現(xiàn)性，對(duì)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)的樣品進(jìn)行了3個(gè)技術(shù)重復(fù)。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 10 min，94 ℃ 5 s，59 ℃ 15 s進(jìn)行45個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 s。熔解曲線按照95 ℃ 10 s，65 ℃ 60 s，97 ℃ 1 s進(jìn)行。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用2-ΔCt方法[12]對(duì)無(wú)誘導(dǎo)條件下山新楊PdPapHSF-A4b基因在不同組織部位的組成型表達(dá)和不同誘導(dǎo)條件下不同組織部位的表達(dá)進(jìn)行計(jì)算，Ct代表每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，該方法計(jì)算所得的結(jié)果為PdPapHSF-A4b基因相對(duì)于3個(gè)內(nèi)參基因的平均表達(dá)水平的相對(duì)表達(dá)量。使用Microsoft Office Excel 2010軟件包和SPSS25統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)測(cè)量數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)、作圖和分析。對(duì)同一時(shí)間點(diǎn)的試驗(yàn)組之間的差異顯著性進(jìn)行ANOVA分析，在P<0.05下比較差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 PdPapHSF-A4b基因序列分析

山新楊PdPapHSF-A4b基因測(cè)序結(jié)果獲得1 359 bp的片段(圖1a)。其ORF的起始密碼子在第1個(gè)氨基酸處，終止密碼子位于第452個(gè)氨基酸處，編碼451個(gè)氨基酸。HSF-A4b結(jié)構(gòu)保守域(smart00415)含有31個(gè)氨基酸(編碼序列在12～104 bp處)，含有典型的HSF-DNA-binding域(圖1b)。

(a)核酸和對(duì)應(yīng)氨基酸序列；(b)預(yù)測(cè)的保守域。

PdPapHSF-A4b編碼蛋白的分子式為C2261H3480N647O717S19，分子質(zhì)量為51 808 u，理論等電點(diǎn)為5.44，脂肪系數(shù)61.06，不穩(wěn)定系數(shù)61.63(不穩(wěn)定系數(shù)>40為不穩(wěn)定蛋白)，預(yù)測(cè)為不穩(wěn)定蛋白。不具有跨膜結(jié)構(gòu)，亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析表明其在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)中的分布情況分別占65.2%，21.7%。由此可以初步推測(cè)PdPapHSF-A4b在核內(nèi)發(fā)揮作用。

2.2 PdPapHSF-A4b蛋白結(jié)構(gòu)特性分析

在Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中利用BLASTx進(jìn)行序列搜索，獲得8條(來(lái)源于4個(gè)楊樹(shù)品種、1個(gè)柳樹(shù)品種)與PdPapHSF-A4b一致性最高的同源基因編碼氨基酸序列(總分值>792；序列覆蓋率>75%；E值=0；統(tǒng)一性>84.73%)。MEME在線分析結(jié)果顯示：這8條蛋白序列均具有位置靠近C端高度保守的3個(gè)基序(圖2a)其中第2個(gè)基序與第3個(gè)基序距離很近。

對(duì)PdPapHSF-A4b基因編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，基因編碼的蛋白質(zhì)由α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成，其中α-螺旋占比39.82%；延伸鏈占比5.09%；β-轉(zhuǎn)角占比2.88%，無(wú)規(guī)則卷曲占比52.21%。其中，無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)占比最高。對(duì)PdPapHSF-A4b蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果可見(jiàn)(圖2c)，共比對(duì)上50個(gè)模板，在模型GMQE值最大為0.13的條件下，該蛋白與模型5d5u.1.B的一致性較高，為51.52%；覆蓋值為0.22，范圍在第10～105個(gè)氨基酸處，此模型為人類(lèi)Hsf1與HSE DNA的晶體結(jié)構(gòu)蛋白。

進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果顯示(圖2d)：可分為兩大組。第I組包括PdPapHSF、銀白楊(Populusalba)XP_034905225、小葉楊(Populussimonii)AKV56389.1、胡楊(Populuseuphratica)XP_011033721.1、毛果楊(Populustrichocarpa)XP_002321069.1、毛果楊(Populustrichocarpa)PNT04784.1；第Ⅱ組包括小墊柳(Salixbrachista)KAB5527533.1、銀白楊XP_034905226.1和毛果楊XP_024441462.1。其中，銀白楊(XP_034905225)HSF基因與山新楊HSF基因親緣關(guān)系最近。

(a)PdPapHSF-A4b蛋白結(jié)構(gòu)域及高度保守基序；(b)三級(jí)結(jié)構(gòu)模板；(c)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；(d)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2.3 山新楊PdPapHSF-A4b在莖尖、莖、葉和根組織中的表達(dá)

基因表達(dá)量分析發(fā)現(xiàn)，山新楊PdPapHSF-A4b在莖尖、莖、葉和根中均有表達(dá)(表2)。其在成熟葉中的表達(dá)量最高，分別是嫩葉的1.36倍和相對(duì)老的葉片的3.17倍(P<0.05)；在莖組織的表達(dá)量由大到小為木質(zhì)化的莖、發(fā)育中的莖、幼莖，木質(zhì)化的莖分別是發(fā)育中莖的1.33和幼莖的4倍。根中的組織表達(dá)量是莖尖的2.5倍。

表2 山新楊PdPapHSF-A4b在不同組織中的表達(dá)量

2.4 脅迫處理對(duì)PdPapHSF-A4b的組織表達(dá)變化

在莖尖部位，鹽脅迫和高滲透壓脅迫使PdPapHSF-A4b顯著上調(diào)為對(duì)照的2.16和1.83倍(P<0.05)，而堿脅迫下顯著下調(diào)表達(dá)(P<0.05)。在成熟葉中，PdPapHSF-A4b的表達(dá)量?jī)H在堿脅迫下顯著上調(diào)表達(dá)(P<0.05)，而在鹽脅迫和高滲透壓脅迫下顯著下調(diào)為對(duì)照的5.29和3.10倍(P<0.05)；在根組織中，3種脅迫條件下PdPapHSF-A4b表達(dá)量均為上調(diào)，分別為對(duì)照的18.25、12.00、3.75倍(表3)。

表3 非生物脅迫下PdPapHSF-A4b在莖尖、葉和根中的表達(dá)量

山新楊組培苗根部接種5種植物土傳致病真菌48 h后，PdPapHSF-A4b的表達(dá)量與對(duì)照相比均顯著上調(diào)(P<0.05)，分別是對(duì)照的1.82、38.00、1.48、11.04和3.26倍(表4)。

在莖尖組織中，PdPapHSF-A4b的表達(dá)量與對(duì)照相比顯著上調(diào)(P<0.05)，分別是對(duì)照的7.80、2.10、2.05和3.10倍。僅有接種金黃殼囊孢菌48 h時(shí)，PdPapHSF-A4b的表達(dá)量與對(duì)照相比均顯著下調(diào)，是對(duì)照的2.63倍(表4)。

在成熟葉中，PdPapHSF-A4b的表達(dá)量與對(duì)照相比均顯著下調(diào)(P<0.05)，分別是對(duì)照的1.06、3.75、3.10和2.12倍。

在3種植物激素誘導(dǎo)48 h后，山新楊PdPapHSF-A4b基因的組織表達(dá)量發(fā)生不同的變化。只有葉部位的PdPapHSF-A4b基因表達(dá)量下調(diào)至對(duì)照的0.5倍，而頂尖和根中PdPapHSF-A4b基因表達(dá)量均顯著上調(diào)至對(duì)照的1.04和1.69倍。

受JA誘導(dǎo)48 h，只有根部位的PdPapHSF-A4b基因表達(dá)量上調(diào)至對(duì)照的4.58倍，而莖尖和葉部位中PdPapHSF-A4b基因表達(dá)量均顯著下調(diào)至對(duì)照的1.11和3.72倍(P<0.05)。而受ABA誘導(dǎo)48 h，莖尖、葉和根中的PdPapHSF-A4b基因受ABA誘導(dǎo)均顯著上調(diào)表達(dá)，分別是對(duì)照的4.48、3.41和9.96倍(P<0.05)(表5)。

表5 激素處理下PdPapHSF-A4b在莖尖、葉和根中的差異表達(dá)

3 討論與結(jié)論

植物熱激轉(zhuǎn)錄因子(Hsf)作為網(wǎng)絡(luò)調(diào)控中一類(lèi)重要的調(diào)節(jié)因子，能夠響應(yīng)多種生物和非生物脅迫，并賦予植物多種脅迫抗性[13]。目前，對(duì)植物Hsfs基因的抗逆功能研究主要集中在擬南芥、水稻、番茄、玉米(Zeamays)等草本植物上[14]，對(duì)木本植物的研究很少。木本植物在生長(zhǎng)發(fā)育、生理及形態(tài)結(jié)構(gòu)等諸多方面與草本植物不同，其抗逆機(jī)理與草本植物也會(huì)有所區(qū)別。因此，在山新楊中克隆PdPapHSF-A4b新基因并研究其組織表達(dá)特異性和在多種逆境脅迫下的調(diào)控規(guī)律具有創(chuàng)新性。

采用PCR技術(shù)克隆到山新楊PdPapHSF-A4b基因序列，此序列含有1 359個(gè)核酸。基因編碼451個(gè)氨基酸，在N端含有1個(gè)最保守的DNA結(jié)構(gòu)域(DBD)，由3個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)(H1，H2，H3)和4個(gè)反相平行的β折疊(β1、β2、β3、β4)[15]。DBD結(jié)構(gòu)是植物HSF的DNA結(jié)合活性必需的區(qū)域結(jié)構(gòu)，能夠特異識(shí)別并結(jié)合到DNA中的順式作用元件[16]。生物信息學(xué)分析認(rèn)為PdPapHSF-A4b為非跨膜親水性蛋白，預(yù)測(cè)主要位于細(xì)胞核中。同源基因進(jìn)化樹(shù)分析表明該基因與銀白楊(XP_034905225)親緣關(guān)系最近。

以山新楊6周齡組培苗為材料，采用qRT-PCR研究PdPapHSF-A4b的空間表達(dá)特性分析，發(fā)現(xiàn)其在莖尖、葉、莖和根中均有表達(dá)，并且PdPapHSF-A4b的表達(dá)模式從幼嫩到老化的組織表達(dá)量逐漸升高，在成熟葉中的表達(dá)量最高，為幼嫩莖的10.28倍。說(shuō)明PdPapHSF-A4b隨山新楊發(fā)育梯度而表達(dá)提升，其生物功能可能僅在成熟葉組織中特異性發(fā)揮。植物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中會(huì)遇到各種非生物脅迫，例如干旱、高鹽堿、極端溫度等。此時(shí)，植物常常通過(guò)調(diào)節(jié)自身基因的表達(dá)來(lái)響應(yīng)非生物逆境的脅迫[15-20]。本研究發(fā)現(xiàn)山新楊dPapHSF-A4b受到鹽、堿和高滲透壓脅迫，在根組織中的轉(zhuǎn)錄水平均受誘導(dǎo)而上調(diào)，說(shuō)明dPapHSF-A4b可能是楊樹(shù)響應(yīng)和抵御脅迫過(guò)程中一個(gè)重要的蛋白，并且具有正向調(diào)控抗鹽、堿和高滲透壓脅迫的能力。有研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥中HSFA1與HSFA2也能增強(qiáng)植株苗期對(duì)鹽脅迫的抵抗能力[21]。植物在受到非生物脅迫下，激活的Hsfs能夠識(shí)別并結(jié)合熱激元件HSE(GAAnnTTC)，激活下游HSP基因，從而提高植物的抗逆性[22]。綜合比較發(fā)現(xiàn)，PdPapHSF-A4b的表達(dá)在3種非生物脅迫下均有改變，特別是鹽脅迫下，該基因表達(dá)變化明顯，表明其可能參與了鹽脅迫應(yīng)答。

鏈格孢菌、尖孢鐮刀菌、核盤(pán)菌、立枯絲核菌和金黃殼囊孢菌為常見(jiàn)的5種土傳植物病害致病菌，在同一環(huán)境條件下，有可能引起植物不同程度發(fā)生莖腐、莖基腐、根腐、花腐病、菌核病、褐斑病、葉枯病等多種病害癥狀，并且寄主較廣。本研究發(fā)現(xiàn)，山新楊根際接種不同致病真菌后，不同組織部位中PdPapHSF-A4b的響應(yīng)不同。在莖尖部位，尖孢鐮刀菌、立枯絲核菌和細(xì)鏈格孢菌使其顯著上調(diào)表達(dá)，在成熟葉中，只有根部接種立枯絲核菌時(shí)，其顯著上調(diào)表達(dá)，說(shuō)明植物根系侵染病原菌48 h，莖尖和成熟葉中細(xì)胞壁的降解相對(duì)較少?？赡芨扛腥镜募怄哏牭毒鷮?duì)楊樹(shù)苗的葉片會(huì)產(chǎn)生影響，PdPapHSF-A4b表達(dá)量上調(diào)可能與降解葉中細(xì)胞壁被分解而產(chǎn)生的寡聚糖相關(guān)[23]。在根中，接種鏈格孢菌、尖孢鐮刀菌、核盤(pán)菌、立枯絲核菌和金黃殼囊孢菌，PdPapHSF-A4b的表達(dá)量均顯著上調(diào)，其中，接種尖孢鐮刀菌顯著上調(diào)最高。由于尖孢鐮刀菌是營(yíng)半活體病原，其他致病菌是完全營(yíng)腐生病原，而PdPapHSF-A4b被具有營(yíng)活體營(yíng)養(yǎng)的病原直接接觸誘導(dǎo)表達(dá)提升最劇烈，故推測(cè)PdPapHSF-A4b可能是直接響應(yīng)這類(lèi)病原的一個(gè)重要基因。

植物遭受逆境脅迫后，體內(nèi)的激素會(huì)發(fā)生一系列的變化來(lái)適應(yīng)環(huán)境。水楊酸、茉莉酸和脫落酸是重要的植物激素，在植物響應(yīng)非生物脅迫(如干旱，低溫等)中起著重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)PdPapHSF-A4b受脫落酸誘導(dǎo)各組織的表達(dá)量均顯著上調(diào)；受茉莉酸和脫落酸誘導(dǎo)葉部位的表達(dá)量均下調(diào)，根部的表達(dá)量均上調(diào)。有研究表明，小麥(Triticumaestivum)、水稻和擬南芥中的Hsfs受脫落酸的誘導(dǎo)顯著上調(diào)表達(dá)[24-26]，這些基因參與了脫落酸信號(hào)途徑介導(dǎo)的抗逆反應(yīng)。因此，研究探索PdPapHSF-A4b對(duì)脫落酸、水楊酸和茉莉酸等激素調(diào)控對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)，為闡述山新楊響應(yīng)非生物脅迫的分子機(jī)理提供初步的依據(jù)。

綜合上述，本研究表明了山新楊PdPapHSF-A4b對(duì)基因組織表達(dá)模式隨楊樹(shù)發(fā)育梯度而表達(dá)提升，其生物功能可能僅在成熟葉組織中特異性發(fā)揮。PdPapHSF-A4b是特異性地響應(yīng)鹽、堿和高滲透壓脅迫的重要蛋白。PdPapHSF-A4b能對(duì)根部5種致病真菌侵染產(chǎn)生不同程度的應(yīng)答，尤其是對(duì)尖孢鐮刀菌侵染表達(dá)高度上調(diào)，說(shuō)明PdPapHSF-A4b可能是直接響應(yīng)具有營(yíng)活體營(yíng)養(yǎng)的病原的一個(gè)重要基因，并且可能在對(duì)內(nèi)生真菌的識(shí)別和響應(yīng)中也扮演重要角色。因此，推測(cè)PdPapHSF-A4b參與了植物激素水楊酸、茉莉酸和脫落酸誘導(dǎo)的信號(hào)途徑。本研究結(jié)果將為進(jìn)一步揭示PdPapHSF-A4b基因的功能和通過(guò)分子植物育種構(gòu)建高抗速生楊樹(shù)品種提供依據(jù)。