姚珂心 王瑞博 劉靜 白雪 齊睿 劉勝男 李永華 張開明

(河南農(nóng)業(yè)大學，鄭州，450002)

許多觀賞園藝作物的葉片會在逆境下形成從綠至紅、紫等各種顏色(著名的“秋季紅葉”景觀[1])，這主要歸功于植物體內(nèi)一種黃酮類物質(zhì)——花色素苷。植物在遭受多種環(huán)境脅迫(包括低溫、高光、旱澇、營養(yǎng)缺乏等)時，應激合成花色素苷?；ㄉ剀粘顺噬?，其在植物體內(nèi)的另一個顯著功能是強抗氧化能力；已有研究表明，植物體內(nèi)合成花色素苷后，不僅觀賞價值大大增加，對低溫、高光等多種逆境的抗性也顯著增強[2]?；ㄉ剀盏纳锖铣墒嵌喾N花色素苷合成基因共同表達的結(jié)果，其合成途徑上的結(jié)構(gòu)基因分為——早期生物合成基因(PAL、C4H、4CL、CHS、CHI、F3H、F3′H等)，它們編碼相應的花色素苷合成酶催化生成肉桂酸、4-香豆酸、4-香豆酰CoA、4,2′,4′,6′-四羥查爾酮、黃烷酮、二氫黃酮醇、二氫槲皮素等；晚期生物合成基因(DFR、LAR、ANS、ANR、UFGT等)，其對應的酶類催化生成無色花色素和各類花色素苷(如矢車菊類花色素苷、天竺葵類花色素苷、飛燕草類花色素苷)[3]。GST為花色素苷轉(zhuǎn)運基因，可與花青素結(jié)合形成谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶-類黃酮復合體，促進類黃酮物質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運或囊泡轉(zhuǎn)運[4]。

四季秋海棠(Begoniasemperflorens)是秋海棠科(Begoniaceae)秋海棠屬(Begonia)的觀賞花卉，為多年生常綠草本，因葉形獨特、葉色翠綠、四季開花不斷，而廣泛用于花壇、花鏡、盆花、吊盆等，在園林綠化和裝飾中有著獨特的應用價值。四季秋海棠葉片在低溫、高光等環(huán)境脅迫時，葉片也會變紅，變紅后的葉片含有大量的花色素苷，對四季秋海棠觀賞價值有重要影響。為此，本研究以四季秋海棠為研究對象，選擇狀態(tài)良好、長勢一致的幼苗，進行低溫脅迫處理；通過實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)測定花色素苷合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因和轉(zhuǎn)運基因低溫時的表達量；采用高效液相色譜分析法和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS-MS)相結(jié)合的方法，分析低溫處理對四季秋海棠葉片花色素苷組分的影響；探索低溫時四季秋海棠葉片花色素苷合成結(jié)構(gòu)基因表達量與花色素苷質(zhì)量分數(shù)之間的關(guān)系。旨在為選育高抗性和高觀賞性的四季秋海棠提供參考。

1 材料和方法

將四季秋海棠綠葉紅花“超級奧林匹克”的種子播種于基質(zhì)(V(泥炭土)∶V(蛭石)∶V(珍珠巖)=3∶1∶1)中后，放置于培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)(條件：白天25 ℃、10 h，夜晚15 ℃、14 h，光照300 μmol·m-2·s-1，相對濕度保持為85%左右)，待株高長至10 cm左右時，選取狀態(tài)良好、長勢一致的幼苗用于低溫脅迫處理。低溫處理條件，溫度為白天15 ℃、夜晚5 ℃，其他條件與培養(yǎng)時條件保持一致。分別在0、1、3、6、9、24、48、96、144、264 h采集葉片樣品(選擇第2～3片展開的健康嫩葉)，用于后續(xù)試驗。

采用改良的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法[5]從混合四季秋海棠葉片樣本中提取總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA第一條鏈。

用引物設(shè)計軟件(Primer 3)在線設(shè)計實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)的基因特異性引物(見表1)，送華大公司合成。

表1 四季秋海棠葉片花色素苷合成基因和內(nèi)參基因的qRT-PCR擴增引物序列

實時熒光定量聚合酶鏈式反應試劑盒(TB Green?Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)RR820A)購自Takara公司，具體操作按照試劑盒說明書進行。反應體系：10 μL甲苯胺藍綠色預混液(TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus)，2X)；1 μL正向引物(10 μmol/L)，1 μL反向引物(10 μmol/L)；0.4 μL 6-羧基-X-羅丹明參比染料(ROX Reference Dye Ⅱ(50X))；1 μL cDNA；6.6 μL雙蒸水(ddH2O)；總體系20 μL。擴增程序：50 ℃反應2 min；95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，40個循環(huán)。內(nèi)參基因選用Bs18S(基因登陸號No.KJ959633)。

四季秋海棠葉片花色素苷組分鑒定的樣品制備：將經(jīng)過液氮處理的葉片放入2 mL離心管中，在研磨儀中，在45 Hz條件下用4 min將葉片研磨至粉末狀；在離心管中放入0.1 g粉末，取1 mL鹽酸體積分數(shù)為10%的鹽酸甲醇溶液進行溶解，黑暗4 ℃條件下過夜提取，黑暗期間渦旋3次；第二天在9 360 r/min條件下離心10 min，取上清液后用0.22 μm微孔濾膜過濾后放入進樣瓶中，-20 ℃條件下保存。

色譜分析柱：C18色譜柱(250×4.6 mm，5 μm)；流動相A為體積分數(shù)為5%的甲酸水溶液，流動相B為甲醇溶液；柱溫35 ℃；流速為0.8 mL/min；進樣量為20 μL；檢測波長為520 nm；洗脫梯度見表2。

表2 高效液相色譜檢測流動相洗脫梯度

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫處理對四季秋海棠葉片表型的影響

由圖1可見：低溫處理初期，葉片還處于綠色狀態(tài)，未發(fā)生明顯變化；在處理24 h時，發(fā)現(xiàn)有一兩片葉子開始泛黃；處理48 h時，大部分葉子有變黃的趨勢；處理96 h時，已有1/4左右的葉片發(fā)紅，葉片有變紅的趨勢；處理144 h時，有1/2左右的葉片變紅；直到處理264 h時，葉片幾乎全變紅。

圖1 四季秋海棠葉片低溫處理時的表型

2.2 低溫處理對四季秋海棠葉片花色素苷結(jié)構(gòu)基因及相關(guān)轉(zhuǎn)運基因BsGST表達量的影響

為了研究低溫處理過程中，花色素苷相關(guān)結(jié)構(gòu)基因在不同處理時長的表達量的變化，對各個時間點的樣品進行實時熒光定量聚合酶鏈式反應試驗(見表3、表4)。在未低溫處理(處理時間為0)時，各個基因的表達量幾乎都在1左右。經(jīng)過低溫處理后，各基因表達水平都發(fā)生了顯著變化，且在處理后期表達量都明顯上調(diào)?；ㄉ剀蘸铣缮嫌位駼sC4H、Bs4CL、BsCHI、BsF3H表達量都在9 h顯著表達，而且在264 h基因表達量都出現(xiàn)最大值，其中BsCHI基因的最大表達量約是未低溫處理(處理時間為0)時的38倍。BsPAL基因在6 h時已顯著表達，而BsCHS基因在48 h時才顯著表達，兩者也分別在264 h時達到最大表達量?；ㄉ剀蘸铣上掠位駼sLAR、BsANR、BsANS都在6 h時表達量顯著增加，在264 h時表達量達到最大值，其中BsANS基因的最大表達量是未低溫處理(處理時間為0)的63倍左右。BsDFR基因從處理開始表達量一直呈上升趨勢，直至處理結(jié)束時表達量達到最大。BsF3′H基因在9、48、264 h時的表達水平都非常顯著，其中在48 h時的表達量最大，約是未低溫處理(處理時間為0)的20倍。BsUFGT基因在時表達3 h量出現(xiàn)顯著變化，在48 h時表達量出現(xiàn)最大值，其余時間表達量都無顯著變化。

表3 低溫處理持續(xù)過程中葉片花色素苷合成上游結(jié)構(gòu)基因相對表達量

由表4可見：BsGST基因在3 h時開始出現(xiàn)表達，在24 h后表達量顯著增加，在48 h時表達量達到未低溫處理(處理時間為0))時的22倍左右，之后又顯著下降，在96 h后表達量持續(xù)增加；在264 h時達到最大值，約為未低溫處理(處理時間為0)的56倍。

2.3 低溫處理對四季秋海棠葉片花色素苷組分的影響

2.3.1低溫處理264 h后四季秋海棠葉片花色素苷組分構(gòu)成

用高效液相色譜將低溫處理264 h的四季秋海棠葉片花色素苷分離后，先后共出現(xiàn)4個有效峰(見圖2)。發(fā)現(xiàn)混合標準品中矢車菊素-3-O-半乳糖苷出峰時間為10.71 min、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷出峰時間為10.83 min，分別與樣品的1號峰(出峰時間為10.72 min)和2號峰(出峰時間為10.84 min)出峰時間相對應；由此推斷，四季秋海棠葉片1號峰和2號峰物質(zhì)，分別為矢車菊素-3-O半乳糖苷、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷。

表4 低溫處理持續(xù)過程中葉片花色素苷合成下游結(jié)構(gòu)基因和轉(zhuǎn)運基因(BsGST)相對表達量

A為低溫處理264h后四季秋海棠葉片樣品；B為矢車菊素-3-O-半乳糖苷、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷混合標準品。

由圖3可見：10.61～10.95 min峰，子離子碎片質(zhì)荷比(m/z)為286.6，與矢車菊素苷元相對應；由母離子質(zhì)荷比448.7可知，丟失的碎片離子質(zhì)荷比(m/z)為162，與葡萄糖基或半乳糖基相吻合；推測，此峰為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷或矢車菊素-3-O-半乳糖苷，結(jié)合前面高效液相色譜試驗結(jié)果，再次印證1號峰為矢車菊素-3-O-半乳糖苷、2號峰為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷。同樣的分析方法，10.12～10.38 min峰與天竺葵素苷元相符合，進而推測3號峰為為天竺葵素-3-O-葡萄糖苷；12.22～12.47 min峰與飛燕草素苷元相符合，進一步判斷4號峰為飛燕草素-3-O-半乳糖苷。

(a)為質(zhì)譜多反應檢測(MRM)，出峰時間為10.12～10.38 min，母離子質(zhì)荷比為432.5；(b)為質(zhì)譜多反應檢測，出峰時間為10.61～10.95 min，母離子質(zhì)荷比為448.7；(c)為質(zhì)譜多反應檢測，出峰時間為12.22～12.47 min，母離子質(zhì)荷比為465.2。

2.3.2低溫處理對四季秋海棠葉片花色素苷組分質(zhì)量分數(shù)的影響

采用分析對比得到的最佳色譜條件對低溫處理0、3、6、9、24、48、96、144、264 h時間點的提取樣品，進行高效液相色譜檢測。將液相色譜面積代入標準方程中，得到不同時間花色素苷各組分在提取液中的質(zhì)量分數(shù)(見表5)。

表5 不同低溫處理時四季秋海棠葉片花色素苷質(zhì)量分數(shù)

應用高效液相色譜對不同低溫處理時的四季秋海棠葉片花色素苷組分質(zhì)量分數(shù)進行測定，結(jié)果表明，隨著低溫處理時間的延長，花色素苷總質(zhì)量分數(shù)明顯增加，其中低溫處理24 h時出現(xiàn)顯著增加，低溫處理264 h時花色素苷總質(zhì)量分數(shù)達到最大值，這與四季秋海棠葉片表型變化結(jié)果相一致。在花色素苷各組分中，矢車菊素-3-O-半乳糖苷、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的質(zhì)量分數(shù)增加較明顯，而其他組分無顯著變化。在低溫處理的初期，矢車菊素-3-O-半乳糖苷、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的質(zhì)量分數(shù)分別是總花色素苷的40%左右。矢車菊素-3-O-半乳糖苷在低溫處理96 h時質(zhì)量分數(shù)顯著增加，超過了總花色素苷的50%；而矢車菊素-3-O-葡萄糖苷在低溫處理144 h時，質(zhì)量分數(shù)才顯著增加。低溫處理結(jié)束時，與矢車菊素-3-O-葡萄糖苷相比，矢車菊素-3-O-半乳糖苷質(zhì)量分數(shù)顯著增加，其質(zhì)量分數(shù)約為低溫處理前的16倍，占總花色素苷質(zhì)量分數(shù)的70%以上。在低溫處理全過程中，矢車菊素-3-O-半乳糖苷的增加速率和最終質(zhì)量分數(shù)(12.23 mg·kg-1)，都高于矢車菊素-3-O-葡萄糖苷。由此可知，低溫脅迫主要促進矢車菊素-3-O-半乳糖苷的大量合成，因此推測，低溫脅迫時矢車菊素-3-O-半乳糖苷是導致四季秋海棠葉片變紅的主要物質(zhì)。

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，低溫花色素苷合成途徑中，早期合成基因BsPAL、BsCHS、BsCHI、BsF3H、BsF3′H，幾乎都是在低溫處理6、9 h出現(xiàn)顯著表達；后期合成基因BsDFR、BsANS、BsUFGT和轉(zhuǎn)運基因BsGST，則都是在低溫處理48、96 h才顯著表達；且基本上在低溫處理結(jié)束時，表達量達最大值。此外，花色素苷主要成分矢車菊素-3-O-半乳糖苷、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的質(zhì)量分數(shù)，分別在低溫處理96、144 h時開始顯著積累，在低溫處理264 h時質(zhì)量分數(shù)最高。這與低溫處理的四季秋海棠葉片，在24 h時有葉子開始泛黃、96 h時已有葉片發(fā)紅、264 h時葉片幾乎全變紅的結(jié)果相對應。

低溫處理時，四季秋海棠葉片花色素苷合成結(jié)構(gòu)基因、轉(zhuǎn)運基因相對表達量顯著升高，進而使花色素苷質(zhì)量分數(shù)明顯增加，其中花色素苷組分矢車菊素-3-O-半乳糖苷的質(zhì)量分數(shù)、質(zhì)量分數(shù)增加速率最高，最終導致四季秋海棠葉片逐漸變紅。本研究結(jié)果表明，四季秋海棠葉片花色素苷的組成成分包括：矢車菊素-3-O-半乳糖苷、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、天竺葵素-3-O-葡萄糖苷、飛燕草素-3-O-半乳糖苷；其中矢車菊素-3-O-半乳糖苷是導致四季秋海棠葉片變紅的主要成分。

本研究表明，秋季低溫增強了四季秋海棠花色素苷合成途徑的相關(guān)酶和運輸花色素苷的谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GSTs)，最終導致在葉片和莖部積累了大量的花色素苷。已有研究表明，低溫時，花色素苷的合成與碳水化合物的積累和活性氧(ROS)的產(chǎn)生有關(guān)。低溫通過限制碳源利用和減少庫的容量，而對碳水化合物的代謝有較大的影響[6]。例如：低溫時，四季秋海棠的葉脈和莖的韌皮部顯著積累大量的胼胝質(zhì)，而胼胝質(zhì)的積累能夠阻斷碳水化合物的運輸，使消耗降低，隨之葉片和莖部的碳水化合物質(zhì)量分數(shù)顯著增加，最終促進花色素苷的合成[1]。所以，一般都認為碳水化合物的積累是低溫誘導花色素苷發(fā)生的原因。已有研究表明，多種環(huán)境脅迫均會使植物產(chǎn)生活性氧，而活性氧也被證明與多種逆境下的花色素苷合成相關(guān)[7]，由BsRbohD基因產(chǎn)生的活性氧參與了低溫誘導四季秋海棠葉片花色素苷的合成[8]。而過氧化氫(H2O2)作為活性氧的一種，也是低溫誘導花色素苷合成過程的一個重要信號分子[9]，適度環(huán)境脅迫產(chǎn)生的過氧化氫也能夠誘導花色素苷的合成[10]。在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中，過氧化氫通過上調(diào)花色素苷的晚期合成基因(TT3、TT18)和轉(zhuǎn)錄因子(PAP1、TT8、MYB113、MYB114)的表達，促進花色素苷的積累[11]。

影響花色素苷合成的除了結(jié)構(gòu)基因外，還有調(diào)控基因，主要包括MYB、bHLH、WD40三大類，它們通過調(diào)控結(jié)構(gòu)基因，進而影響花色素苷的合成。在低溫時，MdbHLH3因磷酸化而增加與結(jié)構(gòu)基因啟動子的結(jié)合，促進了花色素苷的合成[12]。在擬南芥中，R2R3-MYB與bHLH、WD40構(gòu)成MYB-bHLH-WD40(MBW)轉(zhuǎn)錄復合物，激活花色素苷晚期合成基因(DFR、ANS、UFGT)的表達，進而使植物體內(nèi)花色素苷積累[13]。本研究表明，低溫處理后，使得前期四季秋海棠葉片花色素苷結(jié)構(gòu)基因上調(diào)表達，從而導致后期花色素苷的大量積累，最終導致其葉片變紅，這其中也一定有相關(guān)調(diào)控基因的參與，還需接下來深入研究。

已有研究表明，秋海棠花中的花色素主要為矢車菊素[14]，秋海棠科植物葉片花色素苷中50%以上屬于矢車菊素類花色素苷[15]。本研究表明，正常條件時，四季秋海棠葉片中的矢車菊素類花色素苷占花色素苷的85%左右。因此推測，低溫時，四季秋海棠葉片大量合成矢車菊素類花色素苷，可能是因為秋海棠科植物易于形成矢車菊素。已有研究表明，自然界中的三類花色素苷(花葵素苷、花青素苷、翠雀素苷)分別為磚紅色、紅色、藍色。矢車菊素與糖苷結(jié)合后屬花青素苷，顏色上主要對應紅色，其根據(jù)結(jié)合糖苷的不同可分為矢車菊素-3-O-半乳糖苷、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷等。其中矢車菊素-3-O-半乳糖苷已被證實在很多物種主要花色素苷中占比較高，例如：紅皮梨主要花色素苷質(zhì)量分數(shù)最高的是矢車菊素-3-O-半乳糖苷[16]。王甜元等[17]研究表明，套袋蘋果梨(PyrusbretschneideriRehd.‘Pingguoli’)解袋后，矢車菊素-3-O-半乳糖苷質(zhì)量分數(shù)最高約占總質(zhì)量分數(shù)的90%，而矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的質(zhì)量分數(shù)較少。肖長城等[18]研究表明，紅梨果皮中花色素苷的主要成分為矢車菊素-3-O-半乳糖苷、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷，其中矢車菊素-3-O-半乳糖苷質(zhì)量分數(shù)最高，約占總花色素苷質(zhì)量分數(shù)的66.37%。李永洲等[19]則研究表明，紅瓤核桃葉片在生長初期最重要的兩種花青苷，是飛燕草-3-O-半乳糖苷、矢車菊素-3-O-半乳糖苷。

本研究中，四季秋海棠低溫脅迫后，矢車菊素-3-O-半乳糖苷質(zhì)量分數(shù)、質(zhì)量分數(shù)增加速率，都高于矢車菊素-3-O-葡萄糖苷，這與平衡狀態(tài)下呋喃糖構(gòu)型和吡喃糖構(gòu)型比例以及蔗糖質(zhì)量分數(shù)增加有關(guān)。已有研究表明，半乳糖苷和葡萄糖苷為差向異構(gòu)體[20]，兩者在水溶液的平衡組成上存在明顯差異，葡萄糖苷中幾乎沒有呋喃構(gòu)型，而半乳糖苷中約有7%的呋喃構(gòu)型。呋喃構(gòu)型中含有較大的集團—CH(OH)CH2OH為五元環(huán)，比吡喃構(gòu)型環(huán)張力大，構(gòu)型能量相對較高，因此含有半乳糖苷的化合物比葡萄糖苷化合物具有更強的穩(wěn)定性[21]。此外，已有研究表明，低溫時，四季秋海棠葉片中碳水化合物質(zhì)量分數(shù)以蔗糖增加最為明顯[6]。而在蘋果著色期，與矢車菊素-3-O-葡萄糖苷相比，矢車菊素-3-O-半乳糖苷與蔗糖質(zhì)量分數(shù)存在更加顯著的正相關(guān)性[22]。