何毅 張欣 謝牧洪 陳曉楠 趙恬 陳鈺瑩 鄭欣悅 楊桂燕

(西北農(nóng)林科技大學(xué)，楊凌，712100)

bHLH(basic helix-loop-helix)是由約60個(gè)氨基酸組成的一種廣泛存在于真核生物的轉(zhuǎn)錄因子，其名稱來(lái)源于兩個(gè)保守但功能不同的結(jié)構(gòu)域-堿性區(qū)域(basic)、螺旋-環(huán)-螺旋區(qū)域(HLH)。15個(gè)氨基酸組成的堿性區(qū)域位于bHLH結(jié)構(gòu)域的N端，起識(shí)別DNA的作用；兩個(gè)親水親脂α-螺旋和連接環(huán)組成的HLH區(qū)域位于bHLH結(jié)構(gòu)域的C端，通過(guò)與不同bHLH轉(zhuǎn)錄因子的α-螺旋之間相互作用形成的異源二聚體[1-3]，并與靶基因啟動(dòng)子結(jié)合形成二聚體，從而調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育、應(yīng)答脅迫、次生代謝[4]。

植物中bHLH轉(zhuǎn)錄因子數(shù)量眾多、功能多樣，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程的關(guān)鍵調(diào)控中起重要作用。如赤霉素合成[5]、根毛發(fā)育[6]、植物光形態(tài)發(fā)生、心皮發(fā)育[7]等。bHLH家族基因同時(shí)也參與植物對(duì)各種不良環(huán)境脅迫的應(yīng)答，在擬南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(Oryzasativa)、煙草(Nicotianatabacum)、小麥(Triticumaestivum)和胡楊(Populuseuphratica)等多種植物中發(fā)現(xiàn)響應(yīng)低溫、高鹽、干旱等多種脅迫的bHLH家族基因[8-12]。擬南芥bHLH122通過(guò)與CYP707A3啟動(dòng)子中G-box/E-box順式元件結(jié)合并抑制其表達(dá)，從而增強(qiáng)其抗旱、抗鹽堿能力[10]。干旱條件下，水稻的bHLH類轉(zhuǎn)錄因子OsbHLH148通過(guò)茉莉酸信號(hào)途徑調(diào)節(jié)植株的耐旱性[11]。煙草NtbHLH123通過(guò)結(jié)合NtCBF基因啟動(dòng)子中的G-box/E-box元件并正向調(diào)節(jié)其表達(dá)，從而增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因煙草植株的耐凍性[12]。小麥轉(zhuǎn)錄因子TabHLH39在轉(zhuǎn)基因擬南芥的過(guò)表達(dá)提升了植物中的可溶性糖和脯氨酸含量，從而改善轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐旱、耐鹽和耐凍性[9]。胡楊(Populuseuphratica)PebHLH35基因主要存在于細(xì)胞核，通過(guò)調(diào)節(jié)葉片氣孔密度、光合作用提高植株耐旱性[8]。可見，bHLH是植株應(yīng)對(duì)非生物脅迫的重要轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)對(duì)其進(jìn)行鑒定，有助于揭示植株的抗性響應(yīng)機(jī)制。

構(gòu)樹(Broussonetiapapyifera(Linn.) L’Hert. ex Vent)屬于?？茦?gòu)屬的落葉喬木，具有速生、適應(yīng)性強(qiáng)、分布廣、繁殖能力強(qiáng)等特點(diǎn)，在重金屬污染礦區(qū)長(zhǎng)勢(shì)優(yōu)良，被稱為礦區(qū)植被恢復(fù)的先鋒樹種[13]。近年，構(gòu)樹響應(yīng)重金屬脅迫的分子機(jī)制有相關(guān)報(bào)道，Xu et al.[14]研究發(fā)現(xiàn)Cd脅迫下構(gòu)樹多個(gè)基因和路徑參與了Cd脅迫響應(yīng)，如AUX/IAA、ARF、bHLH、bZIP、GRAS、NAC、MYB和WRKY家族基因以及ABA信號(hào)和鈣信號(hào)途徑。徐正剛[15]研究發(fā)現(xiàn)構(gòu)樹BpTT2和BpMYB6基因的過(guò)量表達(dá)均能有效改善構(gòu)樹的抗Cd能力。以上研究表明，構(gòu)樹響應(yīng)重金屬脅迫是一個(gè)復(fù)雜的生理生化反應(yīng)過(guò)程，但具體的分子機(jī)制有待進(jìn)一步深入。為充分理解構(gòu)樹在重金屬污染土壤修復(fù)中的作用，掌握構(gòu)樹重金屬響應(yīng)機(jī)制，本研究通過(guò)在構(gòu)樹bHLH家族成員挖掘的基礎(chǔ)上，選取響應(yīng)Cd脅迫表達(dá)上調(diào)的1個(gè)bHLH成員(命名為BpbHLH149)進(jìn)行Cd脅迫下的表達(dá)和轉(zhuǎn)基因酵母的抗Cd能力分析，以期為構(gòu)樹用于Cd污染修復(fù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及處理

植物材料：同批次構(gòu)樹組培苗轉(zhuǎn)移至土壤生長(zhǎng)至2 a。

處理方法：在相同條件下，用150 μmol·L-1的CdCl2溶液對(duì)構(gòu)樹進(jìn)行脅迫處理，處理后第0、3、12、24、48、72 h等時(shí)間分別取其根、葉和莖，用液氮速凍后保存于冰箱-80 ℃?zhèn)溆?。每個(gè)處理包含5棵植株。

1.2 BpbHLH149基因鑒定與分析

從在CdCl2脅迫下的構(gòu)樹轉(zhuǎn)錄組篩選出的上調(diào)表達(dá)基因中，篩選bHLH家族成員，選擇其中1條表達(dá)值較高的bHLH基因(命名為BpbHLH149)進(jìn)行分析。BpbHLH149基因開放讀碼框(ORF)用ORF finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)確定。根據(jù)BpbHLH149基因ORF兩端序列設(shè)計(jì)引物BpbHLH149-F和BpbHLH149-R(表1)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。經(jīng)PCR及測(cè)序確定并利用Expasy Prot-Param(http://web.expasy.org/protparam/)對(duì)確認(rèn)的BpbHLH149基因序列特征進(jìn)行分析。擬南芥的bHLH家族成員在Tair(The Arabidopsis Information Resource，https://www.arabidopsis.org/)下載；利用MEGA7構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。使用CD-Search(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)對(duì)BpbHLH149的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析。利用Swiss Model(https://swissmodel.expasy.org/)推測(cè)其蛋白三維結(jié)構(gòu)。

1.3 BpbHLH149基因響應(yīng)Cd脅迫的表達(dá)分析

采用CTAB方法提取各樣品總RNA。RNA經(jīng)DNA消化酶后利用Prime Script TM RT reagent Kit(CWBIO，康為世紀(jì)，中國(guó))反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并經(jīng)10倍稀釋后用作實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR(qRT-PCR)的模板。qRT-PCR使用SYBR Green Real time PCR Master mix(CWBIO)進(jìn)行，內(nèi)參基因?yàn)锳ctin。BpbHLH149定量引物為DL-F和DL-R(表1)。定量反應(yīng)所用儀器為Applied Biosystems生產(chǎn)的StepOneTMReal Time PCR System，反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 30 s；94 ℃ 12 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，45個(gè)循環(huán)，81 ℃ 1 s，每個(gè)樣品重復(fù)3次。定量結(jié)果采用2-△△Ct法[16]進(jìn)行分析，表示為相對(duì)于內(nèi)參基因相對(duì)于對(duì)照的表達(dá)值。數(shù)據(jù)使用SPSS軟件包分析。樣品變異性用標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。不同時(shí)間點(diǎn)與未脅迫表達(dá)量之間的表達(dá)差異用T檢驗(yàn)分析(p<0.05)。

表1 引物的名稱及設(shè)計(jì)

1.4 酵母表達(dá)載體構(gòu)建及脅迫分析

根據(jù)BpbHLH149基因序列特征及pYES2酶切位點(diǎn)特性設(shè)計(jì)酵母表達(dá)載體引物BpbHLH149-JM-F和BpbHLH149-JM-R(表1)。通過(guò)PCR反應(yīng)獲得含有酶切位點(diǎn)的BpbHLH149序列，經(jīng)酶切純化后與pYES2連接獲得重組載體pYES2-BpbHLH149。將pYES2-BpbHLH149轉(zhuǎn)入酵母INVSC1中，經(jīng)PCR檢測(cè)和測(cè)序確認(rèn)后的候選菌株提取RNA，通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)BpbHLH149的表達(dá)水平，選擇表達(dá)最高的一個(gè)株系記為INVSC1(pYES2-BpbHLH149)用于后續(xù)分析。轉(zhuǎn)化空pYES2載體的記為INVSC1(pYES2)，為對(duì)照。本研究所用工具酶均為寶生物(Takara)公司產(chǎn)品。

分別挑取INVSC1(pYES2-BpbHLH149)和INVSC1(pYES2)單克隆置于含2%葡萄糖的SC-Ura液體培養(yǎng)基中，30 ℃震蕩培養(yǎng)16 h，收集酵母菌體重懸于含2%半乳糖的SC-Ura液體培養(yǎng)基中，且調(diào)整OD600=0.5，30 ℃繼續(xù)震蕩培養(yǎng)至OD600=1.8，分別收集菌體進(jìn)行脅迫處理。

酵母鎘脅迫成活率測(cè)定：取相同量的上述INVSC1(pYES2-BpbHLH149)和INVSC1(pYES2)菌體，分別在含有0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0% CdCl2的SC-Ura液體培養(yǎng)基(含2%葡萄糖)中震蕩培養(yǎng)30 h，測(cè)定酵母生長(zhǎng)活性值(OD600)。數(shù)據(jù)使用SPSS軟件包分析。樣品變異性用標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。相同處理下INVSC1(pYES2-BpbHLH149)和INVSC1(pYES2)之間的差異顯著性用T檢驗(yàn)分析(p<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 BpbHLH149基因基本生物信息

BpbHLH149基因(GeneBank登錄號(hào)：ON568871)ORF長(zhǎng)630 bp，推導(dǎo)其分子質(zhì)量為22 968.42 u，含有209個(gè)氨基酸，理論等電點(diǎn)為11.35。BLAST發(fā)現(xiàn)該基因與白梨(Pyrusbretschneideri)轉(zhuǎn)錄組中的bHLH149基因(Gene Bank登錄號(hào)：XP_009337645.1)相同。保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)該基因具有bHLH保守域，表明BpbHLH149蛋白為bHLH蛋白(圖1)。經(jīng)同源搜索并進(jìn)行進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)BpbHLH149與擬南芥蛋白AtbHLH147(AT3G17100.1)進(jìn)化關(guān)系較近(圖2)。Swiss Model同源建模預(yù)測(cè)的蛋白三維結(jié)構(gòu)如圖3所示。

圖1 BpbHLH149蛋白保守結(jié)構(gòu)域

標(biāo)尺表示蛋白之間的差異性；分支上數(shù)值表示同一分支上蛋白的相關(guān)性。

2.2 BpbHLH149基因響應(yīng)鎘脅迫的表達(dá)

對(duì)構(gòu)樹進(jìn)行CdCl2處理后，BpbHLH149基因在根、莖、葉中均被明顯誘導(dǎo)，且不同組織表達(dá)水平具有特異性。在根和莖中表達(dá)趨勢(shì)具有相似性，表達(dá)水平均隨處理時(shí)間先升高再降低，但表達(dá)水平強(qiáng)弱有差異，根的表達(dá)水平遠(yuǎn)大于莖的表達(dá)水平。在根中，BpbHLH149基因在12 h達(dá)到最高，為未脅迫時(shí)表達(dá)量的18.6倍；而在莖中，BpbHLH149基因在24 h達(dá)到最高，為未脅迫時(shí)表達(dá)量的7.1倍。葉中BpbHLH149基因表達(dá)趨勢(shì)與根和莖不同，是隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增強(qiáng)，在72 h達(dá)到最高，為未脅迫時(shí)基因表達(dá)量的5.9倍?？梢?，BpbHLH149基因在鎘脅迫下被誘導(dǎo)(圖4)。

A.與非冗余PDB結(jié)構(gòu)集比較；B.三維結(jié)構(gòu)模型。

2.3 INVSC1(pYES2-BpbHLH149)和INVSC1(pYES2)在鎘脅迫下的生長(zhǎng)

將pYES2-BpbHLH149轉(zhuǎn)入INVSC1，挑取9個(gè)單克隆用BpbHLH149-F/R進(jìn)行PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其中7個(gè)成功轉(zhuǎn)入BpbHLH149基因，對(duì)這7個(gè)株系中BpbHLH149基因的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其中的3號(hào)表達(dá)水平最高(圖5)，記為INVSC1(pYES2-BpbHLH149)。對(duì)INVSC1(pYES2-BpbHLH149)和INVSC1(pYES2)兩種酵母在相同條件下進(jìn)行不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的鎘脅迫處理，通過(guò)比較OD600值分析兩種酵母的抗鎘能力。結(jié)果顯示，隨著CdCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，兩種酵母的OD600值逐漸變小，但I(xiàn)NVSC1(pYES2-BpbHLH149)總是高于INVSC1(pYES2)，且CdCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6%、0.8%時(shí)差異極顯著(p<0.01)。表明BpbHLH149基因的表達(dá)顯著改善了酵母的抗鎘脅迫能力(表2)。

圖4 BpbHLH149基因在Cd處理下的表達(dá)水平

圖5 7個(gè)轉(zhuǎn)基因酵母株系中BpbHLH149基因的表達(dá)水平

表2 轉(zhuǎn)BpbHLH149基因酵母在鎘脅迫下的OD600

3 結(jié)論與討論

土壤生態(tài)系統(tǒng)的破壞，不僅導(dǎo)致農(nóng)作物的減產(chǎn)，而且通過(guò)食物鏈嚴(yán)重危害動(dòng)物和人體健康，因此必須采取有效方法對(duì)土壤重金屬污染進(jìn)行治理。土壤修復(fù)技術(shù)有物理、化學(xué)、生物等修復(fù)技術(shù)，其中的植物修復(fù)技術(shù)因具有修復(fù)面積廣、成本低廉、對(duì)土壤擾動(dòng)小、操作方便、管理簡(jiǎn)單、無(wú)二次污染等優(yōu)點(diǎn)，備受人們青睞[17]。對(duì)重金屬富集與超富集能力植物的鑒別與利用，為土壤修復(fù)開辟了新的途徑。構(gòu)樹適應(yīng)性強(qiáng)，耐旱、耐瘠，是我國(guó)重要的扶貧攻堅(jiān)樹種，因?qū)b、Zn、Pb、As、Cd、Cr等重金屬的富集能力和轉(zhuǎn)移能力較強(qiáng)，被認(rèn)為是礦區(qū)重金屬污染地生態(tài)修復(fù)與植被恢復(fù)較為理想的木本植物[18]。因此，掌握構(gòu)樹的抗逆適應(yīng)機(jī)制，特別是重金屬脅迫調(diào)控機(jī)制對(duì)深入了解構(gòu)樹適應(yīng)性及構(gòu)樹栽培管理具有重要指導(dǎo)作用。由于bHLH是植物中的一類超家族轉(zhuǎn)錄因子，成員眾多，功能豐富，本研究從構(gòu)樹中鑒定的1條bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因BpbHLH149，發(fā)現(xiàn)其與擬南芥bHLH的眾多成員具有較近的親緣關(guān)系(圖2)。目前，已有不少研究表明擬南芥bHLH轉(zhuǎn)錄因子與多種逆境脅迫調(diào)控相關(guān)。如，AtbHLH122受高鹽、干旱、滲透等多種脅迫誘導(dǎo)，使過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株具有更高的抗鹽、抗?jié)B透能力[10]；AtbHLH20通過(guò)多種激素調(diào)節(jié)途徑響應(yīng)外界脫水脅迫[19]；AtbHLH92在高鹽、干旱、低溫脅迫下的表達(dá)量呈現(xiàn)顯著上調(diào)趨勢(shì)，且部分依賴ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[20]；AtbHLH38、AtbHLH39通過(guò)增加植物根系對(duì)鎘的螯合作用，提高擬南芥對(duì)鎘的耐受性[21]。因此，我們初步推測(cè)BpbHLH149基因可能參與逆境響應(yīng)，并發(fā)揮重要作用。

為進(jìn)一步明確BpbHLH149基因是否響應(yīng)CdCl2脅迫，對(duì)構(gòu)樹進(jìn)行CdCl2處理，分析不同處理時(shí)間點(diǎn)該基因在根、莖、葉中的表達(dá)。結(jié)果顯示，BpbHLH149在根、莖、葉中均被明顯誘導(dǎo)，且具有一定的組織特異性(圖4)。這與其他一些物種的bHLH基因響應(yīng)重金屬脅迫的表達(dá)相似。如，蘆竹(Arundodonax)bHLH基因被鎘顯著誘導(dǎo)表達(dá)[22]；玉米(Zeamays)ZmbHLH105可被錳脅迫誘導(dǎo)[23]；鷹嘴豆(Cicerarietinum)bHLH家族蛋白可被鉻顯著誘導(dǎo)[24]。由于基因表達(dá)通?？捎行ьA(yù)測(cè)基因功能，如，核桃(Juglansregia)JrWRKY2、JrWRKY7發(fā)現(xiàn)在干旱等逆境下表達(dá)水平顯著提高[25]，后證實(shí)它們的過(guò)量表達(dá)可以提高轉(zhuǎn)基因植株的抗旱性[26-27]。因此，考慮到本研究中BpbHLH149響應(yīng)Cd脅迫的表達(dá)能力及其他相關(guān)基因表達(dá)情況與功能間的關(guān)系，我們進(jìn)一步認(rèn)為BpbHLH149是一個(gè)Cd響應(yīng)基因。

為明確BpbHLH149是否具備Cd響應(yīng)調(diào)控能力，將BpbHLH149基因轉(zhuǎn)入酵母，利用酵母表達(dá)系統(tǒng)驗(yàn)證其Cd響應(yīng)功能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)入BpbHLH149基因的酵母INVSC1(pYES2-BpbHLH149)在CdCl2脅迫下的生長(zhǎng)活性要顯著高于對(duì)照INVSC1(pYES2)。由于酵母表達(dá)系統(tǒng)繁殖快、操作簡(jiǎn)單，外源蛋白能夠被翻譯并修飾，因此被廣泛應(yīng)用于快速檢測(cè)基因抗逆功能的快速檢測(cè)。如，通過(guò)酵母表達(dá)系統(tǒng)證實(shí)檉柳(Tamarixchinensis)TheIF1A基因能有效提高轉(zhuǎn)基因酵母的抗干旱、鹽堿、氧化、重金屬及極端溫度的能力，認(rèn)為TheIF1A可能參與檉柳多種抗逆調(diào)控過(guò)程[28]。Yang et al.[29]將核桃JrWRKY6和JrWRKY53基因分別轉(zhuǎn)入酵母，通過(guò)鹽、高滲透和熱脅迫環(huán)境下的耐受性分析，發(fā)現(xiàn)JrWRKY6和JrWRKY53能夠積極響應(yīng)非生物脅迫。本研究Cd脅迫下的酵母活性被BpbHLH149基因的表達(dá)而顯著提高，這與TheIF1A、JrWRKY6、JrWRKY53等基因在酵母表達(dá)系統(tǒng)中改善抗逆能力的表現(xiàn)一致，表明BpbHLH149的表達(dá)能有效改善轉(zhuǎn)基因酵母的抗Cd能力，BpbHLH149可作為Cd響應(yīng)的候選基因。這為進(jìn)一步研究構(gòu)樹bHLH的抗逆機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

當(dāng)前，有關(guān)bHLH轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控植株抗逆調(diào)控的功能機(jī)制研究也取得了一定進(jìn)展，主要涉及脫落酸(ABA)、赤霉素(GA)等激素信號(hào)和活性氧(ROS)代謝及相關(guān)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)途徑。如，PEG模擬干旱、鹽和ABA誘導(dǎo)了小麥根和葉中TabHLH1表達(dá)；與野生型(WT)相比，TabHLH1過(guò)表達(dá)的煙草在干旱脅迫、鹽脅迫和外源ABA介導(dǎo)下的透液積累和細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)穩(wěn)態(tài)進(jìn)而有助于提高煙草對(duì)干旱和鹽脅迫的耐受性得到明顯改善[30]。擬南芥中AtbHLH112的轉(zhuǎn)錄水平與其耐鹽性和耐旱性呈正相關(guān)，通過(guò)增強(qiáng)P5CS基因的表達(dá)和降低P5CDH和ProDH基因的表達(dá)以增加其細(xì)胞內(nèi)脯氨酸水平來(lái)增強(qiáng)應(yīng)激耐受；AtbHLH112通過(guò)識(shí)別E-box和GCG-box增強(qiáng)對(duì)POD和SOD基因的表達(dá)，以提高ROS清除能力[31]。Cd脅迫下，F(xiàn)IT與AtbHLH38或AtbHLH39共同過(guò)表達(dá)可激活擬南芥中參與重金屬解毒的重金屬相關(guān)蛋白3(HMA3)、金屬耐受蛋白3(MTP3)等轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)，從而降低重金屬對(duì)植株的毒害作用[21]。那么，BpbHLH149在調(diào)控Cd等脅迫響應(yīng)中主要涉及哪些信號(hào)途徑，其調(diào)控機(jī)制是什么，是否與上述ABA、GA及ROS相關(guān)，這些問(wèn)題將是后續(xù)我們利用植物表達(dá)系統(tǒng)對(duì)BpbHLH149基因調(diào)控Cd脅迫響應(yīng)機(jī)制研究的關(guān)鍵內(nèi)容。