鄭毅 鄭笑 林樹燕 姚文靜 徐薪璐 周必鐃 卞麗麗

(南京林業(yè)大學，南京，210037)

翠竹(Pleioblastuspygmaeus(Miq.) E. G. Camus)為竹亞科大明竹屬植物，植株矮小，耐陰，葉片翠綠，且極耐修剪，是一種十分優(yōu)良的地被類觀賞植物。尤其近年來，地被類竹種以及彩葉竹種在園林綠化中的應用愈來愈廣泛，其經濟價值近年來也逐漸飆高[1-2]。但受到繁殖材料的獲得困難及繁殖方法的限制，傳統(tǒng)的繁育方式已無法滿足翠竹日益增大的市場需求，且園林用竹對植物的遺傳構成一致性和植株大小的一致性要求較高；所以構建高效的翠竹組培快繁再生體系勢在必行。

關于竹子的組織培養(yǎng)已取得了一些進展。自1982年起，國外相繼報道了印度箣竹、勃氏甜龍竹等數十個竹種的組織培養(yǎng)技術研究情況[3]。我國對竹子組織培養(yǎng)技術研究起步較晚，但經幾代科研工作者的不懈努力，目前麻竹[4-5]、甜龍竹[6]、巨龍竹[7]等重要經濟竹種的組培快繁技術，在生產中的應用已經十分成熟。但實際生產中，利用試管快繁技術進行批量繁殖的園林觀賞用竹并不多。由于竹類植物的花和種子不易穩(wěn)定地獲得，且除種胚外其余外植體類型都很難通過誘導愈傷分化獲得再生植株[8]，所以以單芽為外植體，誘導產生芽叢，經誘導生根后移至土壤，這種不經過脫分化過程直接獲得大量完整植株的繁殖方式應用更為廣泛。

鞭芽是竹子出筍成竹、長鞭形成地下根系結構的基礎。本研究以翠竹的鞭芽為試驗材料，嘗試構建翠竹組織培養(yǎng)快繁高效再生技術體系，為翠竹工廠化大規(guī)模生產和其園林應用推廣提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

2015年5月20日，將采于江蘇省南京市南京林業(yè)大學白馬基地竹種園(118°22′～119°14′E，31°14′～32°37′N)的翠竹(Pleioblastuspygmaeus(Miq.) E. G. Camus)種子播于花盆(上口內徑26 cm、內高22 cm、盆底內徑18 cm)中，培養(yǎng)基質選擇體積比為V(泥炭)∶V(黃棕壤)∶V(珍珠巖)=12∶12∶1的混合基質；定期進行觀察。2019年，將翠竹實生苗包括鞭根系統(tǒng)及基質整體取出，洗去泥土，選取翠竹竹鞭上帶有未萌動和剛萌動鞭芽的鞭段(約1.5 cm)作為外植體。

1.2 外植體的消毒及啟動培養(yǎng)

2019年5月，將盆栽實生苗取出，清水處理后，把竹鞭切分成1.5 cm長的帶芽鞭段，用洗潔精清洗后，用自來水不間斷沖洗24 h。隨后在超凈工作臺上進行消毒處理，選取體積分數為70%的酒精、體積分數為2.5%的NaClO溶液兩種消毒劑進行消毒。先用無菌水將鞭段沖洗3遍，之后在體積分數為70%的酒精中分別消毒處理30、60、90 s；用無菌水沖洗5遍后，再用體積分數為2.5%的NaClO溶液分別處理10、15、20 min。兩種消毒劑各設3個處理水平，共9個處理組合，每個組合接種50瓶；處理時上下搖動，最后再用無菌水沖洗5遍，完成外植體的消毒。

本研究選擇MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中蔗糖質量濃度控制在30 g·L-1，pH控制在5.75～5.85之間。將消毒完畢的鞭芽，接種到誘導培養(yǎng)基“MS培養(yǎng)基+質量濃度為0.1 mg·L-1的噻苯隆(TDZ)+質量濃度為0.5 mg·L-1的萘乙酸(NAA)”上，每瓶1個；之后，將培養(yǎng)瓶置于無菌培養(yǎng)室中培養(yǎng)觀察，每天12～14 h的光照，光照強度1 200～1 500 lx，培養(yǎng)室溫度控制在25 ℃，試驗重復3次；20 d后統(tǒng)計污染率及誘導成活率，污染率=(污染外植體數/接種外植體總數)×100%、成活率=(萌芽外植體數/接種后無菌莖段總數)×100%。

1.3 無菌翠竹鞭芽增殖培養(yǎng)

以鞭芽為外植體的瓶苗需要經增殖培養(yǎng)基的處理才能產生芽叢，待瓶苗誘導培養(yǎng)20 d，取成活且無菌的組培苗，將其接種在增殖培養(yǎng)基上。增殖培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基仍選用MS培養(yǎng)基，生長調節(jié)劑則選用6-芐氨基腺嘌呤(6-BA，質量濃度為3、4、5 mg·L-1)與萘乙酸(質量濃度為0.05、0.30、0.50 mg·L-1)，共9種處理，每個處理接種30瓶，每瓶接種1個無菌芽段。培養(yǎng)30 d觀察增殖情況，統(tǒng)計每瓶內的叢芽增殖系數，增殖系數=擴繁后的芽數/轉入的芽數。

1.4 翠竹叢芽的生根培養(yǎng)

將增殖后的芽苗繼代培養(yǎng)3～5次，待叢芽增殖到20～30個時，將叢芽接種到生根培養(yǎng)基上。生根培養(yǎng)基選用0.5倍MS培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基，以6-芐氨基腺嘌呤(質量濃度為0、0.5、1.0 mg·L-1)、萘乙酸(質量濃度為1.0、1.5 mg·L-1)、吲哚丁酸(IBA，質量濃度為0.5、1.0 mg·L-1)3種生長調節(jié)劑設置12個處理組合，每個組合接種30瓶。40 d后觀察統(tǒng)計生根數、根長并計算生根率，生根率=(生根叢苗數/接入的總苗數)×100%。

1.5 翠竹瓶苗煉苗移栽

生根后，對翠竹瓶苗進行煉苗移栽。為保持瓶內濕度，塑料袋罩住去蓋的培養(yǎng)瓶，將培養(yǎng)瓶揭蓋置于培養(yǎng)室中煉苗15 d；取出組培苗，洗去培養(yǎng)基，移栽至基質中，定期澆水。設置3種培養(yǎng)基質，基質體積比分別為V(壤土)∶V(蛭石)=1∶1、V(蛭石)∶V(草炭)=1∶1、V(壤土)∶V(蛭石)∶V(草炭)=1∶1∶1，每種基質栽種50株組培苗，觀察植株生長情況并統(tǒng)計移栽成活率。

1.6 數據處理

采用SPSS22.0統(tǒng)計分析軟件進行顯著性分析及多重比較。

2 結果與分析

2.1 不同消毒方案對污染率及成活率的影響

在洗潔精清洗、流水沖洗的基礎上，本研究選用了體積分數為70%的酒精與體積分數為2.5%的NaClO溶液兩種消毒劑搭配使用。

試驗結果表明(見表1)：處理1的污染率最高，為94.00%；處理8、處理9的污染率最低，為4.67%、6.67%；說明體積分數為70%的酒精與體積分數為2.5%的NaClO溶液的消毒劑組合，可以有效地殺死大部分微生物，且隨著處理時間的增長，污染率逐步降低。從外植體成活率看，對于酒精處理而言，處理90 s的平均成活率最低(為47.50%)，處理60 s的平均成活率最高(高達87.05%)；對于NaClO處理而言，處理20 min的平均成活率最低(為57.30%)，處理15 min的平均成活率最高(為69.15%)。這說明，雖然長時間處理的殺菌效果更好，但過長的消毒時間會導致芽段成活率較低，這與本研究的消毒目的相悖。這是由于鞭芽的芽組織十分幼嫩，酒精的過長時間處理影響了其生長活性，消滅微生物的同時也殺死了外植體材料。

表1 不同消毒方案的啟動培養(yǎng)污染率及成活率

綜合污染率、成活率兩項指標看，最佳消毒方案為“體積分數為70%的酒精處理60 s+體積分數為2.5%的NaClO溶液處理15 min”，這樣的組合，既有著不錯的滅菌效果，且不會對芽的活性造成影響，有著較好的成活表現。

2.2 萘乙酸與6-芐氨基腺嘌呤對叢芽繼代增殖的影響

不同組合的植物生長調節(jié)劑處理對芽叢增殖的效果不同(見表2)。由表2可見：對于6-芐氨基腺嘌呤而言，隨著其質量濃度從3 mg·L-1提高到5 mg·L-1，增殖系數也從2.99提高到了5.91，芽叢長勢也在逐漸提高。對萘乙酸而言，質量濃度為0.05 mg·L-1時，增殖系數最小，增殖效果也較差；質量濃度為0.30 mg·L-1時，增殖系數最高，芽叢增殖效果最好；質量濃度為0.50 mg·L-1時，芽段仍正常生長，芽叢長勢也較好，但新生苗叢芽較少，增殖系數也相對較低。可見，隨著細胞分裂素6-芐氨基腺嘌呤的質量濃度提高，芽叢的增殖效果越來越佳，6-芐氨基腺嘌呤質量濃度為5 mg·L-1時，增殖效果最好。而培養(yǎng)基中生長素萘乙酸的質量濃度過低時，芽叢的生長狀況不佳，增殖效果也較差，隨著萘乙酸質量濃度的提高，芽叢的長勢逐漸變好，增殖系數也隨之提高，但隨著萘乙酸質量濃度的繼續(xù)升高，芽苗高度越長越高，新生叢苗卻沒有隨之增多。結果表明，當6-芐氨基腺嘌呤質量濃度為5 mg·L-1、萘乙酸質量濃度為0.3 mg·L-1時，翠竹芽段的增殖系數最高(為7.24)、新生芽叢數最多，且長勢健壯、葉片寬大、顏色翠綠，增殖效果最好。

表2 不同植物生長調節(jié)劑配比時翠竹芽段的增殖狀況

經鄧肯(Duncan)多重比較，不同植物生長調節(jié)劑處理組合對芽段增殖系數的影響，不同處理組合之間表現不同：處理8為最高組；處理9低于處理8，而顯著高于其他組，為次高組；處理1顯著低于其他組，為最低組。說明不同植物生長調節(jié)劑配比對翠竹增殖的影響差異顯著，處理8效果最好，處理1效果最差。綜合效果，翠竹芽段最佳增殖培養(yǎng)基為“MS培養(yǎng)基+質量濃度為5 mg·L-1的6-芐氨基腺嘌呤+質量濃度為0.30 mg·L-1的萘乙酸”。

2.3 不同植物生長調節(jié)劑配比對翠竹生根的影響

在叢苗多次繼代后進行生根誘導，生根培養(yǎng)培養(yǎng)基選用0.5倍MS培養(yǎng)基，設置12個不同的植物生長調節(jié)劑組合(見表3)，不同處理間生根率差異較大，處理4、處理6、處理11誘導生根效果較好，生根率分別達到了100%、85%、90%。

表3 不同植物生長調節(jié)劑配比處理的翠竹芽段生根率

2.3.1 翠竹生根誘導過程中的形態(tài)觀察

以處理4為例，培養(yǎng)7 d時，開始有根出現(見圖1a)；培養(yǎng)14 d時，根持續(xù)伸長，根數逐漸增多(見圖1b)；培養(yǎng)35 d時，植株的根系已十分繁盛(見圖1c)，生根數逐漸穩(wěn)定，增長速度放緩；培養(yǎng)42 d時，植株的根繼續(xù)伸長(見圖1d)；培養(yǎng)49 d時，根系都已達到煉苗栽種要求(見圖1e、f)。

2.3.2不同植物生長調節(jié)劑配比對翠竹生根數量的影響

以生根率較高的3個處理(處理4、處理6、處理11)為研究對象，對這3個處理中瓶苗的根，按生長長度(L)進行分級，具體分成010 cm的4個級別，分別統(tǒng)計每級內的根數及總根數，并計算每個時期的平均根長。每隔1周進行1次統(tǒng)計，共統(tǒng)計7次。

a為培養(yǎng)7 d時，翠竹組培苗不定根出現；b為培養(yǎng)14 d時，根進一步伸長；c為培養(yǎng)35 d時，根系逐漸增多；d為培養(yǎng)42 d時，根系繼續(xù)伸長；e、f為培養(yǎng)49 d時，根系已經非常繁茂。

統(tǒng)計其平均生根數隨時間的變化規(guī)律(見圖2)。由圖2可見：處理4生根最早，在0～7 d階段已誘導出根，隨后不斷有新根產生；且在7～14 d階段內根數增長速度較快，增幅較大；培養(yǎng)21 d后，其增長趨勢逐漸平緩，每個階段的增幅也較小。處理6生根最晚，在28～35 d階段才有根生出，此階段根數增長速度同樣最快，7 d內有約30條新根產生。處理11生根也較晚，在21～28 d時才有根產生，此階段也同樣是處理11生根數增長速度最快的時期；在此之后，雖然其根數增長速度有所放緩，但每階段都能保持5條以上的增幅；在49 d時，處理11的平均生根數為50.5條，超過了處理4的48.83條。綜上所述，從誘導生根的速度看，處理4最早誘導出根，處理6、處理11則出根較晚。從誘導出根后根數的增長速度看，處理4在誘導出根后，經42 d根數才增長至46條左右，增長速度較為平緩；而處理11在出根后，僅用21 d根數便增長至相同水平，增長速度極快；處理6在相同時間21 d內，其根數也僅增長至42條；可見，處理11在誘導出根后，其平均生根數增長速度最快。

圖2 3種處理的翠竹組培苗平均生根數

2.3.3不同植物生長調節(jié)劑配比對翠竹不同根長范圍內平均生根數量及平均根長的影響

由表4可見：各個階段內不同根長(L)級別的占比不同。處理4，010 cm的根出現。處理6、處理11，在生根后僅2周，2 cm10 cm的根數也在迅速增多。

移栽前進行的第7次統(tǒng)計結果表明，在對3種不同的植物生長調節(jié)劑組合處理進行誘導生根培養(yǎng)49 d后，處理4的平均生根數為48.83條，其中，010 cm的有1條(占2.40%)；處理6的平均生根數為41條，其中，010 cm的有1條(占3.66%)；處理11的平均生根數為50條，其中，010 cm的有3條(占7.64%)。結果表明，在同樣培養(yǎng)49 d后，處理11中，2 cm10 cm級別的根數都高于其他處理組。

由表4可見：3種處理平均根長的變化，處理4的平均根長增長速度最慢；處理6的平均根長增長速度最快，但其根數相對較少；處理11的平均根長增長速度較快，其根數也足夠多，且在49 d的生根培養(yǎng)過程中，處理11平均根長的峰值最高，可見其根系質量最好。

表4 3種植物生長調節(jié)劑組合施用時翠竹不同根長范圍內的平均生根數量及根平均長度

由以上結果分析可得，處理11有著較高的生根率，其平均生根數的增長速度最快，平均根長的增長速度也較快，培養(yǎng)結束后，其平均根長也最長。綜上所述，翠竹叢苗最佳生根培養(yǎng)基為“0.5倍的MS培養(yǎng)基+質量濃度為1 mg·L-1的6-芐氨基腺嘌呤+質量濃度為1.5 mg·L-1的萘乙酸+質量濃度為0.5 mg·L-1的吲哚丁酸”。

2.4 不同基質對移栽翠竹叢苗成活率的影響

煉苗后的翠竹叢苗移栽到3種基質中后，做好水分管理，每日噴水2次，2周后統(tǒng)計3種基質中叢苗的移栽成活率(見圖3)。體積比為V(壤土)∶V(蛭石)=1∶1的基質移栽成活率為100%，體積比為V(蛭石)∶V(草炭)=1∶1的基質移栽成活率為85%，體積比為V(壤土)∶V(蛭石)∶V(草炭)=1∶1∶1的基質移栽成活率為95%，說明將煉苗后的瓶苗移栽到體積比為V(壤土)∶V(蛭石)=1∶1的基質中，成活效果最好。

a為無菌翠竹鞭芽萌發(fā)；b為叢芽誘導；c為叢芽增殖；d為生根培養(yǎng)；e為煉苗結束，移栽前的組培再生苗；f為盆栽組培苗。

3 結論與討論

20世紀80年代，翠竹作為優(yōu)質觀賞竹種被引入南京林業(yè)大學竹種園。但由于竹子體內內生菌較多，組培污染率較高，其脫分化、再分化過程也較為困難，近30 a內僅有張春霞等[9]以翠竹幼竹莖段為外植體進行了組培快繁研究。目前仍無以翠竹鞭芽為外植體構建組培快繁體系的報道。

對于組培而言，無菌環(huán)境是其成功的關鍵，合適的外植體消毒方案十分重要。對于不同的外植體選取部位而言，其最適消毒方案間存在著較大差異。如王舒[10]認為，“體積分數為75%的酒精處理25 s+質量分數為0.1%的HgCl2溶液處理5.3 min”的消毒方案，對黃甜竹稈芽側芽的消毒效果最好。王曙光等[11]將慈竹半木質化枝條用體積分數為70%的酒精擦拭1遍，質量分數為0.1%的升汞溶液消毒2次，每次12 min的效果最好。由于選用的外植體是帶有節(jié)的地下鞭段，與其他植物和竹類其他取材部位相比，地下鞭芽節(jié)大且堅韌，鞭芽被堅實的籜片包被，一定程度上影響了消毒液的殺菌效果。本研究表明，對翠竹鞭芽用體積分數為70%的酒精浸泡處理60 s，再用體積分數為2.5%的NaClO溶液處理15 min的消毒效果最佳。在試驗過程中還發(fā)現，翠竹鞭芽內生菌的潛伏期十分長，甚至在結束啟動培養(yǎng)進行增殖培養(yǎng)時仍發(fā)現有新的內生菌污染的情況發(fā)生。

生長調節(jié)劑對植物組織培養(yǎng)而言意義重大，其種類的選擇及濃度配比是調控組培苗生長的主要途徑。本研究結果表明，在增殖培養(yǎng)階段，翠竹鞭芽最佳增殖培養(yǎng)基為“MS培養(yǎng)基+質量濃度為5 mg·L-1的6-芐氨基腺嘌呤+質量濃度為0.30 mg·L-1的萘乙酸”，且發(fā)現在一定范圍內，增殖系數隨著6-芐氨基腺嘌呤質量濃度的增加而增大，適量的生長素萘乙酸有助于芽苗保持生長活性，促進增殖，但過高的萘乙酸質量濃度會使芽苗轉向增高生長，減緩增殖新芽的速度，這說明高質量濃度的萘乙酸對苗高增高有益，但同時會抑制新芽產生。

芽叢誘導生根是竹類植物快繁體系構建中的難題，傳統(tǒng)植物誘導生根只需進行生長素處理，但竹類植物不同，且不同竹種對生根培養(yǎng)基的要求差異巨大，需要通過改變植物生長調節(jié)劑的組合不斷進行嘗試。本研究表明，翠竹鞭芽叢苗最佳生根培養(yǎng)基為“0.5倍的MS培養(yǎng)基+質量濃度為1 mg·L-1的6-芐氨基腺嘌呤+質量濃度為1.5 mg·L-1的萘乙酸+質量濃度為0.5 mg·L-1的吲哚丁酸”。雖然配方“0.5倍的MS培養(yǎng)基+質量濃度為1.5 mg·L-1的萘乙酸+質量濃度為1 mg·L-1的吲哚丁酸”生根最早，生根率較高，但其在誘導出根后，新根的增長速度和伸長速度都沒有前者高。這是因為早期在僅有萘乙酸、吲哚丁酸2種生長素的作用下，芽苗只進行生根活動，不進行芽苗的生長，所以出根最早。但在長期的生根培養(yǎng)過程中，芽苗本身出現了老化，上部生長的停滯使得生根速度也受到了一定影響。加入了細胞分裂素6-芐氨基腺嘌呤后，雖然早期需要進行一段時間的苗生長，但開始進行生根生長時，健壯的芽苗既可以穩(wěn)定其本身的長勢，也可以為生根活動提供一定的增益效果。王光萍等[12]研究表明，在誘導錦竹生根時，單一的生長素處理生根率較低，且很容易導致褐化，損傷植株，加入6-芐氨基腺嘌呤后該情況有所緩解。

前期翠竹的組培已有報道[9]，文中外植體材料采用的是翠竹莖段。而在本研究中考慮到翠竹的生物學特性，其竹鞭系統(tǒng)發(fā)達，材料充足，因而在本研究中改用鞭芽作為外植體材料，確保在外植體采集過程中不受到季節(jié)的限制。此外本研究詳細研究了不同植物生長調節(jié)劑組合對翠竹組培苗生根的影響，優(yōu)化了生根培養(yǎng)基配方。本研究對翠竹的再生體系進行了系統(tǒng)性的研究，可為后續(xù)其他竹種的再生體系建立提供參考。