范香媛，張金成，胡永紅*

(1.河北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 石家莊 050024；2.石家莊郵電職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河北 石家莊 050021)

蜱是專性吸血體外寄生蟲，是僅次于蚊子的世界第二大傳播疾病媒介，可以將多種病原體(細菌、病毒、真菌、原生動物等)傳播給宿主，但因其存在先天性免疫，在受到病原體感染后不影響自身的生存和發(fā)育[1-2]。蜱的先天免疫是受到病原體侵染后激活的，盡管蜱-病原體之間已共存進化了3億多年，但很少有微生物能克服蜱的先天性免疫系統(tǒng)[3-4]。

與同時具備先天性免疫和獲得性免疫的脊椎動物不同，由于缺乏淋巴細胞、胸腺和抗體，蜱只具備先天免疫[5]。蜱的先天免疫包括細胞免疫和體液免疫，兩者協(xié)同作用。細胞免疫包括吞噬、結(jié)節(jié)化或包裹入侵微生物的作用，由含硫酯蛋白質(zhì)(thioester-containing proteins,TEPs)、纖維蛋白原相關(guān)凝集素和轉(zhuǎn)化酶因子組成的原始補體系統(tǒng)所調(diào)節(jié)[6]；體液免疫主要包括抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)，例如防御素和溶菌酶，這些肽直接殺死、誘捕或抑制入侵者。此外，蜱還表達凝集素、蛋白酶抑制劑以及氧化應(yīng)激蛋白，如谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione-S-transferase，GST)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)來殺死或抑制微生物[7]。因此，了解蜱的先天免疫，掌握蜱-病原體之間的免疫學(xué)，以期為篩選新的抗蜱疫苗靶點提供理論依據(jù)。

1 蜱中腸免疫

中腸免疫對蜱作為傳播媒介的能力有決定性影響，其腸道內(nèi)容物會對入侵的微生物產(chǎn)生不利影響，主要原因為中腸內(nèi)存在的宿主血紅蛋白片段以及AMPs具有抗菌活性，能夠防御革蘭陽性菌、革蘭陰性菌和一些真菌[8]。具有抗菌活性的血紅蛋白片段最早從微小扇頭蜱(Rhipicephalusmicroplus) 中腸分離，后在其他軟蜱、硬蜱物種中腸內(nèi)也鑒定到[9-10]。例如，墨巴鈍緣蜱(Ornithodorosmoubata) 中腸腔內(nèi)的兔血紅蛋白片段，具有抗金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus) 活性[11]。

產(chǎn)吲哚金黃桿菌(Chryseobacteriumindologenes) 侵染墨巴鈍緣蜱時，蜱中腸至少分泌2種抗菌化合物來保護自身，包括防御素和溶菌酶[12]。塞氏鈍緣蜱(Ornithodorossavignyi) 中腸內(nèi)存在一種22個氨基酸組成的防御素，其能殺滅革蘭陽性菌和革蘭陰性菌[13]。據(jù)報道，一種名為longicin的防御素分子在長角血蜱(Haemaphysalislongicornis) 中腸表達，其對多種微生物具有抗菌活性，包括革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、真菌和各種巴貝斯蟲[14]。TGL (tick gut lysozyme)是從墨巴鈍緣蜱中腸分離出的第一個溶菌酶，其可水解革蘭陽性菌細胞壁肽聚糖中N-乙酰胞壁酸與N-乙酰氨基葡萄糖之間的1，4-β-糖苷鍵，具有殺菌作用[15]。

此外，當嗜吞噬細胞無形體(Anaplasmaphagocytophilum) 入侵微小扇頭蜱時，蜱體內(nèi)GST和SOD基因表達上調(diào)，沉默該基因有利于嗜吞噬細胞無形體的生存和繁殖，表明GST和SOD可影響嗜吞噬細胞無形體對蜱的侵染[16]。牛巴貝斯蟲(Bovinebabesiosis) 體外培養(yǎng)試驗證明，培養(yǎng)基中半胱氨酸蛋白酶抑制劑濃度越高，牛巴貝斯蟲的生長越緩慢，表明微小扇頭蜱半胱氨酸蛋白酶抑制劑能抑制牛巴貝斯蟲的生長[17]。

2 蜱血淋巴免疫

2.1 細胞免疫

2.1.1蜱血細胞 病原體從蜱中腸到外周組織過程中，面臨著細胞和體液免疫的雙重防御屏障。蜱類血淋巴內(nèi)的先天性免疫主要與細胞和體液免疫有關(guān)。根據(jù)不同蜱種血淋巴細胞的形態(tài)和生理研究，鑒定描述了4種基本類型的蜱血細胞，即原血細胞，漿細胞，粒細胞和小球細胞，其中粒細胞又分為粒細胞Ⅰ和粒細胞Ⅱ[18]。免疫組化電鏡結(jié)果顯示，漿細胞和粒細胞Ⅰ中有溶酶體，表現(xiàn)出較強的溶菌活性[19]。將伯氏疏螺旋體(Borreliaburgdorferi)注射進變異革蜱(Dermacentorvariabili) 雌蜱體腔，24 h后免疫熒光檢測血淋巴、唾液腺和卵巢，均未發(fā)現(xiàn)伯氏疏螺旋體，推測其被血細胞吞噬清除[20]。將產(chǎn)吲哚金黃桿菌感染篦子硬蜱(Ixodesricinus) 和墨巴鈍緣蜱，熒光顯微鏡檢測發(fā)現(xiàn)，2種蜱的血細胞對產(chǎn)吲哚金黃桿菌均有明顯吞噬作用[21]。相比之下，蜱血細胞對革蘭陰性菌大腸桿菌(Escherichiacoli) 的抑制作用是通過一種非黑色素封裝的形式，即血細胞在細菌周圍聚集，從而將其隔離并最終消化，此過程稱為結(jié)節(jié)化。而體積太大不能被吞噬或結(jié)節(jié)化破壞的病原體，如寄生蟲和線蟲，蜱血細胞可通過包裹來消除[22]。

2.1.2原始補體系統(tǒng) 蜱血細胞對微生物的吞噬作用與一個原始補體系統(tǒng)相關(guān)。蜱具有原始的補體系統(tǒng)，包括TEPs、纖維蛋白原相關(guān)凝集素和轉(zhuǎn)化酶因子[23]。α2-巨球蛋白家族屬于TEPs，是進化上最古老、最保守的天然免疫成分。墨巴鈍緣蜱中分離的α2-巨球蛋是蜱類中描述的第1種TEPs，隨后在蓖子硬蜱中也分離出α2-巨球蛋白。通過RNAi技術(shù)沉默蓖子硬蜱血淋巴中α2-巨球蛋白，可顯著降低蜱血細胞對產(chǎn)吲哚金黃桿菌的吞噬作用，表明α2-巨球蛋白參與了蜱血細胞對產(chǎn)吲哚金黃桿菌的吞噬[24]。纖維蛋白原相關(guān)凝集素是一種模式識別受體，與入侵微生物表面存在的病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)相互作用，被認為是蜱血淋巴內(nèi)自我與非自我識別的關(guān)鍵。通過RNAi沉默蓖子硬蜱凝集素基因ixoderins，再將蜱血淋巴加到含大腸桿菌或白色念珠菌(Canidiaalbicans)培養(yǎng)基中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沉默ixoderins顯著降低蜱血細胞對兩種菌的吞噬作用，表明ixoderins介導(dǎo)了蜱血細胞對大腸桿菌和白色念珠菌的吞噬[25]。

2.2 體液免疫

2.2.1抗菌肽 蜱血淋巴中還存在多種類型的體液因子，它們是體液免疫反應(yīng)的分子基礎(chǔ)。蜱類可通過這些體液因子保護自己免受微生物感染，其包括防御素、溶菌酶、凝集素以及一些蛋白酶抑制劑等，而蜱類防御素的報道最常見。防御素主要通過與入侵微生物的細胞壁或細胞膜結(jié)合，破壞其結(jié)構(gòu)或膜電位，最終殺死靶細胞。希伯來花蜱(Amblyommahebraeum)血淋巴中存在兩種非陽離子防御素，體外抑菌試驗表明，它們對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有抗菌活性[26]。此外，美洲花蜱(Amblyommaamericanum) 、蓖子硬蜱、微小扇頭蜱、森林革蜱(Dermacentorsilvarum) 和墨巴鈍緣蜱中都已鑒定出防御素的存在。變異革蜱侵染大腸桿菌試驗結(jié)果顯示，蜱血淋巴中c型溶菌酶表達水平升高，表明c型溶菌酶參與了蜱對大腸桿菌的先天免疫防御[27]。

2.2.2凝集素 凝集素是含有特異性單聚糖或低聚糖結(jié)合位點的蛋白質(zhì)或糖蛋白，可特異性地識別并結(jié)合細菌、真菌細胞壁或細胞膜上的碳水化合物分子,特別是唾液酸和N-乙酰-D-葡萄糖胺[29]。這種特異性結(jié)合用于識別革蘭陰性細菌。此外，凝集素可誘導(dǎo)細菌凝集；也可作為受體識別微生物，增強血細胞對微生物的吞噬作用[29]。Dorin M是從墨巴鈍緣蜱血淋巴中純化的第1個蜱凝集素，是一種糖蛋白，相對分子質(zhì)量約640 kDa。其在血細胞中合成并分泌到血淋巴中，可作為模式識別分子發(fā)揮作用，參與蜱的先天免疫[30]。

2.2.3蛋白酶抑制劑 微小扇頭蜱血細胞中的絲氨酸蛋白酶抑制劑也表現(xiàn)出較強的抗菌活性，推測是通過抑制病原體中絲氨酸蛋白酶活性引起的級聯(lián)反應(yīng)，但其抗菌活性的分子機制尚不清楚[31]。

3 蜱唾液腺免疫

蜱類唾液腺的主要功能是濃縮血液中營養(yǎng)物質(zhì)并分泌具有藥理活性的分子，同時將多余水分和離子返回宿主體內(nèi)。蜱經(jīng)唾液將病原體傳播給宿主，這是蜱源性病原體傳播的最常見途徑[32]。因此，蜱類唾液腺和唾液在調(diào)節(jié)蜱-病原體-宿主界面的免疫反應(yīng)中起著不可或缺的作用。

但已發(fā)現(xiàn)的唾液中對病原體有防御作用的因子尚少。隨著硬蜱和軟蜱唾液腺轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)量的增加，有研究發(fā)現(xiàn)蜱唾液腺組織中有多種AMPs的表達，例如防御素和溶菌酶[33-35]。Ixosin-B是從中華硬蜱(Ixodessinensis) 唾液腺純化出的防御素，其對細菌和真菌均具有抗菌活性[36]。長角血蜱唾液腺中一種名為longicornisin的防御素樣肽,相對分子質(zhì)量約為10 kDa，其對幽門螺旋桿菌(Helicobacterpylori)和真菌也具有較強的抑菌活性[37]。長角血蜱在被金黃色葡萄球菌或大腸桿菌侵染后，唾液腺中的溶菌酶基因轉(zhuǎn)錄水平升高，表明該溶菌酶參與了長角血蜱對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的先天免疫防御[38]。

凝集素OMFREP和Ixoderin B分別在墨巴鈍緣蜱和蓖子硬蜱的唾液腺中被檢測到，與鱟凝集素序列相似，推測其與先天免疫有關(guān)[39]。鈍刺血蜱(Haemaphysalisdoenitzi)絲氨酸蛋白酶抑制劑(serine protease inhibitor，HDS)HDS1和HDS2的抗菌活性實驗表明，其重組蛋白rHDS1和rHDS2對細菌和真菌都具有一定的抑制活性，且rHDS1對白色念珠菌的殺菌作用最強，rHDS2對新生隱球菌(Cryptococcusneoformans) 具有最強的殺菌作用[40]。然而，這些唾液腺AMPs是否分泌到蜱唾液或血淋巴中，以及是否與病原體直接相互作用，仍未得到證實。

4 蜱的免疫調(diào)控

蜱的免疫系統(tǒng)通過多種調(diào)控機制來抵御病原體入侵。昆蟲體內(nèi)調(diào)節(jié)先天性免疫的信號通路分別是Toll、IMD(immunodeficiency)、JAK-STAT(janus kinase/signal transducers and activators of transcription),這3條通路在信號傳遞過程中協(xié)同作用[41]。與昆蟲相似，蜱類也存在調(diào)節(jié)先天免疫反應(yīng)的信號通路[42]。硬蜱基因組分析表明，蜱體內(nèi)含有Toll、IMD、JAK-STAT免疫通路的大多數(shù)成分，且經(jīng)典免疫的相關(guān)基因和途徑存在顯著多樣性[9]。模式識別受體(pattern recognition receptors，PRRs)對微生物表面PAMPs的識別能夠觸發(fā)特定免疫信號通路。

4.1 Toll信號通路在昆蟲中，肽聚糖識別受體蛋白(peptidoglycan recognition receptor proteins,PGRPs)可識別革蘭陽性菌細胞壁的賴氨酸型肽聚糖；革蘭陰性結(jié)合蛋白(gram-negative binding proteins,GNBPs)可識別真菌的β-1,3-葡聚糖[43]。PGRPs或GNBPs可與PAMPs結(jié)合導(dǎo)致細胞外ModSP和Grass的激活。Spz被裂解并與Toll受體結(jié)合，接著Toll受體與Myd88二聚體結(jié)合并激活與蛋白激酶Pelle相互作用的適配分子Tube，使Cactus被磷酸化后降解，導(dǎo)致Diff和Dorsal基因上調(diào)，最終調(diào)控AMPs的表達[44]。蜱與昆蟲比較，其Toll通路含有除GNBPs和Diff之外的所有關(guān)鍵基因，提示蜱中存在Toll信號通路，且在先天免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

4.2 IMD信號通路革蘭陰性菌細胞壁成分二氨基庚二酸型肽聚糖可與果蠅細胞內(nèi)或跨膜肽聚糖識別蛋白結(jié)合，激活I(lǐng)MD信號通路并觸發(fā)特異性AMPs的合成[45]。在蜱中未發(fā)現(xiàn)IMD途徑中的幾個關(guān)鍵成分，如跨膜PGRPs、IMD、dFADD等，但XIAP (X-linked inhibitor of apoptosis)可直接與Bendless結(jié)合調(diào)控蜱體內(nèi)IMD途徑，激活蛋白TAB2、TAK1、IKKγ和IKKβ，并磷酸化Relish，誘導(dǎo)AMPs的轉(zhuǎn)錄生成[44]。研究表明，細菌感染微小扇頭蜱時，IMD通路tak1、tab2、ikkγ、ikkβ等基因轉(zhuǎn)錄上調(diào)[46]。這些研究為深入研究蜱類IMD途徑提供依據(jù)。

圖1 果蠅與蜱中Toll通路比較[44]

圖2 果蠅與蜱中IMD通路比較[44]

4.3 JAK-STAT信號通路JAK-STAT信號通路可能參與昆蟲的抗病毒免疫應(yīng)答，該途徑不是由病毒配體直接引起的，而是由細胞感染過程中釋放的細胞因子所誘導(dǎo)[47]。JAK-STAT途徑所有下游成分在微小扇頭蜱和肩突硬蜱基因組中被檢測出來，包括跨膜細胞因子受體Domeless、酪氨酸激酶JAK、轉(zhuǎn)錄因子STAT、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)適配分子STAM、抑制劑蛋白PIAS和細胞因子信號傳導(dǎo)抑制劑SOCS[46]。研究發(fā)現(xiàn)，肩突硬蜱 (Ixodesscapularis)中一類編碼5.3 kDa AMPs家族的基因表達直接受到STAT轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，該基因在嗜吞噬細胞無形體感染蜱過程中顯著上調(diào)。用RNAi干擾JAK-STAT信號通路后，嗜吞噬細胞無形體在蜱唾液腺和血淋巴中的感染水平顯著升高。結(jié)果表明，蜱類通過JAK-STAT信號通路調(diào)控這一類AMPs基因的表達，以抑制嗜吞噬細胞無形體的感染[48]。

5 總結(jié)與展望

蜱的媒介能力與其免疫系統(tǒng)密切相關(guān)，但我們對蜱先天免疫的總體認知遠遠落后于昆蟲。蜱與昆蟲先天免疫反應(yīng)機制具有一定的相似性，因而可通過分子生物學(xué)、免疫學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等研究，促進蜱先天免疫的研究。隨著多種蜱基因組的公布以及RNAi技術(shù)干擾蜱的可行性，有助于闡明蜱體內(nèi)先天免疫反應(yīng)的分子機制以及各分子在先天免疫中的調(diào)控作用[49]。此外，全面了解蜱類先天免疫，找到其免疫信號通路及免疫反應(yīng)中關(guān)鍵基因，為篩選新的靶標位點，有效防控蜱及蜱媒疾病提供科學(xué)依據(jù)。