梁艷艷，李 可，賈 麗，侯銘源，田夢悅，張 婷，馬玉忠

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071001)

近年來，犢牛腹瀉的發(fā)病率呈明顯上升趨勢。引起犢牛腹瀉的病因很多，其中大腸桿菌所致的腹瀉多發(fā)，常引起犢牛的消化不良、腹瀉、脫水，重者引起死亡。該病的發(fā)生給養(yǎng)牛業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失[1]。目前，治療犢牛腹瀉大腸桿菌病主要以抗生素為主，但抗生素的不合理使用導(dǎo)致大腸桿菌耐藥性的產(chǎn)生，給該病的防治造成了一定困難[2]。為了有效預(yù)防和控制犢牛腹瀉大腸桿菌病，本試驗采集保定市某牛場36頭腹瀉犢牛的新鮮糞樣，通過病原體分離鑒定及分離株的致病性和耐藥性檢測，并對其進行治療試驗，旨在為犢牛大腸桿菌性腹瀉的治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采自保定市某牛場36頭40～50日齡腹瀉犢牛的新鮮糞樣。

1.2 主要試劑麥康凱瓊脂、伊紅美藍瓊脂、普通瓊脂、普通肉湯等培養(yǎng)基，細菌生化微量反應(yīng)管，藥敏片均購自杭州濱和微生物試劑有限公司。DL2000 DNA Marker購自中科瑞泰科技公司。2×Taq Master Mix購自康為世紀生物公司。新霉素可溶性粉購自天津天農(nóng)大生物科技公司，白頭翁散購自河南普旺生物工程公司。

1.3 細菌分離培養(yǎng)將無菌采取的糞樣用三線法接種于普通瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24 h后，挑取菌落，革蘭染色，鏡檢。

1.4 分離菌培養(yǎng)特性挑選單個疑似大腸桿菌菌落,接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24 h；挑取單個紅色菌落接種到伊紅美藍培養(yǎng)基上，再次培養(yǎng)后，染色鏡檢。

1.5 分離菌生化試驗將25株分離菌進行生化鑒定，觀察并記錄試驗結(jié)果。

1.6 分離菌16S rDNA PCR鑒定設(shè)計并合成大腸桿菌16S rDNA 通用引物(表1)。提取分離株基因組DNA作為模板。PCR反應(yīng)體系：上、下游引物各1 μL，模板DNA 2 μL，2×Taq Master Mix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL；PCR擴增條件：95℃ 5 min，94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 1 min，共30個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果。將PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，結(jié)果與GenBank已知序列比對分析，確定菌種信息。

表1 引物信息

1.7 分離菌株小鼠致病性試驗SPF級BALB/c小鼠，體質(zhì)量(20 ± 2)g，由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。選取156只健康小鼠，隨機分成26組，每組6只。第1組為對照組，其余為試驗組。將菌液濃度調(diào)至1×108CFU/mL，取1 mL菌液裝入1.5 mL 離心管，12 000 r/min離心2 min。棄上清，用1 mL滅菌生理鹽水懸浮。試驗組每只小鼠腹腔注射相應(yīng)菌液0.2 mL，對照組注射等量生理鹽水，觀察記錄小鼠的臨床癥狀和病死情況。剖檢病死小鼠，觀察器官病變，并采集心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟進行細菌的分離鑒定。

1.8 分離株的血清型鑒定對鑒定為致病性大腸桿菌的菌株，培養(yǎng)處理制成凝集抗原，采用玻片凝集試驗進行血清型鑒定。

1.9 分離菌藥敏試驗取200 μL菌液均勻涂布到普通瓊脂培養(yǎng)基上，貼藥敏片，37℃培養(yǎng)24 h，測量抑菌圈直徑。參照CLSI的標準進行判定。

1.10 耐藥基因檢測根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)設(shè)計11種耐藥基因引物(表2)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以待測基因為模板進行PCR擴增，產(chǎn)物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果。

表2 大腸桿菌耐藥基因引物信息

1.11 治療試驗隨機將患病犢牛分為4組：A組為最敏感抗生素組，B組為中藥組，C組為最敏感抗生素+中藥組，D組為患病組；另選健康犢牛設(shè)為E組，作為對照組。治療期間均正常飼喂，并觀察效果。

2 結(jié)果

2.1 細菌分離培養(yǎng)及染色鏡檢共獲得25株疑似大腸桿菌的菌株。這些菌株在普通瓊脂培養(yǎng)基上呈圓形、灰白色、半透明狀(圖1)，在麥康凱培養(yǎng)基上為表面光滑的紅色圓形菌落(圖2)，在伊紅美藍培養(yǎng)基上為紫黑色帶金屬光澤的圓形大菌落(圖3)。挑取單個菌落進行革蘭染色，鏡下可見兩端鈍圓的粉紅色短桿菌(圖4)。

圖1 普通瓊脂平板上菌落形態(tài) 圖2 麥康凱瓊脂平板上菌落形態(tài)

圖3 伊紅美藍瓊脂平板上菌落形態(tài) 圖4 分離菌的形態(tài)觀察(1 000×)

2.2 生化鑒定生化鑒定結(jié)果表明，25株分離株符合《伯杰氏手冊》的大腸桿菌生化鑒定標準。硫化氫、苯丙氨酸、葡萄糖酸鹽、枸櫞酸鹽、尿素反應(yīng)均為陰性，蛋白胨水、半固體、賴氨酸、鳥氨酸、棉子糖、山梨醇、側(cè)金盞花醇、木糖反應(yīng)均為陽性。

2.3 16S rDNA PCR鑒定經(jīng)PCR擴增及凝膠電泳，得到1 400 bp左右的目的條帶(圖5)。測序結(jié)果經(jīng)BLAST在線比對，25株分離菌與大腸桿菌的同源性高于99%，確定為大腸桿菌。

M.DL2000 DNA Marker；1～13.被檢菌株

2.4 小鼠致病性試驗接種大腸桿菌后，各試驗組小鼠出現(xiàn)了精神萎靡、食欲不振、被毛雜亂、腹瀉、抽搐等癥狀。一段時間后，22個試驗組的小鼠全部死亡，致死率為88%(22/25)。剖檢死亡小鼠(圖6)，可見腸壁變薄，腸道黏膜出血，腸內(nèi)產(chǎn)氣，實質(zhì)臟器充血淤血。取小鼠心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟等組織進行涂片染色鏡檢，可見革蘭陰性短小桿菌。挑取病變組織接種于伊紅美藍培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)18 h，可見典型的大腸桿菌菌落生長。

圖6 小鼠剖檢病變

2.5 O血清型的鑒定通過玻片凝集試驗，在25株致病性大腸桿菌分離株中定型了15株，共覆蓋了6種血清型，分別為O152、O157、O167、O100、O19和O39，其中O157和O152為優(yōu)勢血清型，分別占定型血清的30%和26%；10株未能定型(表3)。

表3 致病性大腸桿菌的血清型鑒定

2.6 藥敏試驗藥敏試驗表明(表4)，25株分離菌對強力霉素、復(fù)方新諾明的耐藥率最高(88%)；對氨芐西林、鏈霉素、環(huán)丙沙星的耐藥率分別為76% (19/25)，72% (18/25)，56% (14/25)。對新霉素敏感率高達80% (20/25)，對多黏菌素B、頭孢曲松的敏感率分別為64% (16/25)，60% (15/25)。

表4 25株分離菌的藥物敏感性

2.7 耐藥基因檢測對25株分離菌的耐藥基因檢測表明，大環(huán)內(nèi)酯類ermB基因(圖7)和四環(huán)素類tetB基因的檢出率最高(100%)，β-內(nèi)酰胺類blaTEM、氨基糖苷類aaC2、aaC4和喹諾酮類qnrB等基因的檢出率分別為72%，64%，68%，60%，未檢測到四環(huán)素類tetA和磺胺類sul2基因(表5)。

表5 11種耐藥基因檢出率

M.DL2000 DNA Marker；1～13.被檢菌株

2.8 治療試驗最敏感抗生素為新霉素，故將新霉素用于治療試驗，中藥選用白頭翁散。25頭大腸桿菌性腹瀉犢牛分為4組：A組(新霉素治療組，6頭)，6.5%新霉素可溶性粉劑，0.1 g/kg體質(zhì)量，灌服，每天2次，連用5 d；B組(白頭翁散治療組，6頭)，白頭翁散，0.1 g/kg體質(zhì)量，灌服，每天2次，連用5 d；C組(新霉素+白頭翁散治療組，6頭)，6.5%新霉素可溶性粉0.1 g/kg體質(zhì)量+白頭翁散0.1 g/kg體質(zhì)量，灌服，每天2次，連用5 d；D組(患病組，7頭)，不予治療。E組(對照組)，6頭40～50日齡的健康犢牛。

從表6結(jié)果顯示，C組治愈率最高(100%)，5 d后痊愈；A、B組治愈率分別為83.3%和66.7%。B、D組的病死率分別為16.7%和28.6%。相比于單純使用抗生素或中藥，中藥和抗生素聯(lián)合應(yīng)用的治療效果最佳。

表6 抗生素與中藥組方對犢牛腹瀉大腸桿菌病的治療效果

3 討論

犢牛腹瀉大腸桿菌病世界范圍內(nèi)廣泛流行，造成了巨大的經(jīng)濟損失[3]。目前，國內(nèi)、外治療該病多以抗生素為主，但由此導(dǎo)致的耐藥性問題日趨嚴重[4]。耐藥性的產(chǎn)生不僅對臨床治療有很大影響，也給動物食品安全帶來潛在風(fēng)險，對養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展帶來極大危害[5]。致病性大腸桿菌是犢牛腹瀉病不可忽視的重要病原[5-7]。不同地區(qū)致犢牛腹瀉大腸桿菌的分離率不同。京津地區(qū)致犢牛腹瀉大腸桿菌的分離率為61.7%[8]，新疆地區(qū)的分離率為88%[9]。本試驗中，犢牛腹瀉大腸桿菌的分離率為69.4%，與以上兩地區(qū)相比，分離率均在60%以上，說明這種疾病是犢牛多發(fā)病，在養(yǎng)殖生產(chǎn)中應(yīng)予以高度重視。劉少昆[8]研究表明，37株大腸桿菌分離株中，有32株致小鼠死亡，致死率約為86%。高睿[10]研究表明，28株大腸桿菌分離株中，有22株使小鼠死亡，致死率約為79%，本試驗分離的大腸桿菌對小鼠致死率為88%，與研究報道[8,10]結(jié)果相近。據(jù)報道，導(dǎo)致犢牛腹瀉的大腸桿菌常見血清型為 O1、O2、O14、O15、O35、O75、O78、O86、O101、O137等，本試驗共定型了O152、O157、O167、O100、O19和O39 6種血清型，其中O157和O152為優(yōu)勢血清型。此結(jié)果不同于郝彥龍等[11]報道的新疆地區(qū)的優(yōu)勢血清型，也與王姣姣等[12]報道的吉林省部分地區(qū)的優(yōu)勢血清型不同。這表明牛源大腸桿菌的血清型由于地域的不同存在著差異。

本試驗中，25株分離菌對新霉素的敏感性最高，可以作為該地區(qū)防治該病的首選藥物。吳同壘等[13]報道，河北省秦皇島地區(qū)犢牛腹瀉大腸桿菌攜帶的耐藥基因主要是喹諾酮類的gyrB、oqxA、gyrA基因，檢出率均在80%以上，四環(huán)素類tetC基因、氨基糖苷類aadA1、aac2 基因和磺胺類sul1基因檢出率均超過了60%。張陸等[14]報道，黑龍江省哈爾濱地區(qū)犢牛源腹瀉大腸桿菌耐藥基因blaTEM、aadA1、tetA、tetB的檢出率分別為84.6%，73.3%，69.2%，38.5%。而本研究中，此次分離的大腸桿菌全部攜帶ermB基因和tetB基因，對blaTEM、aaC2、aaC4、qnrB這4種耐藥基因的檢出率也比較高，分別為72%，64%，68%，60%。以上說明不同地區(qū)分離株的耐藥基因存在明顯差異，這可能與各地區(qū)用藥習(xí)慣不同或者各地區(qū)致病性大腸桿菌的流行株不同有關(guān)。據(jù)報道，多數(shù)耐藥基因與耐藥表型是基本相符的[15]。分離株的藥物敏感性試驗與耐藥基因檢測結(jié)果進行對比，發(fā)現(xiàn)個別耐藥基因與耐藥表型存在符合率較低的現(xiàn)象，如未檢測到四環(huán)素類tetA基因和磺胺類sul2基因，但藥物敏感性試驗中磺胺類復(fù)方新諾明和四環(huán)素類強力霉素的耐藥性較高，這可能是四環(huán)素類耐藥基因和磺胺類耐藥基因有多種tet(A-M)和sul(1-3)，存在其他耐藥基因?qū)е路蛛x株對某些四環(huán)素或磺胺類藥物耐藥情況的產(chǎn)生[16]；也可能是某些耐藥基因與編碼大腸桿菌的酶有關(guān)，進而影響藥物的作用靶位[17]，使大腸桿菌對一些抗生素產(chǎn)生潛在耐藥性。由于大腸桿菌耐藥機制較復(fù)雜，很多耐藥基因未檢測或耐藥機制未被發(fā)現(xiàn)，具體原因還需進一步研究[18]。

治療試驗中，雖然選擇的中藥具有一定的清熱解毒、抗菌消炎、涼血止痢的作用，可能中藥的藥效較緩和，導(dǎo)致單純使用中藥療效不佳，有一定死亡率。單純使用抗生素會造成胃腸內(nèi)環(huán)境的損傷，所以療效也不是特別理想。中藥和抗生素聯(lián)合使用，具有協(xié)同作用，克服了兩者的缺點，所以取得了很好的治療效果。

綜上所述，針對河北省保定地區(qū)犢牛腹瀉大腸桿菌病進行治療時，建議各養(yǎng)殖場定期對致病性大腸桿菌首先進行藥物敏感性監(jiān)測，選擇高敏的抗生素和中藥進行聯(lián)合治療，使該病得到及時有效的控制。