王春美 祁文靜 任艷嬌 盛光耀

（鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒童醫(yī)院，河南鄭州 450052）

急性單核細(xì)胞白血病（acute monocytic leukemia，AML‐M5）是急性髓細(xì)胞白血?。╝cute myelogenous leukemia，AML）的一種亞型，約占兒童AML 的11.5%～27.5%，盡管化療可使80%的患兒獲得完全緩解［1］，但因其較高的復(fù)發(fā)率及治療相關(guān)的病死率，5 年無病存活率僅為40%～50%［2］，顯著低于其他亞型AML。因此積極探索新的治療策略，提高其預(yù)后，具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義?；⒄溶帐菑闹兴幓⒄鹊母稍锔o中提取的單體，體外具有抗腫瘤作用。本課題組前期研究證實(shí)，虎杖苷可有效抑制AML‐M5細(xì)胞株THP‐1細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡［3］，但具體機(jī)制不明。PI3K/AKT/mTOR信號通路在白血病的發(fā)病中起重要作用，本研究進(jìn)一步探討虎杖苷是否通過該信號通路影響THP‐1的增殖及凋亡。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

THP‐1細(xì)胞株（上海碧云天生物技術(shù)研究所），虎杖苷（北京Solarbio 公司），RPMI 1640 培養(yǎng)基（美國Corning 公司），Gibco 胎牛血清（美國Invitrogen 公司），DMSO（上海索寶生物科技有限公司），兔抗人PI3K、兔抗人AKT、鼠抗人p‐AKT、鼠抗人mTOR、鼠抗人p‐mTOR、兔抗人p70 S6K、兔抗人p‐p70 S6K、鼠抗人GAPDH 抗體（美國Abcam公司），山羊抗兔IgG‐HRP、山羊抗鼠IgG‐HRP抗體及CCK‐8試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)研究所），Annexin V‐FITC 凋亡檢測試劑、細(xì)胞周期檢測試劑盒（美國BD 公司）?；⒄溶杖芙庥贒MSO 中，稀釋至10 mmol/L，儲(chǔ)存于4°C 冰箱中，實(shí)驗(yàn)過程中根據(jù)需要稀釋至不同濃度。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

THP‐1細(xì)胞使用含10%胎牛血清RPMI‐1640培養(yǎng)基（含0.05 mol/L 2‐巰基乙醇、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 鏈霉素），置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將處于指數(shù)增殖期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 CCK‐8法檢測細(xì)胞增殖

在96 孔板中接種細(xì)胞懸液（100 μL/孔，約含有4 000個(gè)細(xì)胞）。加入不同濃度的虎杖苷（0、1.9、3.9、7.81、15.63、31.25、62.5、125、250、500、1 000、2 000 μmol/L）處理，每組設(shè)置5個(gè)平行復(fù)孔；之后將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h，向每孔加入10 μL CCK‐8 溶液，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，酶標(biāo)儀檢測450 nm 波長的吸光度值。細(xì)胞增殖活力（%） = ［（A-A空白）/A0-A空白］×100（A：孔內(nèi)含有細(xì)胞、CCK‐8溶液和不同濃度虎杖苷溶液的吸光度值；A空白：孔內(nèi)無細(xì)胞，但含有細(xì)胞培養(yǎng)基和CCK‐8 溶液的吸光度值；A0：孔內(nèi)含有細(xì)胞、CCK‐8 溶液，但未施加虎杖苷溶液的吸光度值）。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

將處于指數(shù)增殖期的細(xì)胞接種于6孔板中孵育過夜，設(shè)立空白對照組（細(xì)胞中未施加虎杖苷溶液處理）和虎杖苷處理組，每組設(shè)3個(gè)平行復(fù)孔，48 h 后收集細(xì)胞。用1 mL 預(yù)冷的PBS 重懸細(xì)胞，顯微鏡下調(diào)細(xì)胞密度為2×105/mL～5×105/mL，取195 μL 細(xì)胞懸液至干凈無菌的試管中，并加入5 μL Annexin V‐FITC，暗室中孵育10 min；室溫1 000 r/min 離心5 min，棄去上清液，重懸細(xì)胞于190 μL 的結(jié)合液中；加入5 μL 的PI 染色液，混勻后上流式細(xì)胞儀檢測。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期

細(xì)胞培養(yǎng)及分組同1.4 小節(jié)。離心收集空白對照組和虎杖苷處理48 h 的細(xì)胞，4℃預(yù)冷PBS 洗滌1 次，1 500 r/min 離心5 min，棄上清；加入4℃預(yù)冷的70%乙醇1 mL 固定過夜；次日1 500 r/min 離心5 min，棄去固定液，加入0.5 mL 的PBS 重懸細(xì)胞；依 次 加 入RNaseA （終 濃 度50 μg/mL）、500 μL PI（100 μg/mL），避光孵育30 min；使用流式細(xì)胞儀檢測，CellQuest軟件檢測G0/G1、S和G2/M期的細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.6 Western blot法檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)

細(xì)胞培養(yǎng)及分組同1.4 小節(jié)。離心收集空白對照組和虎杖苷處理48 h 的細(xì)胞，冰上靜置30 min以充分裂解，12 000 r/min 離心5 min，迅速將上清（蛋白提取液）轉(zhuǎn)移至預(yù)冷新EP管中，即為細(xì)胞總蛋白。Bradford 法測定蛋白濃度。蛋白樣本經(jīng)10%的SDS‐PAGE 電泳分離，半干轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，含5%脫脂奶粉的TBST 溶液4℃封閉過夜。一抗（PI3K、 AKT、 p‐AKT、 mTOR、 p‐mTOR、 p70 S6K、p‐p70 S6K、GAPDH 抗 體，p‐p70 S6K 按1∶500 稀釋，PI3K、p‐AKT、p‐mTOR 按1∶1 000稀釋，p70 S6K 按1∶2 000 稀釋，AKT、mTOR、GAPDH 按1∶3 000 稀釋）室溫孵育2 h，TBST 溶液洗滌10 min×3 次，TBS 溶液洗滌10 min×1 次；相應(yīng)的二抗（1∶3 000 稀釋）室溫孵育2 h，TBST溶液洗滌10 min×3 次，TBS 溶液洗滌10 min×1次，ECL發(fā)光液處理后暗室內(nèi)曝光，膠片于室溫下自然風(fēng)干；掃描儀掃描結(jié)果保存，Image J 軟件分析灰度值結(jié)果，蛋白表達(dá)水平以目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值比值表示，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s） 表示，2 組間比較采 用兩樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 虎杖苷對THP‐1細(xì)胞增殖的影響

用不同梯度濃度的虎杖苷（0、1.9、3.9、7.81、 15.63、 31.25、 62.5、 125、 250、 500、1 000、2 000 μmol/L）分別處理THP‐1 細(xì)胞24 h、48 h，結(jié)果顯示：在48 h時(shí)，虎杖苷對THP‐1細(xì)胞增殖有抑制作用，其半數(shù)抑制濃度（median inhibitory concentration，IC50） 約 為1 800 μmol/L（圖1）。因此選擇1 800 μmol/L 的虎杖苷處理THP‐1細(xì)胞48 h用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 虎杖苷對THP‐1細(xì)胞增殖的影響

2.2 虎杖苷對THP‐1細(xì)胞凋亡的影響

細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，1 800 μmol/L 的虎杖苷處理THP‐1 細(xì)胞48 h 后，細(xì) 胞 凋 亡率為11.68%±0.25%，顯著高于空白對照組（6.20%±0.54%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=18.360，P＜0.001），見圖2。

圖2 虎杖苷對THP‐1細(xì)胞凋亡的影響 右上象限為晚期凋亡細(xì)胞，右下象限為早期凋亡細(xì)胞，細(xì)胞凋亡結(jié)果為早期凋亡+晚期凋亡細(xì)胞總和。

2.3 虎杖苷對THP‐1細(xì)胞周期的影響

細(xì)胞周期結(jié)果顯示，1 800 μmol/L 的虎杖苷處理THP‐1細(xì)胞48 h后，細(xì)胞出現(xiàn)G0/G1期至S期的阻滯，表現(xiàn)為G0/G1期的細(xì)胞比例較空白對照組明顯上升（P＜0.001），S 期的細(xì)胞比例較空白對照組顯著下降（P＜0.001），但G2/M 期的細(xì)胞比例在兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.389），見表1、圖3。

圖3 虎杖苷對THP‐1細(xì)胞周期的影響

表1 虎杖苷對THP‐1細(xì)胞周期的影響 （ ±s，%）

表1 虎杖苷對THP‐1細(xì)胞周期的影響 （ ±s，%）

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2.4 虎杖苷對THP‐1 細(xì)胞中PI3K/AKT/mTOR/p70 S6K信號通路中相關(guān)基因蛋白表達(dá)的影響

Western blot 結(jié)果顯示，1 800 μmol/L 的虎杖苷處理THP‐1細(xì)胞48 h后，虎杖苷組PI3K、AKT、p‐AKT、mTOR、p‐mTOR、p70 S6K、p‐p70 S6K 蛋白表達(dá)均較空白對照組顯著降低（P＜0.05），結(jié)果見表2、圖4。

表2 虎杖苷對THP‐1細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 （±s）

表2 虎杖苷對THP‐1細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 （±s）

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圖4 Western blot檢測兩組信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的電泳圖

3 討論

目前兒童AML‐M5的治療手段主要是化療和造血干細(xì)胞移植，化療在AML‐M5治療中仍處于基礎(chǔ)地位，但化療過程中可能出現(xiàn)骨髓抑制、因粒細(xì)胞減少或缺乏而發(fā)生各種嚴(yán)重感染，以及原發(fā)耐藥而導(dǎo)致化療無效等。近年來，采用傳統(tǒng)中藥等植物提取物治療腫瘤引起了大家的廣泛關(guān)注。目前植物來源的長春新堿、紫杉醇、依托泊苷、喜樹堿等早已廣泛應(yīng)用于臨床，從傳統(tǒng)中藥提取的抗腫瘤藥物如姜黃素、黃連素、冬凌草甲素等也已被證實(shí)體外具有抗腫瘤作用。從植物中篩選提煉新型抗腫瘤藥物，研究其抗腫瘤作用并探討其機(jī)制，已成為腫瘤領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。

虎杖苷是從虎杖的干燥根莖中提取的第4種單體，又名白藜蘆醇苷，研究表明虎杖苷有多種生物學(xué)作用，如抗血小板聚集、抗休克、抗心肌缺血/再灌注損傷、肝臟保護(hù)、神經(jīng)保護(hù)、肺臟保護(hù)、抗感染、免疫調(diào)節(jié)等作用［4-7］。近年研究發(fā)現(xiàn)，虎杖苷亦具有抗腫瘤作用［8-9］，但大都是關(guān)于實(shí)體瘤的，其對AML‐M5的研究相對較少，具體機(jī)制仍不清楚。

本研究首先使用不同濃度的虎杖苷處理THP‐1細(xì)胞，觀察其對THP‐1 細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在48 h 時(shí)虎杖苷可顯著抑制THP‐1 細(xì)胞的增殖，IC50 濃度為1 800 μmol/L，和本課題組既往研究的IC50 濃度不完全一致［3］，考慮與細(xì)胞株和虎杖苷來源不同有關(guān)，既往實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株和虎杖苷來源于上海中科院細(xì)胞庫和美國Santa Cruz 公司，本次實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株和虎杖苷來源于上海碧云天生物技術(shù)研究所和北京Solarbio 公司，但結(jié)果均提示虎杖苷可有效抑制THP‐1細(xì)胞的增殖。

使用1 800 μmol/L 濃度的虎杖苷處理THP‐1 細(xì)胞48 h 后，細(xì)胞的凋亡率顯著升高，同時(shí)細(xì)胞周期出現(xiàn)G0/G1期至S 期的阻滯，G0/G1期的細(xì)胞比例明顯上升，S期的細(xì)胞比例顯著下降，提示虎杖苷可能是通過阻滯細(xì)胞周期和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用的。

PI3K/AKT/mTOR 是細(xì)胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、生長、分化、凋亡等多個(gè)環(huán)節(jié)，影響多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸，并且與腫瘤細(xì)胞的耐藥相關(guān)［10-11］，針對該信號通路相關(guān)分子的靶向藥物研究是近年研究的熱點(diǎn)。既往研究表明，PI3K/AKT/mTOR 信號通路的異常活動(dòng)在急性髓系白血病的發(fā)病中起重要作用［12-13］，對PI3K/AKT/mTOR 信號通路抑制劑的研究是近年研究的熱點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示，使用1 800 μmol/L濃度的虎杖苷處理THP‐1 細(xì)胞48 h 后，PI3K、AKT、p‐AKT、mTOR、p‐mTOR、p70 S6K、p‐p70 S6K蛋白表達(dá)均顯著降低，提示虎杖苷可有效抑制PI3K/AKT/mTOR 信號通路，可能是虎杖苷抑制THP‐1細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制。

綜上，虎杖苷能夠在體外抑制THP‐1細(xì)胞的增殖、阻滯細(xì)胞周期并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT/mTOR 信號通路而實(shí)現(xiàn)的。本研究進(jìn)一步闡明了虎杖苷的抗腫瘤作用，為虎杖苷治療AML‐M5 的臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。