李 雪， 張 玉， 王君虹， 孫素玲， 王 偉,朱申龍， 沈國(guó)新， 牛二利

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營(yíng)養(yǎng)研究所1，杭州 310021) (農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品信息溯源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)2，杭州 310021) (浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院木本油料品質(zhì)營(yíng)養(yǎng)國(guó)際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室3，杭州 310021)

植物油氧化是指其在加工、儲(chǔ)藏過程中與氧氣進(jìn)行的反應(yīng)。油脂氧化反應(yīng)產(chǎn)物—過氧化物分解可形成具有異味的酸敗產(chǎn)物，導(dǎo)致油的感官風(fēng)味變差；同時(shí)，油脂酸敗會(huì)破壞油中的營(yíng)養(yǎng)組分，使油的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)降低；而有些氧化產(chǎn)物具有致癌性，食用后會(huì)誘發(fā)機(jī)體的生理異常，危害人體健康[1,2]。因此，油脂氧化是影響植物油質(zhì)量安全的主要因素。氧化應(yīng)激普遍存在于生物體內(nèi)，活性氧(Reactive oxygen species, ROS)是導(dǎo)致氧化應(yīng)激的主要因素，ROS是細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)信號(hào)調(diào)節(jié)分子，當(dāng)其水平超過正常范圍時(shí)，體內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)被打破，使靶組織和敏感細(xì)胞損傷，進(jìn)而導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生、發(fā)展[3]。植物油中的天然抗氧化物可保持油脂的感官和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)并延長(zhǎng)其貨架期，還對(duì)保護(hù)人體防御氧化應(yīng)激損傷具有重要作用[4]。因此，抗氧化活性是評(píng)價(jià)植物油品質(zhì)的重要指標(biāo)之一[5]。植物油的抗氧化活性影響因素較多，研究表明脂肪酸組成及微量組分多酚、不皂化物等與植物油的抗氧化能力密切相關(guān)[6,7]，其中微量組分的作用受到廣泛關(guān)注。

樟樹屬于樟科樟屬，常綠高大喬木植物，廣泛分布于我國(guó)長(zhǎng)江流域及長(zhǎng)江以南地區(qū)，資源十分豐富。樟樹單棵樟樹籽年產(chǎn)量可達(dá)50 kg以上，但長(zhǎng)期以來(lái)樟樹籽基本處于“自生自滅”狀態(tài)，開發(fā)利用極少，造成了資源浪費(fèi)和環(huán)境污染[8]。因此，樟樹籽的開發(fā)利用具有極大的現(xiàn)實(shí)意義。據(jù)報(bào)道，樟樹籽含油量達(dá)到37%以上，其油脂中含有多種脂肪酸，主要為癸酸和月桂酸，相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)在90%以上[9]。樟樹籽油溶點(diǎn)低、皂化值高，屬于不干性油，無(wú)毒副作用，可用作化妝品的乳化劑、均質(zhì)劑、防凍劑，食品中的乳化劑、穩(wěn)定劑和潤(rùn)濕劑等[10]。另外，樟樹籽油還是生產(chǎn)生物柴油的好原料[11]。樟樹籽油不僅可用于工業(yè)上，還具有抑菌[12]、快速補(bǔ)充能量[13]、顯著減少體內(nèi)脂肪蓄積的作用[14]，對(duì)肥胖導(dǎo)致的代謝紊亂、菌群失調(diào)、動(dòng)脈硬化等均具有改善作用，其中，抗氧化活性在樟樹籽油改善代謝紊亂的機(jī)制中發(fā)揮重要作用[15-17]。由此，樟樹籽油在食品及醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣闊的開發(fā)前景。樟樹籽油活性物質(zhì)基礎(chǔ)的研究相對(duì)薄弱，目前研究主要集中在樟樹籽油的脂肪酸組成及加工工藝上[8,9]，對(duì)于微量化合物及其對(duì)樟樹籽油活性的貢獻(xiàn)率研究較少，這制約了樟樹籽油的進(jìn)一步開發(fā)與利用。因此，本研究以樟樹籽油為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，對(duì)其理化參數(shù)、化合物組成(脂肪酸、不皂化物、總多酚)及抗氧化活性進(jìn)行分析，初步明確抗氧化活性物質(zhì)基礎(chǔ)，為樟樹籽油的開發(fā)利用及提高樟樹資源的利用率提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樟樹籽油、初榨橄欖油。

37種脂肪酸甲酯標(biāo)樣(純度>99%)，沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度>99%)，苯并[α]芘標(biāo)準(zhǔn)品(純度>99%)，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH)，福林酚試劑、氫氧化鉀，酚酞、異辛烷、冰醋酸、碘化鉀、硫代硫酸鈉、淀粉、環(huán)己烷、正庚烷、無(wú)水乙醇、甲醇、碳酸鈉均為分析純。甲苯、乙腈、正己烷、二氯甲烷、乙醚為色譜純。超純水(電阻率18.2 mΩ·cm-1)。苯并[α]芘分子印跡柱(500 mg，6 mL)。

1.2 儀器設(shè)備

Trace 3100氣相色譜儀配備氫火焰離子化檢測(cè)器，AMR-100全自動(dòng)酶標(biāo)分析儀，Waters e2695高效液相色譜儀，RV10-D-V型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樟樹籽油理化指標(biāo)檢測(cè)

樟樹籽油過氧化值及酸值的測(cè)定分別依照國(guó)標(biāo)方法GB 5009.227—2016及GB 5009.229—2016[18-19]。苯并[α]芘測(cè)定參照GB 5009.27—2016[20]。色澤、透明度測(cè)定參照GB/T 5525—2008[21]。

1.3.2 脂肪酸組成分析

脂肪酸甲酯化依據(jù)國(guó)際油橄欖協(xié)會(huì)(IOC)COI/T.20/Doc. No 33[22]標(biāo)準(zhǔn)方法。

氣相色譜條件：HP-88毛細(xì)管柱 (30 m×0.25 mm×0.2 μm i.d., Agilent)。升溫程序：70 ℃保持1 min, 以 10 ℃/min升至120 ℃保持1.5 min，以3 ℃/min升至230 ℃保持2 min，分流進(jìn)樣，分流比1∶50。進(jìn)樣量0.5 μL，檢測(cè)器及進(jìn)樣口溫度為270 ℃，載氣為氮?dú)猓魉? mL/min-1。

1.3.3 總多酚分析

樟樹籽油中總多酚的檢測(cè)參照文獻(xiàn)方法[23]，采用液液萃取法進(jìn)行多酚類化合物的提取，采用福林酚比色法在750 nm波長(zhǎng)處測(cè)定樣品吸光度，以沒食子酸作為標(biāo)準(zhǔn)溶液制作工作曲線，計(jì)算樣品中總多酚含量。

1.3.4 不皂化物分析

樟樹籽油不皂化物的制備參考文獻(xiàn)方法[24]，并稍作修改：準(zhǔn)確稱取5 g樟樹籽油，加入50 mL 2 mol/L的氫氧化鉀乙醇溶液，80 ℃水浴回流1 h。停止加熱后于冷凝管頂部加入50 mL蒸餾水，旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)。冷卻后，回流液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，加入100 mL乙醚萃取不皂化物，重復(fù)萃取1次，合并2次萃取液，并轉(zhuǎn)移至分液漏斗中。在萃取液中加入40 mL水進(jìn)行洗滌，收集上層液體，重復(fù)洗滌2次，回收上層提取液，低溫減壓蒸干溶劑，殘?jiān)?103±2) ℃烘箱中干燥15 min。準(zhǔn)確稱量殘?jiān)|(zhì)量，計(jì)算不皂化物含量，備用。

1.3.5 DPPH自由基清除能力測(cè)定

參照文獻(xiàn)[23]報(bào)道的方法，稍加改動(dòng)：吸取樣品待測(cè)液100 μL，加入0.4 mmol/L DPPH溶液100 μL，搖勻，室溫反應(yīng)30 min，應(yīng)用全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定520 nm波長(zhǎng)處的吸光度(A樣品)；樣品待測(cè)液100 μL與無(wú)水乙醇100 μL混合，在520 nm處測(cè)定吸光度(A對(duì)照)；測(cè)定100 μL DPPH溶液與100 μL無(wú)水乙醇的混合液在520 nm波長(zhǎng)處的吸光度(A空白)。DPPH清除率按以下公式計(jì)算：

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)表示。采用GraphPad prism (ver. 5, GraphPad Software?, USA)進(jìn)行抗氧化活性的IC50值計(jì)算，利用Microsoft Excel 2007軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及顯著性分析，P<0.05被認(rèn)為是顯著的，P<0.01被認(rèn)為是極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 樟樹籽油的理化性質(zhì)

樟樹籽油的理化參數(shù)測(cè)定結(jié)果見表1。樟樹籽油在常溫下為液態(tài)，顏色呈淡黃色，色澤澄清透明，具有樟樹特有的芳香氣味，無(wú)異味。油脂酸值為(2.4±0.0)mg/g，顯著高于文獻(xiàn)報(bào)道值(0.168～0.178mg/g)[9, 25]，表明游離脂肪酸含量較高，可能是榨油原料的質(zhì)量問題導(dǎo)致其酸值偏高；油脂過氧化值為(0.16±0.01) mmol/kg，顯著低于文獻(xiàn)中測(cè)定數(shù)據(jù)(1.665 mmol/kg-1)，說(shuō)明樟樹籽油過氧化物含量少，油脂氧化程度低[15]；以上指標(biāo)符合國(guó)家食用植物油標(biāo)準(zhǔn)(GB 2716—2018)[26]。樟樹籽油苯并[α]芘含量為(6.00±0.21) μg/kg，低于國(guó)家食品中污染物限量標(biāo)準(zhǔn)(GB 2762—2017)中油脂及其制品中苯并[α]芘的限量要求[27]。

表1 樟樹籽油的理化性質(zhì)與微量化合物含量

2.2 樟樹籽油的脂肪酸組成

樟樹籽油的脂肪酸通過與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)保留時(shí)間比對(duì)進(jìn)行定性分析，按照峰面積歸一化法進(jìn)行定量，結(jié)果見表2。

表2 樟樹籽油脂肪酸組成及含量

從樟樹籽油中共鑒定出14種脂肪酸，包括4種中鏈脂肪酸：辛酸、癸酸、十一碳酸及月桂酸，含量高達(dá)94.80%；10種長(zhǎng)鏈脂肪酸：主要為豆蔻酸、棕櫚酸、油酸及亞油酸等，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.20%，長(zhǎng)鏈脂肪酸中還包括少量的ω-3脂肪酸(α-亞麻酸、二十碳五烯酸)及ω-6脂肪酸(亞油酸、γ-亞麻酸)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.08%和0.59%。與前人關(guān)于樟樹籽油脂肪酸組成的分析結(jié)果相比[9, 13, 25]，本研究檢測(cè)到十一碳酸、棕櫚油酸、γ-亞麻酸、二十碳烯酸和二十碳五烯酸等5種脂肪酸，不同提取方法對(duì)油中脂肪酸組成影響較小，但對(duì)其相對(duì)含量有較大的影響。據(jù)報(bào)道，高含量的中鏈脂肪酸與樟樹籽油改善肥胖、調(diào)節(jié)機(jī)體代謝紊亂的作用密切相關(guān)[15,16]。亞油酸及亞麻酸等不飽和脂肪酸具有多種生理功能，包括降低心血管疾病發(fā)病率和死亡率等[28]。

2.3 樟樹籽油的微量化合物含量分析

樟樹籽油中總多酚含量為(33.07±0.63)mg/kg(表1)，與國(guó)內(nèi)橄欖油中總多酚含量相當(dāng)(21.26～26.04 mg/kg)[29]。目前，對(duì)山茶油和橄欖油等木本油料中多酚類化合物的研究已有較多報(bào)道[30-32]，但對(duì)樟樹籽油中多酚組分的研究極少。多酚類化合物是植物油中重要的化學(xué)組成部分，其數(shù)量繁多、結(jié)構(gòu)多樣，與植物油的獨(dú)特風(fēng)味密切相關(guān)，作為活性極強(qiáng)的天然抗氧化劑多酚化合物可增強(qiáng)油脂的氧化穩(wěn)定性、延長(zhǎng)油脂的貨架期[33]。此外，研究表明多酚化合物具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗炎、抗腫瘤、改善心腦血管疾病的作用[33]。鑒于多酚化合物在植物油營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)保持及功能活性發(fā)揮方面具有重要作用，開展樟樹籽油中多酚化合物的研究對(duì)于其開發(fā)利用具有重要意義。

樟樹籽油中不皂化物為(0.55±0.01)%，遠(yuǎn)高于文獻(xiàn)報(bào)道的樟樹籽油中不皂化物含量[(0.32±0.04)g/kg][15],油提取方法的不同可能是導(dǎo)致不皂化物含量差異的主要原因。有研究對(duì)不同植物油(橄欖油、元寶楓油、美藤果油、亞麻籽油、長(zhǎng)柄扁桃油、核桃油)的不皂化物含量進(jìn)行分析，不同種類油的不皂化物差異不顯著，在0.73%～0.98%之間，樟樹籽油的不皂化物含量略低于其他植物油。不皂化物是植物油微量組分中的重要成分，其主要由脂肪醇、甾醇、三萜烯二醇、生育酚及角鯊烯等化合物組成，功能活性研究表明不皂化物具有抗炎及改善氧化應(yīng)激的作用，并可通過調(diào)節(jié)T細(xì)胞的活性及腸道歸巢能力促進(jìn)炎癥性腸病的治療[24, 34]。目前，關(guān)于樟樹籽油中不皂化物的活性研究鮮見報(bào)道。

2.4 樟樹籽油的抗氧化能力及活性化合物分析

抗氧化活性是評(píng)價(jià)植物油品質(zhì)的重要指標(biāo)之一。DPPH是一種穩(wěn)定的氮中心自由基，在溶液中顯紫色，抗氧化物質(zhì)通過單電子轉(zhuǎn)移降低自由基含量，紫色消失[35]。因其操作簡(jiǎn)單、快速，DPPH自由基清除方法被廣泛用于化合物體外抗氧化活性的研究。本實(shí)驗(yàn)采用DPPH自由基清除法對(duì)樟樹籽油的抗氧化能力進(jìn)行測(cè)定，并以橄欖油作為對(duì)照。結(jié)果表明，樟樹籽油濃度為0.39 g/mL時(shí)，對(duì)DPPH自由基的清除率為(92.69±1.92)%，相同濃度的橄欖油的DPPH清除率為(96.23±0.26)%，樟樹籽籽油對(duì)DPPH具有較高的清除率，但其清除能力略低于橄欖油。如圖1所示，樟樹籽油對(duì)DPPH的清除率與其濃度呈正相關(guān)性,通過清除率擬合曲線，其清除率的IC50值為0.13 g/mL。

圖1 樟樹籽油對(duì)DPPH自由基抑制率

針對(duì)樟樹籽油抗氧化活性物質(zhì)不明的問題，本研究分別對(duì)樟樹籽油中的多酚組分及不皂化物的DPPH清除率進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，當(dāng)相同樟樹籽油濃度作為基準(zhǔn)的條件下(0.50 g/mL)，樟樹籽油的DPPH清除率為(98.92±1.58)%，多酚組分的DPPH清除率為(49.60±3.78)%，不皂化物對(duì)DPPH清除率為(38.49±0.66)%，多酚類化合物的DPPH清除活性顯著高于不皂化物，多酚化合物和不皂化物對(duì)樟樹籽油DPPH清除能力的貢獻(xiàn)率分別為50.14%和38.90%，二者的貢獻(xiàn)率之和為89.04%，由此可見，樟樹籽油清除DPPH自由基的活性組分主要為多酚類化合物及不皂化物。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)研究了樟樹籽油抗氧化活性，測(cè)定了其抗氧化活性組分，樟樹籽油中多酚組分和不皂化物具有較好的DPPH自由基清除能力，二者對(duì)樟樹籽油DPPH自由基清除能力的總貢獻(xiàn)率高達(dá)89.04%，但針對(duì)樟樹籽油中多酚化合物及不皂化物的組成及其與樟樹籽油抗氧化活性的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。