譚 麗，謝 煜，陳洪達(dá)，王 寧*

(1.深圳市龍華區(qū)中心醫(yī)院，廣東 深圳 518110；2.廣東省中醫(yī)院，廣東 廣州 510120；3.中山大學(xué)附屬第七醫(yī)院，廣東 深圳 518107)

艾灸是傳統(tǒng)中醫(yī)藥外治法的一種，在防病治病方面已有數(shù)千年歷史，現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)艾灸可以提高機(jī)體免疫功能。臨床研究發(fā)現(xiàn)，艾灸足三里可以治療化療后骨髓抑制狀態(tài)[1-2]。骨髓抑制是腫瘤化療后常見的不良反應(yīng)，據(jù)統(tǒng)計(jì)80%患者在腫瘤化療過程中均會(huì)出現(xiàn)骨髓抑制，對免疫系統(tǒng)及造血功能影響最為明顯，其中白細(xì)胞減少最為突出，嚴(yán)重影響免疫系統(tǒng)功能，臨床常出現(xiàn)嚴(yán)重的感染、出血等癥狀[3]。改善化療后的骨髓抑制在治療腫瘤中具有積極作用。因此，本研究采用環(huán)磷酰胺(Cyclophosphamide，CTX)溶液建立穩(wěn)定的骨髓抑制模型[4-7]，選擇不同灸量的艾炷灸干預(yù)骨髓抑制大鼠模型，觀察其對大鼠模型外周血細(xì)胞及肝功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

SPF級SD 雄性大鼠30只(購于南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號：SCXK(粵)2016-0041)，體質(zhì)量為(200±20) g。將30只SD大鼠飼養(yǎng)于中國中醫(yī)院科學(xué)院廣東分院SPF級動(dòng)物房，室溫20～25 ℃，相對濕度50%～70%，飼養(yǎng)環(huán)境清潔、安靜。喂養(yǎng)7天后，采用SPSS軟件的隨機(jī)數(shù)生成功能將大鼠隨機(jī)分為5組，每組6只大鼠，即對照組、模型組、艾灸1組、艾灸2組、艾灸3組。對照組正常飼養(yǎng)，不予干預(yù)。

1.2 藥物及儀器

藥品：環(huán)磷酰胺：5 g/瓶(H20160467，公司：德國Baxter Oncology GmbH)；滅菌注射用水。溶液配制：稱取500 mg CTX，溶于50 mL滅菌注射用水，震蕩后完全溶解，配置成10 mg/mL的CTX溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。儀器：邁瑞獸用全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀，型號：BC-2800vet。艾絨：陳艾絨(35∶1)，250 g/包(北京國醫(yī)研醫(yī)藥技術(shù)開發(fā)有限公司，企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)：Q/DGYY 0001-2017)。

1.3 模型建立與干預(yù)

模型建立：模型組和艾灸組從造模開始，各組大鼠每天同一時(shí)間段行腹腔注射CTX溶液(劑量40 mg/kg)，1次/天，連續(xù) 5 天。根據(jù)前期研究，造模第5天骨髓抑制模型成立。當(dāng)模型建成后，采用原劑量減半(20 mg/kg)且隔天注射的方法，維持到造模第13天，停止藥物注射。

選穴與治療：大鼠穴位的選取根據(jù)《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》，足三里穴：位于大鼠后肢膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，腓骨小頭下約5 mm 處。為了保證每個(gè)艾炷的體積相當(dāng)，將艾炷做成直徑3 mm、高3 mm的圓錐形艾炷。將大鼠穴區(qū)1.5 cm×1.5 cm范圍內(nèi)的鼠毛剃掉，暴露皮膚。造模第6天開始艾灸，將做好的艾炷放置于施灸的穴位上，穴位上涂醫(yī)用凡士林，然后用線香點(diǎn)燃，待艾炷燃至大鼠掙扎時(shí)，用鑷子迅速更換艾炷，從左側(cè)足三里穴開始，再到右側(cè)足三里穴。艾灸1組每穴 3壯/次，艾灸2組每穴 6壯/次，艾灸3組每穴 9壯/次，每日1次，連續(xù)灸7天。

1.4 指標(biāo)采集及檢測

各組在造模第5、13天對大鼠尾巴用75%酒精消毒，進(jìn)行尾靜脈取血，棄掉第一滴血，然后滴入2支加有5%EDTA抗凝EP管，各收集1.5 mL，混勻后采用全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀對各組大鼠尾靜脈外周血中白細(xì)胞(White blood cell，WBC)、淋巴細(xì)胞(lymphocyte，Lym)、單核細(xì)胞(Monocyte，Mon)/中性粒細(xì)胞(Granulocyte，Gra)、紅細(xì)胞(Red blood cell，RBC)、血紅蛋白(Hemoglobin，Hb)、血小板(Platelet，PLT) 數(shù)量進(jìn)行檢測。另一支EP管中的血靜置2 h后，離心15 min，轉(zhuǎn)速為3 500 r/min。離心后取250 μL血清裝入凍存管，用ELISA法觀察大鼠谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Alanine aminotransferase，ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(Aspartate aminotransferase，AST)含量變化，了解造模及艾灸對肝臟的影響。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 造模完成后各組大鼠外周血細(xì)胞變化

造模完成后各組大鼠外周血WBC、Lym、Mon、Gra含量均低于對照組(P<0.05)，組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；各組大鼠外周血PLT均降低，其中艾灸1組、艾灸2組與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，模型組與艾灸3組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；外周血Hb均降低，其中艾灸1組與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1、表2。

表1 造模完成后各組大鼠外周血細(xì)胞含量比較

表2 造模完成后各組大鼠外周血PLT的Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)

2.2 艾灸治療后骨髓抑制大鼠模型外周血細(xì)胞含量變化

艾灸治療后，艾灸各組大鼠外周血WBC及Lym成上升趨勢，其中艾灸2組、艾灸3組的外周血WBC、Lym較模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，艾灸1組的外周血WBC、Lym與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；艾灸各組外周血Mon、Gra、PLT呈上升趨勢，但與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；治療后外周血RBC、Hb未見明顯上升。詳見表3。

表3 艾灸后各組大鼠外周血細(xì)胞含量的組間比較

2.3 骨髓抑制模型大鼠艾灸前后外周血細(xì)胞含量變化

艾灸治療后，艾灸1組大鼠外周血Mon的含量較治療前明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中外周血RBC、PLT較前有上升趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；艾灸2組的大鼠外周血WBC、Lym、Mon含量較治療前明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中外周血Gra、RBC、PLT較治療前上升，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；艾灸3組大鼠外周血WBC、Lym、PLT的含量較治療前明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中外周Mon、Gra較前有上升趨勢，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；模型組在造模第13天，大鼠外周血Hb較前下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其余指標(biāo)無差異。詳見表4。

表4 骨髓抑制模型大鼠艾灸前后外周血含量的獨(dú)立樣本檢驗(yàn)

2.4 艾灸對骨髓抑制模型大鼠肝功能的影響

艾灸治療后，模型組與對照組相比，大鼠血清ALT、AST均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；艾灸1組大鼠血清ALT、AST較模型組比均下降，其中AST含量與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；艾灸2組與艾灸3組大鼠的AST含量較對照組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而ALT含量較模型組下降，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表5和圖1。

表5 各組大鼠艾灸后血清ALT、AST含量變化

圖1 艾灸后各組大鼠外周血細(xì)胞組間比較

3 討論

CTX作為臨床中常用的烷化劑化療藥，在建立骨髓抑制模型方面主要因其效果穩(wěn)定、較易獲得、成本不高而廣泛推廣，而其造成的骨髓抑制的機(jī)制主要是通過破壞骨髓造血干細(xì)胞DNA，造成造血細(xì)胞的不規(guī)則壞死、凋亡，引起造血前體細(xì)胞的活性下降，出現(xiàn)骨髓抑制[8-10]。但停止造模后，模型組外周血可逐漸恢復(fù)正常。因此采用常規(guī)造模劑量結(jié)合維持劑量聯(lián)合造模才能保持模型的穩(wěn)定性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，常規(guī)40 mg/kg劑量結(jié)合20 mg/kg隔天維持劑量可以很好地維持模型的穩(wěn)定性，在造模第13天仍能維持與造模第5天同一水平的指標(biāo)，但Hb較剛開始造模有所下降，考慮與紅細(xì)胞凋亡時(shí)間較長有關(guān)。

艾灸作為一種中醫(yī)特色療法，具有溫陽散寒、活血化瘀、調(diào)和氣血、協(xié)調(diào)陰陽、扶正祛邪的作用，現(xiàn)廣泛應(yīng)用于臨床，主要包括直接灸(艾炷灸)和間接灸。而臨床中發(fā)現(xiàn)艾炷灸在治療化療后白細(xì)胞減少及改善患者生活質(zhì)量方面的效果要優(yōu)于其他灸法[11]。根據(jù)1985-2018年艾灸治療骨髓抑制的經(jīng)穴頻次分析，發(fā)現(xiàn)臨床使用頻次最高的穴位為足三里[12-13]。足三里穴為胃經(jīng)的合穴，屬“土穴”，能夠補(bǔ)益本經(jīng)的氣血，自古被認(rèn)為是補(bǔ)益的要穴，如《靈樞》：“陰陽俱有余，若俱不足，則有寒有熱。皆調(diào)于足三里”，《通玄指要賦》：“三里卻五勞之羸瘦”。可見足三里是治“虛勞”的要穴，不僅可以補(bǔ)益后天之本，促使氣血生化，更可益氣補(bǔ)虛，改善腫瘤患者的“本虛”狀態(tài)。因此本研究采用艾炷灸作為干預(yù)方法，足三里穴為施灸穴位。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，艾炷灸可以升高骨髓抑制模型大鼠外周血白細(xì)胞含量，主要以升高淋巴細(xì)胞為主，而且隨著艾炷的壯數(shù)增加，升高白細(xì)胞數(shù)量的差異越來越明顯。白細(xì)胞為機(jī)體中重要的免疫細(xì)胞，艾灸可明顯升高淋巴細(xì)胞，主要以T淋巴細(xì)胞為主，可調(diào)節(jié)外周血中CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞的含量，提高充分免疫應(yīng)答效應(yīng)[14-15]。相關(guān)研究表明[16-18]，艾灸可以通過促進(jìn)骨髓細(xì)胞周期蛋白以及修復(fù)基因的表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞 DNA 的合成，提高化療后骨髓基質(zhì)細(xì)胞支持造血的能力及血清集落刺激因子的活性，促使造血干/祖細(xì)胞增殖。而艾炷灸對皮膚的燒灼可以激發(fā)炎癥組織對熱休克蛋白(HSPs)的大量表達(dá)，進(jìn)而抑制IL-1、TNF-α等炎癥因子的表達(dá)[19-20]。因此，筆者認(rèn)為艾炷灸可能通過炎癥介導(dǎo)的相關(guān)機(jī)制激發(fā)免疫應(yīng)答、促進(jìn)骨髓造血細(xì)胞的增殖與遷移。

ALT、AST為評價(jià)肝細(xì)胞損傷的有效指標(biāo)，ALT與藥物中毒性肝細(xì)胞壞死相關(guān)。CTX在應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)可致肝損傷，表現(xiàn)為血清轉(zhuǎn)氨酶、膽紅素等指標(biāo)升高，其損傷機(jī)制可能與氧化應(yīng)激有關(guān)，主要降低正常小鼠超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶 (GSH-PX)的活力，升高丙二醛 (MDA)含量[21]。在骨髓抑制模型的建立中可以發(fā)現(xiàn)，肝臟ALT、AST含量均明顯升高，但經(jīng)艾炷灸治療后，ALT下降，而AST無明顯變化，由于AST主要分布于心肌，其次是肝臟、骨骼肌等組織中，說明艾炷灸并沒有加重肝細(xì)胞損傷，而且在一定程度上可減輕肝細(xì)胞損傷。

綜上所述，艾炷灸可以減輕CTX骨髓抑制大鼠模型的骨髓抑制狀態(tài)，以升高CTX骨髓抑制大鼠模型外周血WBC、Lym細(xì)胞的含量為主。在本實(shí)驗(yàn)中，艾炷灸的灸量與外周血細(xì)胞的升高存在一定的相關(guān)性，且在治療過程中艾炷灸未加重模型大鼠肝細(xì)胞損傷。