梁翠婷，劉 蘭，劉 繼，旦增頓珠，張勇倉*

(1.西藏大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，西藏 拉薩 850000；2．成都市農(nóng)林科學(xué)院，四川 成都 611130)

藏藥作為我國四大民族藥之首，發(fā)展至今已有兩千多年的歷史，藏藥因其獨特的用藥風(fēng)格及療效，深受人們信賴。藏藥品種豐富，據(jù)文獻記載共有植物藥2 685種，其中菌類50種，地衣類6種，苔蘚類5種，蕨類118種，裸子植物47種，3變種，被子植物1 895種，141變種，另有動物藥159種，礦物藥80余種[1-2]。盡管我國藏藥資源豐富，但近年來，隨著藏醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展，市場對藏藥的需求量逐漸增加，致使藏藥被無規(guī)劃地大量采挖，加之其生長環(huán)境地處高原，常年降雨量較少，氣溫低等原因，使得藏藥具有生長緩慢、資源量少、物種分布不均等特點，因此許多藏藥在市場上供不應(yīng)求，甚至成為瀕危物種。目前已有74種藏藥被列入《中國珍稀瀕危植物》，其中，一級瀕危藏藥11種，二級瀕危藏藥21種，三級瀕危藏藥42種[3-4]。因此，既保護好藏藥的現(xiàn)有資源，又能滿足市場需求就成為亟待解決的問題，針對這一情況，有學(xué)者提出了對藏藥資源進行定期普查、就地保護、建立藏藥種質(zhì)資源庫、開展人工種植、加強民眾對藏藥的保護意識等相關(guān)解決方法[4-5]。

植物組織培養(yǎng)指在無菌條件下，將植物的離體器官，如根、芽、莖、葉等外植體接入至培養(yǎng)基中，通過人為控制生長環(huán)境，對離體器官進行培養(yǎng)，外植體經(jīng)過脫分化、再分化、誘導(dǎo)生根形成完整植株的一系列過程。自1920年德國植物學(xué)家Haberlandt提出細胞具有全能性學(xué)說至今，植物組織培養(yǎng)技術(shù)已日趨成熟，并被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、花卉業(yè)、藥用植物等多個領(lǐng)域[6-7]，因該技術(shù)具有繁殖系數(shù)高，縮短育種周期，快速獲得目標物等優(yōu)點，無疑是解決當前瀕危藏藥資源短缺問題的有效手段[8]。近年來，植物組織培養(yǎng)技術(shù)在藏藥植物中的應(yīng)用日益增多，本研究從該技術(shù)在藏藥研究中的應(yīng)用、藏藥組織培養(yǎng)體系建立途徑、影響因素、存在問題等方面進行綜述，為今后藏藥的搶救性保護和可持續(xù)發(fā)展提供參考。

1 植物組織培養(yǎng)技術(shù)在藏藥研究中的應(yīng)用

1.1 通過組織培養(yǎng)技術(shù)獲得大量無菌植株

藏藥植物因長期適應(yīng)高寒缺氧環(huán)境，形成了種群更新較慢的特點，加之氣候復(fù)雜多變，環(huán)境荒漠化等使其生存環(huán)境易受到破壞，造成藏藥資源量減少的困境[9]，而組織培養(yǎng)技術(shù)具有繁殖系數(shù)高的優(yōu)點，可在一定程度上獲得大量植株[10]。澤仁旺姆對藏藥白花秦艽進行組織培養(yǎng)，篩選出最好的分化培養(yǎng)基，繁殖系數(shù)高達2 000[11]。楊爽等[12]以一級瀕危藏藥雞蛋參的嫩莖為實驗材料發(fā)現(xiàn)，當添加ZT(玉米素)的濃度為2.0 mg/L時，雞蛋參腋芽的增殖系數(shù)達到4.86，在繼續(xù)添加了NAA 0.05 mg/L，ZT 1.0 mg/L的培養(yǎng)基中對腋芽進行培養(yǎng)，此時無菌苗增殖系數(shù)達到了5.44。曾鈺婷等[13]在螃蟹甲的組織培養(yǎng)研究中發(fā)現(xiàn)，螃蟹甲的無菌苗在添加了不同濃度的6-BA培養(yǎng)基中培養(yǎng)，單株植株可分化出3～7個植株，進一步誘導(dǎo)生根可獲得生長健康的完整植株。這些研究為緩解藏藥資源的稀缺狀況奠定了一定基礎(chǔ)。

1.2 通過組織培養(yǎng)技術(shù)獲得活性成分

藏藥材的活性成分種類豐富，但在整體植株中的占比較少，且很多藏藥材資源量稀少，因而從保護性開發(fā)角度看，提高藏藥材中活性成分無疑是保護藏藥的又一有效途徑[5]。近年來，眾多科研人員致力于提高藏藥材的活性成分，王莉等[14]以林芝地區(qū)的長鞭紅景天為材料研究發(fā)現(xiàn)，以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加6-BA 5.0 mg/L，2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸) 0.1 mg/L的條件最適宜長鞭紅景天細胞生物量的生長，以及次生代謝物的合成。郭志剛等[15]先采用固體培養(yǎng)基誘導(dǎo)藏紅花愈傷組織，再將愈傷組織轉(zhuǎn)移至液體培養(yǎng)基中快速合成藏紅花素，該方法克服了愈傷組織形成過程中，藏紅花素抑制細胞生長的缺點，又實現(xiàn)了藏紅花素的快速生物合成。研究發(fā)現(xiàn)，通過添加殼聚糖、殼寡糖、茉莉酸甲酯、水楊酸等對藏紅花中藏紅花素合成的影響發(fā)現(xiàn)，添加了100 μmol/L的茉莉酸甲酯組藏紅花素的含量達到28.57 mg(1 g干細胞計)[16]。

2 藏藥組織培養(yǎng)體系建立途徑

2.1 間接器官發(fā)生途徑

間接器官發(fā)生指通過對外植體進行愈傷組織誘導(dǎo)，再經(jīng)過脫分化形成不定芽，通過不定芽的增殖，進一步誘導(dǎo)生根，馴化形成完整植株的過程[17-18]。瀕危藏藥自身材料較難獲得，而間接器官的發(fā)生途徑不局限于某個外植體，可選任何組織進行培養(yǎng)誘導(dǎo)，這極大降低了取材困難程度，因此在瀕危藏藥組織培養(yǎng)中，多數(shù)以間接器官進行培養(yǎng)。李展等[19]通過以藏藥纖毛婆婆納的頂芽為材料，MS為培養(yǎng)基，在添加6-BA 0.5 mg/L和NAA 1 mg/L時纖毛婆婆納愈傷組織誘導(dǎo)率達95%。李茜茹等[20]在當藥的組織培養(yǎng)中，以嫩芽為外植體，MS為培養(yǎng)基，通過添加ZT 0.3 mg/L、2，4-D 2.1 mg/L，愈傷組織誘導(dǎo)率達83%。陳序昉等[21]以多刺綠絨蒿的嫩葉為外植體，以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加NAA 0.1 mg/L和6-BA 1 mg/L為誘導(dǎo)多刺綠絨蒿愈傷組織的最適宜組合?；酐愒频萚22]以高寒藏藥白花假龍膽的胚軸、幼葉及未成熟種子為外植體誘導(dǎo)愈傷組織發(fā)現(xiàn)，添加了2，4-D 3.0 mg/L和KT 0.5 mg/L的MS培養(yǎng)基中愈傷誘導(dǎo)率達到最高，將愈傷組織進行繼代培養(yǎng)，再經(jīng)過誘導(dǎo)生根等可獲得無菌苗。

2.2 直接器官發(fā)生途徑

直接器官發(fā)生是通過對具有生長點的外植體進行誘導(dǎo)，直接形成不定芽，不經(jīng)過脫分化形成愈傷組織的步驟。直接器官發(fā)生建立組織培養(yǎng)體系較快，可直接獲得不定芽，通過不定芽的增殖，達到組織培養(yǎng)過程中增殖系數(shù)倍增的目的[17]。畢麗偉等[23]以雞蛋參的莖段為外植體，1/2 MS為基本培養(yǎng)基，通過添加6-BA 0.5 mg/L和IBA 0.2 mg/L直接誘導(dǎo)出芽，再接入生根培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根，從而獲得雞蛋參的無菌苗。澤仁旺姆等[24]以拉薩奪底溝的藏紫草莖尖為材料，在MS培養(yǎng)基中添加了6-BA 0.5 mg/L與IBA 0.5 mg/L，此時藏紫草的不定芽增殖系數(shù)為5，再對不定芽進行繼代和生根培養(yǎng)，可獲得藏紫草的完整植株。徐文華等[25]以馬尿泡芽為外植體，在MS培養(yǎng)基中添加6-BA 2 mg/L和NAA 1 mg/L時芽的分化率為100%，繼續(xù)進行生根培養(yǎng)即獲得完整植株。

3 藏藥組織培養(yǎng)體系建立的影響因素

3.1 外植體選擇

不同植物所選擇的外植體部位有所不同，外植體是否誘導(dǎo)成功，是組織培養(yǎng)能否順利進行的關(guān)鍵。徐文華等[26]在對唐古特大黃進行組織培養(yǎng)的研究中發(fā)現(xiàn)，唐古特大黃的子葉、下胚軸、胚根和幼根均可進行分化。鐘世浚等[27]在添加了ZT的MS培養(yǎng)基中對紅花龍膽的葉片及帶節(jié)莖段進行篩選，發(fā)現(xiàn)白花龍膽的葉片嚴重褐化，但帶節(jié)莖段則可進行增殖產(chǎn)生不定芽。王慧春等[28]對瀕危藏藥獨一味進行了組織培養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn)，在以嫩芽、子葉、幼根為外植體時，幼根在添加了2，4-D 1.0 mg/L、6-BA 0.5 mg/L、NAA 0.5 mg/L的MS培養(yǎng)基中的誘導(dǎo)率高達93.5%。作者對現(xiàn)有文獻進行了整理，將藏藥中常用外植體的部位，以及所需的培養(yǎng)基與激素種類歸納見表1。

表1 外植體類型及培養(yǎng)條件

3.2 消毒方法

雖已有研究人員進行了開放式培養(yǎng)研究，但絕大多數(shù)植物組織培養(yǎng)仍需無菌條件。而藏藥的生存環(huán)境復(fù)雜，一般在野外獲取，通常攜帶有大量的微生物或內(nèi)生菌，如何將外植體攜帶的病原微生物清除干凈，是組織培養(yǎng)的關(guān)鍵，綜合相關(guān)文獻看，常用的消毒劑主要為次氯酸鈉、氯化汞等溶液。一般步驟為先在流水下將野外獲得的植物外植體所帶雜質(zhì)清洗干凈，再在無菌條件下用75%乙醇進行30～60 s消毒，無菌水沖洗3～5次，最后用氯化汞、次氯酸鈉等消毒劑對外植體進行消毒處理，以無菌水沖洗干凈。對于較難消毒的外植體，采用聯(lián)合消毒的方法可取得較好的除菌效果，如在消毒劑中加入吐溫，可增加消毒劑與外植體表面接觸的概率，使消毒更徹底[28，32，36]。研究發(fā)現(xiàn)，在常規(guī)滅菌前用紫外線照射，可明顯降低污染率。藏藥的組織培養(yǎng)中常用消毒劑及消毒時間見表2。

表2 消毒劑類型

3.3 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)時外植體的主要營養(yǎng)來源，培養(yǎng)基成分為大量元素、微量元素、鐵鹽元素及有機物，常用的培養(yǎng)基有MS、1/2 MS、1/4 MS、B5、White等，其成分與細胞生長速度關(guān)系密切，如Manuhara等[41]發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中添加蔗糖相較于對照組，可加速細胞的生長速度，而適當添加氮源則有利于植物中生物量的積累[42]。對現(xiàn)有藏藥組織培養(yǎng)文獻進行歸納發(fā)現(xiàn)，藏藥的組織培養(yǎng)在誘導(dǎo)愈傷組織及叢芽分化時期，通常以MS培養(yǎng)基為主，在誘導(dǎo)生根時期以1/2 MS為主(見表3)。在植物組織培養(yǎng)中，激素的種類和配比與外植體的生長方向、生理反應(yīng)及生長分化有關(guān)[17]，藏藥組織培養(yǎng)中常用的激素類型有6-BA、NAA、KT、IBA等?，F(xiàn)將部分瀕危藏藥組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件歸納如表3所示。光照、溫度、pH等與植物細胞的生長及次生代謝的合成關(guān)系密切，也可在一定程度上影響細胞的生物積累量[43-44]。

表3 部分瀕危藏藥植物離體培養(yǎng)條件

3.4 內(nèi)生菌

在某些藏藥的組織培養(yǎng)中，內(nèi)生菌除了起促進種子萌發(fā)的作用外，還在植物器官的形成中發(fā)揮著重要作用，如蘭科植物，其種子缺乏胚乳等萌發(fā)所需的營養(yǎng)物質(zhì)，只有在合適的菌種侵染下才有可能萌發(fā)[52]。GAO Y等[53]在瀕危蘭科藏藥手掌參的根系中分離出了角擔菌屬菌株，將其與手掌參種子共同培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，23 d后種子突破種皮形成原球莖，而沒有角擔菌參與共培養(yǎng)的手掌參種子始終未萌發(fā)，其原因在于手掌參種子通過消化角擔菌的菌絲獲得營養(yǎng)以供萌發(fā)生長。天麻也為珍貴的蘭科藥用植物，其種子的萌發(fā)亦需要菌株參與。1980年，研究人員首次分離出有助于天麻種子萌發(fā)的菌株“京陜807-02號”，接著又連續(xù)分出對天麻萌發(fā)有影響的12種擔子菌小菇屬真菌菌株[54]，這為西藏天麻的人工快速繁育提供了一定理論依據(jù)。童文君[55]從野生美花石斛根、莖、葉分離得到14株生真菌與67株內(nèi)生細菌，發(fā)現(xiàn)這些菌株具有解無機磷和解有機磷、解鉀及產(chǎn)生長素的能力；將一株兼具三種促生長特性的芽孢桿菌DLB20作用于不同株高美花石斛組培苗中發(fā)現(xiàn)，當接種濃度為106 cfu/mL時更有利于組培苗的生根，這表明此菌株有一定的促進美花石斛組培苗生長的潛力。因此，內(nèi)生菌也成為一些藏藥組織培養(yǎng)的重要影響因素。

4 藏藥組織培養(yǎng)存在的問題

4.1 外植體較難獲取

西藏地域遼闊，氣候復(fù)雜，造就了豐富的藏藥資源物種，但其生態(tài)環(huán)境易受破壞且不易恢復(fù)，因而藏藥資源更加珍稀[5]，同時也加大了采藥難度，如冬蟲夏草等瀕危物種采挖極其困難，且只有在國家規(guī)劃許可條件下方可進行采收；手掌參繁殖方式主要為無性繁殖，繁殖系數(shù)極低，自然更新緩慢，野生資源易遭到破壞，加之從可采收至枯萎的時間僅幾個月，采集可進行組織培養(yǎng)的外植體則極為困難[56]。

4.2 褐化

褐化指在組織培養(yǎng)的過程中，酚類物質(zhì)氧化成褐色的醌類物質(zhì)，形成的醌類物質(zhì)抑制酶活性，愈傷組織形成受阻，進一步使外植體褐化死亡[57]。植物的褐化與自身的基因型、外植體的生理狀態(tài)、培養(yǎng)基的種類等息息相關(guān)[58-59]。楊爽等[60]以瀕危藏藥手掌參芽部為試驗材料，探究了消毒時間、活性炭濃度、Vc(維生素C)使用方法、暗培養(yǎng)時間等因素對手掌參外植體褐化的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，75%酒精消毒20 s，0.1%氯化汞消毒10 min，Ac(活性炭)1.0 g/L，Vc 2.0 mg/L，先暗培養(yǎng)5～10 d，每3 d轉(zhuǎn)瓶一次，2 000 Lx光照下培養(yǎng)時，手掌參的褐化程度最低。袁麗紅等[61]以藏紅花的球莖、無菌芽和幼葉為外植體進行組織培養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn)，球莖的褐化率最低，且連續(xù)轉(zhuǎn)瓶可降低褐化程度。葉耀輝等[50]在桃兒七的組織培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，通過添加活性炭、聚乙烯吡咯烷酮和Vc均可減少褐化，在早期添加 Ac1 g/L，后期添加 PVP(聚乙烯吡咯烷酮)1 g/L 的組合培養(yǎng)下，褐化程度最低。

4.3 污染

外植體的污染常與外植體自身攜帶的病原菌，以及實驗人員不規(guī)范的操作有關(guān)[62]。常見污染為細菌污染、真菌污染、病毒污染[63]及植物自身所帶的內(nèi)生菌污染。細菌污染可通過添加慶大霉素、先鋒霉素、氯霉素等殺菌劑抑制細菌生長。真菌污染可在外植體消毒處理時選擇合適的消毒劑，如漂白粉、氯化汞、過氧化氫、次氯酸納等加以解決。在使用真菌和細菌抑菌劑時均需考慮是否對外植體的生長產(chǎn)生影響，劉蘭等[30]在對瀕危藏藥喜馬拉雅紫茉莉的組織培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中添加50 mg/L多菌靈可抑制真菌生長，添加25 mg/L青霉素可抑制細菌生長，且這些濃度下的抑菌劑對外植體的生長無不良影響。植物的內(nèi)生菌可存在于植株的所有部位，其在植物的生長過程中具有增強宿主抗逆性和抗病害等作用[64]。在某些植物的組織培養(yǎng)過程中，內(nèi)生菌的存在使外植體常出現(xiàn)增殖率低、生長緩慢、玻璃化嚴重等問題[65]，而手掌參、天麻、桃兒七等多種藏藥的生長又依賴內(nèi)生菌，如何合理解決內(nèi)生菌的污染與生長依賴問題，對于此類藏藥的組織培養(yǎng)成功與否至關(guān)重要。

4.4 煉苗馴化困難

在植物組織培養(yǎng)過程中，煉苗決定著植株是否能適應(yīng)人工氣候箱外的自然環(huán)境。徐元江等[40]對藏藥匙葉翼首草芽與根莖進行了組織培養(yǎng)和快繁方面的研究，選取生長健壯的苗株，打開瓶口煉苗3 d，取出無菌苗洗凈根部培養(yǎng)基，分別種植于3種栽培基質(zhì)(蛭石：珍珠巖；蛭石：腐殖土：珍珠巖；蛭石：菜園土：珍珠巖)，研究發(fā)現(xiàn)翼首草再生苗煉苗與移栽過程可通過控制水分，添加抗菌劑如多菌靈等方法增加存活概率。在藏藥的組織培養(yǎng)中，應(yīng)注意藏藥的生活習(xí)性特點，盡量使藏藥的組培苗培養(yǎng)生長環(huán)境與自然環(huán)境接近，以適應(yīng)西藏特殊的氣候環(huán)境[66]。

5 結(jié)論與展望

綜上，目前藏藥植物組織培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用可在短期內(nèi)獲得大量無菌植株，可一定程度解決藏藥資源量瓶頸問題，并可能定向獲得較大量的目標活性成分[67]。藏藥取得外植體后需要進行合適的消毒處理，既需考慮徹底滅菌，也應(yīng)兼顧對外植體存活率及生長狀態(tài)的影響。藏藥組織培養(yǎng)中常用MS培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷組織、叢芽增殖等，以1/2 MS誘導(dǎo)植株生根。常用的激素有 6-BA，NAA，KT，IBA等。不同藏藥培養(yǎng)的光照條件、溫度及pH也不盡相同，需根據(jù)不同植物加以調(diào)整。在藏藥的組織培養(yǎng)中還存在取材較困難、褐化及污染等問題。內(nèi)生菌的存在影響藏藥材在組織培養(yǎng)中的繁殖率，存活率同時又是部分藏藥種子萌發(fā)的必要條件，需權(quán)衡解決。多種藏藥已建立起完整的離體培養(yǎng)體系，植物組織培養(yǎng)技術(shù)在藏藥保護中的應(yīng)用日益成熟，但藏藥組培苗如何煉苗馴化，以更好地適應(yīng)人工氣候箱外的環(huán)境，應(yīng)是重點考慮的問題之一，此外組織培養(yǎng)與野生藏藥活性成分的差別也值得關(guān)注。隨著組織培養(yǎng)技術(shù)的不斷發(fā)展，必定可以有效緩解當下藏藥資源稀缺的問題，推動藏藥向著可持續(xù)、產(chǎn)業(yè)化、規(guī)?；较虬l(fā)展。