黃立龍，魏 珩，王秋緣，劉春明，劉劍鋒，程云清

(1.吉林師范大學(xué)吉林省植物資源科學(xué)與綠色生產(chǎn)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 四平136000；2.吉林師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林 四平136000)

榛子(Corylusspp.)屬于樺木科(Betulaceae)榛屬(CorylusL.)，是重要的經(jīng)濟(jì)林木.隨著我國(guó)退耕還林政策的實(shí)施推廣，榛子已經(jīng)成為山區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的優(yōu)勢(shì)樹(shù)種.榛子種仁可直接食用或制成榛子油、榛子醬及利口酒等加工食品[1-2].榛子的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值主要來(lái)自于種仁.榛子種仁是否飽滿(mǎn)與胚珠發(fā)育過(guò)程是否能順利進(jìn)行具有直接關(guān)系，而在實(shí)際種植中，榛子的胚珠發(fā)育障礙問(wèn)題普遍存在，導(dǎo)致種仁干癟和空殼現(xiàn)象，造成種仁營(yíng)養(yǎng)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值的損失[3].因此，深入了解榛子花果發(fā)育尤其是胚珠發(fā)育的分子機(jī)制，對(duì)于改良榛子種質(zhì)，提升質(zhì)量、提高產(chǎn)量具有重要意義.

生長(zhǎng)素(auxin)是植物生長(zhǎng)發(fā)育中的一種核心調(diào)控激素，在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和生殖生長(zhǎng)過(guò)程中具有重要調(diào)節(jié)作用.生長(zhǎng)素反應(yīng)因子(auxin response factor，ARF)通過(guò)與生長(zhǎng)素/吲哚-3-乙酸(auxin/indole-3-acetic acid，AUX/IAA)相互作用實(shí)現(xiàn)對(duì)生長(zhǎng)素的響應(yīng)和信號(hào)調(diào)控，是調(diào)控下游響應(yīng)基因的重要轉(zhuǎn)錄因子[4-5].ARFs的功能研究在模式植物擬南芥(Arabidopsisthaliana)中比較成熟，參與花果發(fā)育(AtARF1/2/3/5/6/8/17)[6-8]、葉片生長(zhǎng)(AtARF3/4)[9]、根系生長(zhǎng)(AtARF7/10/16/19)[10-11]和種子發(fā)育(AtARF12/13/14/15/10/21/22)[10]等多種過(guò)程[12]，其中AtARF1/2在花的發(fā)端和衰老過(guò)程中具有重要作用[6].同時(shí)ARFs在植物抗逆境脅迫的調(diào)控中也扮演重要角色[13-14].目前，在對(duì)榛子進(jìn)行的相關(guān)研究中，未見(jiàn)關(guān)于A(yíng)RFs參與胚珠發(fā)育乃至花果發(fā)育的報(bào)道.本文通過(guò)對(duì)前期研究[15]的榛子胚珠發(fā)育轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)了1個(gè)顯著差異表達(dá)ARF同源基因，命名為ChARF1，通過(guò)構(gòu)建原核表達(dá)載體獲得了ChARF1(N-380)多克隆抗體，為了解ChARF1基因在榛子胚珠發(fā)育中的作用提供了檢測(cè)材料，研究結(jié)果可為進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)ARFs在榛子花果發(fā)育中的功能機(jī)制奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 樣品采集

實(shí)驗(yàn)材料為平歐雜交榛(Corylusheterophylla×C.avellana)，種植于吉林省四平市伊通滿(mǎn)族自治縣榛園，品種為“達(dá)維”，樹(shù)齡12年，株高3.0～3.5 m.2019年，收集榛子品種“薄殼紅”花粉并參照本實(shí)驗(yàn)室的研究方法人工授粉[3].于同年8月20日(授粉后120 d)，采集果實(shí)并現(xiàn)場(chǎng)解剖，取成熟期胚珠置液氮中，轉(zhuǎn)至實(shí)驗(yàn)室后超低溫冰箱-80℃保存[15].

1.2 基因篩選及克隆

以前期榛子胚珠發(fā)育4個(gè)時(shí)期(Ov1：胚珠形成期，Ov2：早期胚珠生長(zhǎng)期，Ov3：胚珠快速生長(zhǎng)期和Ov4：胚珠成熟期)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)[15]為基礎(chǔ)，篩選差異表達(dá)基因.相對(duì)表達(dá)量以FPKM值(Fragments per kilobase of transcript per million fragments mapped)為指標(biāo)，篩選標(biāo)準(zhǔn)：|log2(倍數(shù)變化)|>1且錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率<0.05.使用SPSS 8.0 方差分析程序進(jìn)行差異顯著性分析(3次生物學(xué)重復(fù)).使用Primer Premier 5.0平臺(tái)設(shè)計(jì)CDS全長(zhǎng)序列引物(F：5′-AGAGAGATGAGTAGTGTTGG-3′，R：5′-ATTGGAATCTAATAGGGATT-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度2 129 bp).樣品總RNA提取和檢測(cè)參考Liu 等[15]的方法.以純度和濃度符合標(biāo)準(zhǔn)的總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈，參照SuperScriptTMIV第一鏈合成系統(tǒng)試劑盒(Invitrogen，USA，18091050)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作.使用設(shè)計(jì)的引物以cDNA為模板擴(kuò)增篩選基因，純化后以T4DNA連接酶(寶生物工程有限公司，大連，2040A)連接至pMD18-T載體(寶生物工程有限公司，大連，D103A)并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α(唯地生物技術(shù)有限公司，上海，DL1001).提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒留存并送上海生工有限公司測(cè)序.

1.3 基因鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析

測(cè)序所得序列在NCBI(nucleotide collection nr/nt)和番茄數(shù)據(jù)庫(kù)(https:∥phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)進(jìn)行比對(duì)查找同源序列.序列翻譯為蛋白后，使用NCBI保守序列數(shù)據(jù)庫(kù)CDD(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi)和Pfam(http:∥pfam.sanger.ac.uk/)驗(yàn)證序列的保守結(jié)構(gòu)域[16]，隨后通過(guò)DNAMAN 9.0.1軟件進(jìn)行結(jié)構(gòu)域比對(duì)并作圖.使用在線(xiàn)工具ProtParam[17](https:∥web.expasy.org/protparam/)預(yù)測(cè)蛋白相對(duì)分子質(zhì)量.將比對(duì)得到的同源序列以及Tair(https:∥www.arabidopsis.org/)網(wǎng)站下載的擬南芥編碼序列(Coding sequence，CDS)通過(guò)MEGA 7.0[18]軟件構(gòu)建最大似然(maximum likelihood，ML)樹(shù)，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析[19].

1.4 原核表達(dá)載體構(gòu)建及誘導(dǎo)表達(dá)

將包含目的基因的pMD18-T重組質(zhì)粒送至武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司構(gòu)建原核表達(dá)載體并制備多克隆抗體.以重組質(zhì)粒為模板PCR擴(kuò)增目的基因N端特異性片段，純化克隆至pET-28a-SUMO載體(含His-標(biāo)簽，T7-標(biāo)簽，SUMO-標(biāo)簽，相對(duì)分子質(zhì)量約18 000).經(jīng)PCR和測(cè)序鑒定后，提取陽(yáng)性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliRosetta菌株.將陽(yáng)性單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)至D(600)=0.5～0.6.設(shè)實(shí)驗(yàn)組：加入0.8 mmol/L IPTG，37 ℃誘導(dǎo)4 h；對(duì)照組：加入等量無(wú)菌水.收集少量菌液進(jìn)行抗原蛋白表達(dá)SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)檢測(cè).驗(yàn)證表達(dá)成功后，將剩余菌液離心重懸并用超聲波破碎，離心并分離上清和沉淀.使用2和8 mol/L尿素溶解沉淀中的包涵體，期間取上清和溶解包涵體進(jìn)行抗原蛋白可溶性SDS-PAGE檢測(cè).相同條件下進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)，收集包涵體蛋白，使用組氨酸標(biāo)簽蛋白純化試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司，上海)純化后進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)和濃度測(cè)定.

1.5 抗體制備和純化及蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)

將純化后的抗原蛋白分5次免疫兩只實(shí)驗(yàn)級(jí)雄性日本大耳白兔，具體流程見(jiàn)表1.酶聯(lián)免疫效價(jià)檢測(cè)：設(shè)空白對(duì)照；陰性對(duì)照：免疫前抽取兔耳靜脈血清；陽(yáng)性實(shí)驗(yàn)：第52天抽取兔頸部抗血清.酶標(biāo)板每孔加入200 ng純化抗原蛋白和不同稀釋濃度 (體積比為1∶1 000～1∶512 000) 的抗血清，加入二抗進(jìn)行顯色反應(yīng)，檢測(cè)D(450)進(jìn)行效價(jià)分析.構(gòu)建抗原蛋白與瓊脂糖耦連的抗原親和純化層析柱，抗血清上樣洗脫后得到純化濃縮抗體.以ChARF1(N-380)蛋白作抗原，分別取500 pg，10 ng進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳.抗體1∶1 000(體積比)倍稀釋后做蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)[20].

表1 免疫流程

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的鑒定與進(jìn)化分析

通過(guò)對(duì)比轉(zhuǎn)錄組[15]中胚珠4個(gè)時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量(FPKM值)，發(fā)現(xiàn)1個(gè)Ov4顯著上調(diào)表達(dá)基因(unigene)g22071(P<0.05，見(jiàn)圖1A).該基因CDS長(zhǎng)度為2 115 bp，編碼704個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)編碼蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為78 770.通過(guò)核苷酸序列比對(duì)程序篩選同源序列以及保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)該基因同源聚類(lèi)于胡桃(Juglansregia，XM_035695460.1)、闊葉櫟(Quercuslobata，XM_031092776.1)、歐洲栓皮櫟(Quercussuber，XM_024058295.1)和扁桃(Prunusdulcise，XM_034371489.1)，參考ARF基因序列(E=0，重合率(identity)>75%)，顯著匹配Auxin_resp(pfam06507)、B3(pfam02362)和不顯著匹配AUX_IAA(CL0072)結(jié)構(gòu)域[4]見(jiàn)圖1B，鑒定g22071屬于A(yíng)RF基因家族，命名為ChARF1(Genbank登錄號(hào)：MW369441).

A：g22071基因表達(dá)分析.相對(duì)表達(dá)量以FPKM值為標(biāo)準(zhǔn)；a—c表示差異表達(dá)顯著水平，P<0.05.B：保守結(jié)構(gòu)域分析.C：系統(tǒng)發(fā)育分析.AtARF1-23，擬南芥(Arabidopsis thaliana)；ChARF1，榛子(Corylus heterophylla × C.avellana)；SlARF2，番茄(Solanum lycopersicum)；XM_035695460.1，胡桃(Juglans regia)；XM_031092776.1，闊葉櫟(Quercus lobata)；XM_024058295.1，歐洲栓皮櫟(Quercus suber)；KP185306.1，梅(Prunus mume)；XM_034371489.1，扁桃(Prunus dulcise)；XM_021804856.1，橡膠樹(shù)(Hevea brasiliensis).

將ChARF1及核苷酸序列比對(duì)獲得的同源序列和模式植物擬南芥ARF基因家族共31條序列構(gòu)建ML進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果(見(jiàn)圖1C)顯示，31條不同物種的ARFs聚類(lèi)為4個(gè)進(jìn)化分枝(Ⅰ—Ⅳ).ChARF1基因與胡桃、闊葉櫟等的ARFs以及擬南芥AtARF1/2、番茄SlARF2基因聚類(lèi)于分枝Ⅰ.在分枝Ⅰ內(nèi)，ChARF1基因與胡桃的ARF(XM_035695460.1)同源性最高，而與已報(bào)道的擬南芥AtARF1/2基因[6-8]和番茄SlARF2基因[21]同源關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn).擬南芥AtARF3-23基因則聚類(lèi)于Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ分支.

2.2 原核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)

選擇ChARF1基因序列N端包含Auxin_resp和B3保守結(jié)構(gòu)域(見(jiàn)圖1B)的前380個(gè)氨基酸為抗原特異性片段，以測(cè)序正確的pMD18-T-ChARF1質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)產(chǎn)物大小正確(見(jiàn)圖2A).構(gòu)建pET-28a-SUMO-ChARF1(N-380)重組載體后，測(cè)序鑒定結(jié)果顯示目的片段成功克隆至重組載體，載體構(gòu)建成功.

A：PCR擴(kuò)增結(jié)果.1：Marker(相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn))，2：ChARF1(N-380).B：蛋白表達(dá)檢測(cè).1：0.4 mg/mL 牛血清白蛋白，2：Maker，3：pET-28a-SUMO-ChARF1(N-380)未誘導(dǎo)表達(dá)，4：pET-28a-SUMO-ChARF1(N-380)誘導(dǎo)表達(dá)，5：pET-28a-SUMO-ChARF1(N-380)誘導(dǎo)表達(dá).C：可溶性檢測(cè).1：0.4 mg/mL 牛血清白蛋白，2：Marker，3：上清，4：上清2(2 mol/L尿素溶解)，5：包涵體2倍稀釋(8 mol/L尿素溶解)，6：包涵體5倍稀釋(8 mol/L尿素溶解).D：純化檢測(cè).1：0.4 mg/mL 牛血清白蛋白，2：Marker，3：包涵體10倍稀釋(8 mol/L尿素溶解)，4：包涵體20倍稀釋(8 mol/L尿素溶解).

將陽(yáng)性pET-28a-SUMO-ChARF1(N-380)載體轉(zhuǎn)化至E.coliRosetta菌株進(jìn)行表達(dá).完整的ChARF1蛋白相對(duì)分子質(zhì)量大小推測(cè)為78 770，而ChARF1(N-380)相對(duì)分子質(zhì)量推測(cè)為43 000.重組蛋白融合了相對(duì)分子質(zhì)量為18 000的His-標(biāo)簽、T7-標(biāo)簽、SUMO-標(biāo)簽，實(shí)際表達(dá)產(chǎn)物預(yù)期相對(duì)分子質(zhì)量高于61 000.聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，在相對(duì)分子質(zhì)量為66 000的條帶處可觀(guān)察到特異性條帶(見(jiàn)圖2B)，符合預(yù)期大小，表明ChARF1(N-380)在E.coliRosetta菌株中成功表達(dá).

2.3 抗原蛋白的可溶性檢測(cè)及純化

經(jīng)超聲波破菌后，取上清和沉淀進(jìn)行ChARF1(N-380)抗原蛋白可溶性檢測(cè)，結(jié)果(見(jiàn)圖2C)顯示在相對(duì)分子質(zhì)量為66 000處，上清及上清2(2 mol/L尿素溶解包涵體)，條帶不清晰；而在沉淀中，通過(guò)使用8 mol/L尿素溶解包涵體，可觀(guān)察到明顯的條帶.表明ChARF1(N-380)抗原蛋白表達(dá)主要在包涵體中，具有不溶性.

抗原蛋白ChARF1(N-380)具有6個(gè)氨基酸的His-標(biāo)簽，可使用His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒純化.純化前非特異性條帶較多(見(jiàn)圖2C)；純化后非特異性條帶基本消失，在相對(duì)分子質(zhì)量為66 000處抗原蛋白條帶清晰(見(jiàn)圖2D).依據(jù)BSA蛋白條帶進(jìn)行蛋白濃度估算約為12 mg/mL，包涵體20倍稀釋液仍可觀(guān)察到明顯條帶.結(jié)果證明，ChARF1(N-380)抗原蛋白的純度和濃度已經(jīng)達(dá)到免疫要求.

2.4 多克隆抗體的制備及效價(jià)分析

將純化后ChARF1(N-380)抗原蛋白免疫2只雄性日本大耳白兔，獲得E7200和E7201抗血清.對(duì)抗血清進(jìn)行酶聯(lián)免疫效價(jià)檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表2.在不同稀釋濃度下，E7200和E7201血清中抗體與抗原蛋白發(fā)生了特異性結(jié)合，顯色反應(yīng)明顯.根據(jù)(D陽(yáng)性-D空白)/(D陰性-D空白)>2.1標(biāo)準(zhǔn)，E7200和E7201抗血清效價(jià)皆可達(dá)到1∶512 000.

表2 ChARF1(N-380)抗血清ELISA效價(jià)檢測(cè)

2.5 多克隆抗體的純化及WB檢測(cè)

親和純化用蛋白ChARF1(N-380)經(jīng)檢測(cè)濃度為4 mg/mL，與破菌純化后的濃度和純度差異不大，可進(jìn)行抗原親和純化.親和純化得到抗體E7200和E7201，濃度分別為4.09，4.67 mg/mL.將抗體稀釋(體積比為1∶1 000)后進(jìn)行WB檢測(cè)，抗體E7200和E7201檢測(cè)抗原印記在相對(duì)分子質(zhì)量為67 000左右，隨抗原上樣量減少印記變淺，最低可檢測(cè)到500 pg抗原(見(jiàn)圖3A，B).抗體E7200和E7201濃度正常，能夠特異性檢測(cè)ChARF1(N-380)抗原蛋白.

圖3 ChARF1(N-380)抗體的蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)

3 討論

生長(zhǎng)素在植物花果發(fā)育過(guò)程中扮演重要角色.ARFs作為重要的轉(zhuǎn)錄因子可直接與下游靶基因結(jié)合并激活或抑制靶基因在花果發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)，從而影響植物的生殖生長(zhǎng)[22-23].在本文的研究中，榛子ChARF1基因表達(dá)水平從Ov2期開(kāi)始隨著胚珠的發(fā)育逐步上升，在Ov4期達(dá)到最大，推測(cè)ChARF1基因在胚珠發(fā)育過(guò)程中具有正調(diào)控作用.系統(tǒng)發(fā)育分析表明，榛子ChARF1基因與胡桃JrARF基因(XM_035695460.1)高度同源(見(jiàn)圖1B)，二者同為可食用干果，種仁含油量較高.其他比對(duì)到的同源序列涉及闊葉櫟、歐洲栓皮櫟和扁桃等，則為干果類(lèi)林木.目前同源性高的匹配序列多為預(yù)測(cè)參考序列，未見(jiàn)相關(guān)的功能研究的報(bào)道，通過(guò)對(duì)榛子ChARF1基因與胚珠發(fā)育的研究，將有助于加深對(duì)此類(lèi)植物胚珠發(fā)育機(jī)制的理解.此外，ChARF1基因與擬南芥ARFs基因家族的AtARF1/2基因、番茄SlARF2基因聚類(lèi)于進(jìn)化分枝Ⅰ(見(jiàn)圖1B)，AtARF1/2基因影響花的發(fā)端和衰老，二者在部分功能上存在冗余，AtARF2基因還具有獨(dú)立于乙烯和細(xì)胞分裂素外調(diào)控花器官脫落功能[6-8]；SlARF2基因在番茄中參與花器官的衰老調(diào)控和果實(shí)發(fā)育過(guò)程[21].綜上推測(cè)，ChARF1基因在胚珠發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用，同時(shí)還可能具有AtARF1/2和SlARF2基因的類(lèi)似功能，參與榛子花的發(fā)育和花器官脫落過(guò)程.

為進(jìn)一步驗(yàn)證ChARF1基因的功能機(jī)制，本研究通過(guò)構(gòu)建pET-28a-SUMO-ChARF1(N-380)原核表達(dá)載體成功誘導(dǎo)表達(dá)ChARF1(N-380)抗原蛋白，首次獲得了能夠特異性檢測(cè)榛子ChARF1基因相關(guān)蛋白的多克隆抗體E7200和E7201，為后續(xù)研究提供了檢測(cè)材料.由于本次克隆的ChARF1基因是以cDNA為模板擴(kuò)增的CDS序列，后續(xù)還應(yīng)以gDNA為模板通過(guò)5′-RACE和3′-RACE檢測(cè)基因的完整性，在獲得基因完整的序列信息后，進(jìn)行ChARF1基因序列以及榛子ARF基因家族的系統(tǒng)生物信息學(xué)分析和分子功能研究，將有助于深刻揭示ARFs在榛子胚珠發(fā)育中所扮演的角色.