崔宇帆，陳昱筱，楊 裕，王棟梁，韓紅宇，龐全海* (.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，山西 太谷 0080；2.山西省陽曲縣動物疫病預(yù)防控制中心，山西 陽曲 0000；山西省朔州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山西 朔州 06002)

微貯豆秸指的是在豆秸中加入微生物菌劑，在厭氧環(huán)境下利用有機物的發(fā)酵繁殖從而獲得的優(yōu)質(zhì)飼糧，由此方法獲得的飼糧相對于豆秸來說，飼糧成本下降，減少了浪費，減少了環(huán)境污染，粗纖維含量有所下降，已被證實是一種優(yōu)質(zhì)飼糧[1]。研究表明維生素D3(VD3)具有免疫調(diào)節(jié)作用[2]，適量的VD3可抑制氧化應(yīng)激損傷和細胞凋亡[3]，若可以在微貯豆秸飼糧的基礎(chǔ)上添加適量維生素D(VD)，將兩者優(yōu)勢相結(jié)合，在畜牧養(yǎng)殖中將會是一大突破，然而，目前的研究主要集中于飼料中VD3對于水產(chǎn)動物[4-5]及禽類[6-8]抗氧化和免疫功能的影響，鮮有關(guān)于微貯豆秸中VD3添加量對綿羊各組織抗氧化和細胞凋亡影響的報道。基于此，本試驗研究微貯豆秸中添加VD3對綿羊各組織的抗氧化性能及細胞凋亡的影響，從而為更好地利用微貯和VD3提高養(yǎng)殖效益和動物健康水平提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組隨機選取購自山西柳林匯源新盛養(yǎng)殖專業(yè)合作社的健康杜泊羊(♂)×小尾寒羊(♀)雜交子代公綿羊25只，體質(zhì)量20～25 kg，隨機分為5組，每組5只，對照組飼糧不添加VD3，試驗組飼糧中分別添加300，600，900，1 200 IU/kg VD3，連續(xù)飼喂80 d。

1.2 日糧及飼養(yǎng)管理各組均飼喂基礎(chǔ)日糧+微貯豆秸，微貯豆秸參考陳昱筱等[1]的方法制作。對照組飼糧不添加VD3，試驗組飼糧中分別添加300，600，900，1 200 IU/kg VD3。日糧成分及含量見表1。

1.3 主要試劑抗氧化試劑盒(南京建成生物工程有限公司)；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Abcam公司)。

1.4 主要設(shè)備PCR儀(Bio-Rad)；實時熒光定量PCR儀(Bio-Rad)；核酸測定儀(Eppendorf公司)；全波長多功能酶標儀(Thermo Forma公司)；自動血液分析儀(普康醫(yī)療器械有限公司)。

1.5 抗氧化性能的測定血液的采集與處理：在飼喂第80 天時，在羊空腹狀態(tài)時頸靜脈采血，分離血清并分裝于離心管中，-20℃密閉保存?zhèn)溆谩＝M織樣品的采集與處理：在飼喂第80 天時，每組隨機挑選4只綿羊，采集肝臟、脾臟、腎臟、胸腺及腸系膜淋巴結(jié)樣品，加生理鹽水制成10%的勻漿，離心后取上清備檢。

1.6 細胞凋亡相關(guān)基因表達量的測定引物信息、序列及合成方式同文獻[1]。按常規(guī)方法提取綿羊各組織總RNA，嚴格按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照TaKaRa熒光定量試劑盒說明書進行實時熒光定量 PCR反應(yīng)。

1.7 病理組織學(xué)檢查按常規(guī)方法制作組織切片，TUNEL法染色，鏡檢。

1.8 統(tǒng)計分析選用SPSS 25.0對所得數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，多重比較選用Duncan法。

2 結(jié)果

2.1 VD3對綿羊各組織抗氧化性能的影響由圖1可知，飼糧中添加600 IU/kg VD3時，綿羊血清過氧化氫酶(CAT)活性顯著升高(P<0.05)；添加900，1 200 IU/kg VD3時，CAT活性極顯著升高(P<0.01)；添加300，600，900 IU/kg VD3時，谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性顯著升高(P<0.05)；而添加300，600，900，1 200 IU/kg VD3時，T-SOD的活性極顯著升高(P<0.01)；MDA的含量則顯著降低(P<0.05)。

由圖2可知，綿羊飼糧中添加900 IU/kg VD3時，肝臟CAT活性顯著升高(P<0.05)；添加600，900，1 200 IU/kgVD3時，GSH-Px活性顯著降低(P<0.05)；添加300，600，900，1 200 IU/kg VD3時，T-SOD活性均顯著升高(P<0.05)，MDA含量顯著降低(P<0.05)。

圖2 VD3對綿羊肝臟抗氧化性能的影響

由圖3可知，添加300，900，1 200 IU/kg VD3時，腎臟中T-SOD的活性顯著升高(P<0.05)；添加300 IU/kg VD3時，GSH-Px活性顯著升高(P<0.05)；添加300，600 IU/kg VD3時，MDA含量顯著降低(P<0.05)。

圖3 VD3對綿羊腎臟抗氧化性能的影響

由圖4可知，綿羊飼糧中添加900 IU/kg VD3時，脾臟CAT活性顯著降低(P<0.05)；添加300，600，900，1 200 IU/kg VD3時，T-SOD活性顯著升高(P<0.05)，MDA含量顯著降低(P<0.05)；添加300，600 IU/kg VD3時，GSH-Px活性顯著升高(P<0.05)；添加900，1 200 IU/kg VD3時，GSH-Px活性顯著降低(P<0.05)。

圖4 VD3對綿羊脾臟抗氧化性能的影響

由圖5可知，綿羊飼糧中添加900 IU/kg VD3時，胸腺CAT活性顯著降低(P<0.05)；添加600,900，1 200 IU/kg VD3時，T-SOD活性極顯著降低(P<0.01)；添加300，600，900，1 200 IU/kg VD3時，GSH-Px活性極顯著升高(P<0.01)，MDA含量極顯著降低(P<0.01)。

圖5 VD3對綿羊胸腺抗氧化性能的影響

由圖6可知，飼糧中添加300 IU/kg VD3時，腸系膜淋巴結(jié)CAT和GSH-Px活性顯著升高(P<0.05)，T-SOD活性極顯著升高(P<0.01)；添加900 IU/kg VD3時，T-SOD活性顯著升高(P<0.05)；添加300，600，900，1 200 IU/kg VD3時，MDA含量顯著降低(P<0.01)。

圖6 VD3對綿羊腸系膜淋巴結(jié)抗氧化性能的影響

2.2 VD3對綿羊各組織細胞凋亡的相關(guān)基因及VDR表達的影響由圖7可知，綿羊飼糧中添加300 IU/kg VD3時，肝臟VDR表達量顯著降低(P<0.05)，Bcl-2表達量顯著升高(P<0.05)；添加600 IU/kg VD3時，肝臟Caspase-9、VDR、Bcl-2和BAX表達量顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)升高；添加900，1 200 IU/kg VD3時，Caspase-3、Caspase-9、VDR、Bcl-2和BAX表達量顯著或極顯著升高(P<0.05或P<0.01)。

圖7 VD3對綿羊肝臟凋亡相關(guān)基因及VDR表達的影響

由圖8可知，綿羊飼糧中添加300 IU/kg VD3，腎臟Caspase-9、VDR和BAX表達量顯著降低(P<0.05)；添加600 IU/kg VD3時，Caspase-3、Caspase-9、VDR和BAX表達量顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)升高；添加900，1 200 IU/kg VD3時，Caspase-9和BAX表達量顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)升高，Bcl-2表達量極顯著降低(P<0.01)；添加900 IU/kg VD3時，VDR表達量顯著(P<0.05)升高。

圖8 VD3對綿羊腎臟凋亡相關(guān)基因及VDR表達的影響

由圖9可知，綿羊飼糧中添加300 IU/kg VD3，脾臟Caspase-9和VDR表達量顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)降低，Bcl-2表達量極顯著(P<0.01)升高；添加600，900 IU/kg VD3，Caspase-3、Caspase-9和BAX表達量極顯著(P<0.01)升高；添加1 200 IU/kg VD3，Caspase-9、Bcl-2和BAX含量顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)升高。

圖9 VD3對綿羊脾臟凋亡相關(guān)基因及VDR表達的影響

由圖10可知，綿羊飼糧中添加300 IU/kg VD3時，胸腺VDR表達量極顯著降低(P<0.01)，Bcl-2表達量顯著升高(P<0.05)；添加600 IU/kg VD3，Caspase-3、Bcl-2和BAX表達量極顯著升高(P<0.01)；添加900，1 200 IU/kg VD3，Caspase-3、VDR、Bcl-2表達量顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)升高；添加900 IU/kg VD3，BAX的表達量顯著(P<0.05)升高。

圖10 VD3對綿羊胸腺凋亡相關(guān)基因及VDR表達的影響

由圖11可知，綿羊飼糧中添加300 IU/kg VD3，腸系膜淋巴結(jié)Bcl-2的表達量極顯著升高(P<0.01)；添加600，900，1 200 IU/kg VD3，Caspase-3、Caspase-9、VDR、Bcl-2和BAX的表達量均極顯著(P<0.01)升高。

圖11 VD3對綿羊腸系膜淋巴結(jié)凋亡相關(guān)基因及VDR表達的影響

2.3 VD3對綿羊各組織TUNEL染色的影響由圖12可知，飼糧中添加600 IU/kg VD3，肝臟匯管區(qū)可見較多的凋亡細胞，且MOD值顯著升高(P<0.05)。

A.對照組； B～E.試驗組，VD3添加水平分別為300，600，900，1 200 IU/kg。注：MOD即為mean optical density的縮寫，代表平均光密度。下同圖12 VD3對綿羊肝臟細胞凋亡的影響以及MOD值分析(400×)

由圖13可知，飼糧中添加900，1 200 IU/kg VD3，腎小球周圍可見較多的凋亡細胞，添加600和1 200 IU/kg VD3，MOD值相對于對照組顯著(P<0.05)升高。

A.對照組； B～E.試驗組，VD3添加水平分別為300，600，900，1 200 IU/kg圖13 VD3對綿羊腎臟細胞的凋亡影響以MOD值分析(400×)

由圖14可知，飼糧中添加600，900，1 200 IU/kg VD3，綿羊脾臟可見有較多的凋亡細胞，MOD值顯著升高(P<0.05)。

A.對照組； B～E.試驗組，VD3添加水平分別為300，600，900，1 200 IU/kg圖14 VD3對綿羊脾臟細胞凋亡的影響以及MOD值分析(400×)

由圖15可知，綿羊飼料中添加600 IU/kg VD3，胸腺可見較多的的凋亡細胞，添加600，900，1 200 IU/kg VD3，胸腺MOD值顯著升高(P<0.05)。

圖15 VD3對綿羊胸腺細胞凋亡的影響以及MOD分析(400×)

由圖16可知，綿羊飼料中添加600，900，1 200 IU/kg VD3，腸系膜淋巴結(jié)可見較多的凋亡細胞，MOD值顯著升高(P<0.05)。

圖16 VD3對綿羊腸系膜淋巴細胞凋亡的影響以及MOD值分析(400×)

3 討論

3.1 VD3對綿羊各組織抗氧化性能的影響氧化應(yīng)激的主要表現(xiàn)是脂質(zhì)過氧化和活性氧(ROS)生成過多，CAT和GSH-Px等抗氧化酶活性不足[3]。GSH-Px是一種重要的抗氧化酶，與自由基的清除密切相關(guān)。MDA是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，其含量可反映自由基的水平[9]。袁麗偉等[10]發(fā)現(xiàn)，VD3能夠降低機體的氧化應(yīng)激水平，提高GSH-Px和還原酶類活性，提高抗氧化能力[11]。本試驗結(jié)果表明，飼糧中添加VD3后，試驗組綿羊血清和各組織的GSH-Px和T-SOD活性顯著升高，MDA含量顯著降低，關(guān)于VD3添加量對腎臟和血清T-SOD的影響本課題組已有相關(guān)報道[1]。王帥等[12]的試驗也表明，VD3可以改善綿羊各腸段的CAT、T-SOD、GSH-Px活性及MDA的含量，從而提高了綿羊的抗氧化能力，與本試驗結(jié)果類似。有文獻表明，在其他物種飼糧中添加適量VD3也會有類似的抗氧化效果。在黑魚飲食中添加適當含量的VD3可以增加T-SOD，CAT，GSH-Px的活性，MDA含量顯著降低，改善了總抗氧化能力[13]。張淑云等[8]研究發(fā)現(xiàn)，隨VD3添加水平的增加，生長肉雞血清和肝臟T-SOD和GSH-Px的活性得以升高，MDA含量降低。李向等[14]研究發(fā)現(xiàn)，適量VD3可以顯著提高機體肝臟的CAT和T-SOD活力。邢月等[15]研究表明，飼糧中添加VD3可以使產(chǎn)蛋種鵝SOD和GAH-PX活力顯著增強。但維生素的添加量適合才會達到最佳效果，含量太少效果不顯著，但維生素的過量可能會適得其反，王帥等[12]研究表明VD3添加量為300，600 IU/kg時腸道抗氧化效果最佳，與本實驗研究結(jié)果一致。張淑云等[8]研究指出，生長肉雞血清各抗氧化能力與VD3的添加量無顯著的相關(guān)關(guān)系，李萬佳等[16]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中VD3添加水平對生長獺兔血清的抗氧化能力可產(chǎn)生極顯著影響，且隨VD3添加水平的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。這些研究結(jié)果表明，飼料中添加適量的VD3有助于降低機體的氧化應(yīng)激，改善其抗氧化能力，最佳添加劑量可能會因為物種而有所不同。

3.2 VD3對綿羊各組織細胞凋亡的影響細胞凋亡是一種不可逆的細胞死亡過程，這一事件主要由Cyt C介導(dǎo)的內(nèi)源性線粒體通路和細胞表面死亡受體介導(dǎo)的外源性通路介導(dǎo)[17]，Bcl-2家族是內(nèi)源性凋亡途徑的主要調(diào)控者[18]。研究表明，VD3可以通過抑制抗凋亡蛋白的表達或誘導(dǎo)促凋亡蛋白的表達來影響細胞凋亡，師朗等[19]的研究結(jié)果表明，VD3對于細胞凋亡及自噬功能的維持具有重要作用，其可通過上調(diào)VDR水平增強自噬活性。本試驗結(jié)果表明，飼料中添加300 IU/kg VD3時，試驗組綿羊肝臟、脾臟、胸腺組織的VDR表達水平相對于對照組顯著降低，Bcl-2表達量相對于對照組顯著升高，而Caspase-3、Caspase-9和BAX的表達量均有不同程度的降低，表明VD3通過調(diào)控VDR的表達誘導(dǎo)Bcl-2的表達，通過抑制Caspase-3、Caspase-9表達抑制細胞凋亡。有文獻表明，在其他物種和組織中VD3也具有類似的效果，如：劉華等[20]的研究表明，VD3可抑制乳腺癌細胞及乳腺癌干細胞活力，誘導(dǎo)乳腺癌細胞凋亡[21]；LEE等[22]研究發(fā)現(xiàn)VD3可增加BAX的表達，降低Bcl-2的表達；VDR能抑制大鼠腎小管上皮細胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡[23]。然而，VD3的過量添加反而會適得其反，正如本試驗，添加高劑量VD3時，綿羊各組織凋亡相關(guān)基因和VDR的表達量相對升高，Bcl-2的表達量相對降低，且各組織的凋亡程度和MOD值普遍升高，而添加量達到600，900，1 200 IU/kg時，綿羊部分組織凋亡基因和促凋亡基因均有所升高的現(xiàn)象，其作用機理有待進一步研究。以上研究說明VD3可通過調(diào)節(jié)VDR的表達調(diào)控相關(guān)凋亡基因的表達進而誘導(dǎo)細胞凋亡，且適量的VD3(本試驗為300 IU/kg)可以抑制免疫相關(guān)細胞的凋亡，從而使機體的免疫力得以改善。