姜 勝,楊少青，周 彬，宋泉江，邵春艷，王曉杜*，宋厚輝* (1.浙江農(nóng)林大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院/動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 311300；2.浙江省畜禽綠色生態(tài)健康養(yǎng)殖應(yīng)用技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311300；3.動(dòng)物健康互聯(lián)網(wǎng)檢查技術(shù)浙江省工程實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311300)

壬基酚(NP)是化工生產(chǎn)中常用的非離子表面活性劑，可在水、土壤和空氣中蓄積后進(jìn)入食物鏈[1]。NP是一種眾所周知的內(nèi)分泌干擾物，可引起激素失衡，導(dǎo)致生殖和發(fā)育障礙[2-3]。大量研究發(fā)現(xiàn)，除了具有生殖毒性外，NP還會(huì)對(duì)肝、腎、神經(jīng)系統(tǒng)等多種器官造成損傷[4-7]。番茄紅素(LYC)是一種類胡蘿卜素，廣泛分布于番茄、粉紅葡萄柚、石榴和西瓜中[8]。LYC因其強(qiáng)大的抗氧化能力而具有多種保健作用，特別是抗腎毒性受到廣泛關(guān)注。有研究表明，LYC對(duì)氨甲葉酸誘導(dǎo)的腎臟毒性(包括組織損傷、生化指標(biāo))具有顯著療效[9]。LYC可糾正氧化應(yīng)激引起的腎臟皮質(zhì)細(xì)胞凋亡，從而對(duì)腎功能障礙具有保護(hù)作用[10]。此前的研究表明LYC對(duì)黃曲霉毒素引起的腎臟線粒體功能損傷具有保護(hù)作用[11]。然而，目前關(guān)于LYC能否減輕NP誘導(dǎo)的腎臟損傷及其機(jī)制的研究尚未見報(bào)道。因此，本試驗(yàn)通過建立LYC干預(yù)NP誘導(dǎo)小鼠腎損傷實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，探究LYC對(duì)NP誘導(dǎo)小鼠腎臟損傷的保護(hù)機(jī)制，為L(zhǎng)YC的應(yīng)用和NP中毒的防護(hù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與藥品試劑清潔級(jí)ICR小鼠(40只，雌雄各半，體質(zhì)量18～23 g)購自杭州子源實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)為20200514Aabz0105999491；NP(GR，純度≥99%)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；LYC(UV≥98%)和玉米油均購自北京索萊寶科技有限公司；抗氧化指標(biāo)(T-AOC、SOD、CAT、GSH-PX和MDA)檢測(cè)試劑盒購自南京建成生物工程研究所；腎功能指標(biāo)(血清CREA、血清BUN、血清P、尿白蛋白與肌酐比值(UPC))檢測(cè)由浙江農(nóng)林大學(xué)教學(xué)動(dòng)物醫(yī)院完成；Akt、p-Akt、p53、Bcl-2、Bax，β-actin的一抗購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；羊抗兔和羊抗鼠的二抗購自美國Jackson ImmunoResearch公司。

1.2 藥品配置根據(jù)NP和LYC脂溶性特點(diǎn)，以玉米油為溶劑，按照0.1 mL/10 g的灌胃量，分別配制成濃度為30 g/L NP溶液和1 g/L LYC溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。根據(jù)課題組前期試驗(yàn)結(jié)果，將小鼠NP染毒劑量和LYC干預(yù)劑量分別定為150 mg/kg和5 mg/kg。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分組將40只清潔級(jí)ICR小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只，雌雄各半。對(duì)照組(control group，CON)每天8:30經(jīng)口灌服玉米油0.1 mL，2 h 后經(jīng)口灌服玉米油0.1 mL；中毒組(nonylphenol group，NPG)每天8:30經(jīng)口灌服玉米油0.1 mL，2 h后經(jīng)口灌服150 mg/kg NP溶液；番茄紅素對(duì)照組(lycopene group，LCG)每天8:30經(jīng)口灌服5 mg/kg LYC，2 h后經(jīng)口灌服0.1 mL玉米油；LYC干預(yù)組(lycopene+nonylphenol group，LNG)每天8:30經(jīng)口灌服5 mg/kg LYC，2 h后經(jīng)口灌服150 mg/kg NP溶液。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雌雄分籠飼養(yǎng)，每晚21:00禁食，自由飲水，按試驗(yàn)計(jì)劃連續(xù)灌胃30 d，每5 d稱體質(zhì)量1次，根據(jù)體質(zhì)量變化調(diào)整各藥物的灌服量，保證試驗(yàn)結(jié)束后各組小鼠不少于8只。

1.4 樣品采集各組小鼠經(jīng)口灌服藥物30 d后，于第31天8:30準(zhǔn)確稱量小鼠體質(zhì)量。測(cè)量體質(zhì)量前，抓取小鼠，采用逼尿法收集適量尿液用于腎臟功能測(cè)定。測(cè)量體質(zhì)量后，從小鼠頜下靜脈采血0.5 mL，用于檢測(cè)血中氧化與抗氧化指標(biāo)和腎臟功能指標(biāo)分析。安樂死后，采集腎臟并準(zhǔn)確測(cè)量體質(zhì)量，將腎臟分為3份，分別用于腎臟組織顯微結(jié)構(gòu)觀察、抗氧化指標(biāo)的測(cè)定和凋亡通路相關(guān)蛋白水平檢測(cè)。

1.5 日均增體質(zhì)量及腎體系數(shù)測(cè)定根據(jù)計(jì)算公式：(試驗(yàn)后體質(zhì)量-試驗(yàn)前體質(zhì)量)/試驗(yàn)天數(shù)，計(jì)算各組小鼠試驗(yàn)期間日均增體質(zhì)量。按照計(jì)算公式：腎臟質(zhì)量/試驗(yàn)后體質(zhì)量×100%，計(jì)算各組小鼠腎體系數(shù)。

1.6 腎臟組織顯微結(jié)構(gòu)測(cè)定取適量腎臟組織置于10%甲醛溶液中固定，常規(guī)脫水，石臘包埋，制備切片，HE染色后光學(xué)顯微鏡下觀察腎臟顯微結(jié)構(gòu)變化。

1.7 腎功能的測(cè)定取適量血清，使用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血中CREA、BUN、P離子含量，取適量尿液測(cè)量尿中尿蛋白/尿肌酐比值(UPC)，用于評(píng)估腎臟功能。

1.8 抗氧化指標(biāo)的測(cè)定取適量腎臟組織與冰浴生理鹽水混合后通過組織破碎儀制備成10%勻漿，于4℃下,以3 000 r/min離心15 min，取上清儲(chǔ)存-80℃?zhèn)溆谩⒛I臟組織勻漿分別按照各抗氧化指標(biāo)試劑盒說明書進(jìn)行處理后，用酶標(biāo)儀測(cè)定腎臟中各種抗氧化指標(biāo)的含量。

1.9 腎臟中凋亡通路蛋白測(cè)定蛋白提?。喝?80℃ 凍存的腎臟組織于冰上解凍后，取50 mg組織放入預(yù)冷的玻璃勻漿器，加入200 μL裂解液和5 μL 蛋白酶抑制劑PMSF，冰浴中充分研磨成勻漿，冰上靜置5 min后移入1.5 mL離心管中，超聲10 次，每次10 s，間隔4 s；4℃ 12 000 r/min離心5 min；離心后上清即為腎臟組織全蛋白提取物。

蛋白質(zhì)量濃度測(cè)定及樣品制備：利用BCA試劑盒測(cè)定腎臟組織蛋白提取物質(zhì)量濃度。根據(jù)蛋白質(zhì)量濃度，將上樣體積定為15 μL(20 μg)，加入3 μL 5×SDS上樣緩沖液，混合均勻，沸水浴10 min，冷卻后分裝，-80℃保存。

蛋白含量表達(dá)檢測(cè)：取15 μL變性蛋白樣本進(jìn)行SDS-PAGE后，采用濕轉(zhuǎn)法將目的蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，隨后用5%脫脂奶粉室溫孵育2 h；封閉結(jié)束后，用TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min；洗膜結(jié)束后，將膜置于已稀釋相應(yīng)倍數(shù)的一抗中4℃孵育過夜；一抗孵育結(jié)束后，再次用TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min；洗膜結(jié)束后，將膜置于相同種屬的二抗中室溫孵育1 h；孵育結(jié)束后，用TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min；洗膜結(jié)束后，在膜上滴加ECL顯色液，放入凝膠成像系統(tǒng)中曝光成像。以β-actin為內(nèi)參蛋白，用ImageJ軟件進(jìn)行蛋白條帶灰度值的分析，最終計(jì)算出目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)表示為“均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”，使用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析并制圖，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，運(yùn)用t檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)配對(duì)差異分析，P<0.05為顯著性差異標(biāo)準(zhǔn)，P<0.01為極顯著性差異標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 體質(zhì)量增長(zhǎng)系數(shù)及腎體系數(shù)試驗(yàn)過程中，各組實(shí)驗(yàn)小鼠均未出現(xiàn)死亡，但與CON小鼠比較，NPG小鼠日增體質(zhì)量顯著降低(P<0.05)，而與CON小鼠比較，LCG小鼠和LNG小鼠日增體質(zhì)量無顯著性差異(P>0.05)；與NPG小鼠比較，LNG小鼠日增體質(zhì)量顯著升高(P<0.05)(圖1A)。各組實(shí)驗(yàn)小鼠腎體系數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，與CON小鼠比較，NPG小鼠腎體系數(shù)顯著升高(P<0.05)；與NPG小鼠比較，LNG小鼠日增體質(zhì)量顯著降低(P<0.05)(圖1B)。

2.2 LYC干預(yù)對(duì)NP誘導(dǎo)小鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)變化的影響如圖2所示，NPG小鼠腎小囊腔萎縮(綠色箭頭)，腎小囊腔內(nèi)有多量嗜酸性物質(zhì)(黑色箭頭)，腎小管擴(kuò)張(黃色箭頭)(圖2B)，損傷嚴(yán)重；LNG小鼠腎小囊腔萎縮(黑色箭頭)，腎小管上皮細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常、排列緊密(圖2C)，損傷輕微；LCG小鼠與CON小腎臟結(jié)構(gòu)未見明顯差異。

2.3 LYC干預(yù)對(duì)NP誘導(dǎo)小鼠腎功能的影響如圖3所示，與CON比較，NPG小鼠血清中UREA、CREA和P離子含量顯著升高(P<0.01)，經(jīng)過LYC干預(yù)后，與NPG小鼠比較，LNG小鼠血清中UREA、CREA和P離子含量顯著降低(P<0.05，P<0.01)。與CON比較，NPG小鼠尿液UPC值顯著升高(P<0.01)；經(jīng)過LYC干預(yù)后，與NPG小鼠比較，LNG小鼠尿液UPC值顯著降低(P<0.01)。

2.4 LYC干預(yù)對(duì)NP誘導(dǎo)小鼠腎臟氧化損傷的影響由圖4可知，與CON比較，NPG小鼠腎臟MDA含量顯著升高(P<0.05)；經(jīng)LYC干預(yù)后，LNG小鼠腎臟MDA含量顯著下降(P<0.01)。與CON比較，NPG小鼠腎臟抗氧化酶SOD、CAT和GSH-Px活性及總抗氧化能力(T-AOC)均顯著下降(P<0.05)；經(jīng)LYC干預(yù)后，LNG小鼠腎臟抗氧化酶活性和總抗氧化能力均顯著升高(P<0.05)。

2.5 LYC干預(yù)對(duì)NP誘導(dǎo)小鼠腎臟凋亡通路蛋白表達(dá)的影響由圖5可知，與CON比較，NPG小鼠腎臟p53、Bax蛋白的表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)，PI3K、p-PI3K、p-Akt、Bcl-2、Akt蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.01，P<0.05)；與NPG比較，LNG組小鼠腎臟p53、Bax表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)，PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)。

CON.對(duì)照組；NPG.NP染毒組；LCG.LYC對(duì)照組；LNG.LYC干預(yù)NP染毒組圖5 LYC干預(yù)對(duì)NP染毒小鼠腎臟PI3K/Akt/p53通路蛋白表達(dá)的影響

3 討論

NP是一種典型的內(nèi)分泌干擾物，具有抗雄激素和雌激素樣作用[12]。關(guān)于NP毒性的研究主要集中在其生殖毒性方面[13-14]，但有研究表明NP還可以引起氧化應(yīng)激，并在多器官中產(chǎn)生具有高度活性的膜毒性中間產(chǎn)物[15-16]。LYC是一種天然類胡蘿卜素抗氧化劑，是β-胡蘿卜素的異構(gòu)體，其在細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物模型中清除自由基的活性已被證實(shí)[17]。因此，LYC能夠降低氧化應(yīng)激介導(dǎo)的多種疾病風(fēng)險(xiǎn)[18]，而且有研究證實(shí)，LYC可以保護(hù)黃曲霉毒素誘導(dǎo)的小鼠腎臟損傷[19]。盡管NP在環(huán)境中分布廣泛，對(duì)人和動(dòng)物的健康危害極大，但LYC對(duì)NP毒性保護(hù)作用的具體機(jī)制尚未闡明。本研究旨在探討NP對(duì)腎臟損傷和氧化應(yīng)激的影響，以及應(yīng)用LYC能否逆轉(zhuǎn)NP誘導(dǎo)的小鼠腎臟組織氧化應(yīng)激和組織病理學(xué)改變及其機(jī)制。

腎臟是機(jī)體清除體內(nèi)代謝產(chǎn)物、廢物及毒物的重要器官，有研究表明NP能夠?qū)е麓笫竽I臟組織損傷[20]。本研究腎臟組織病理學(xué)結(jié)果顯示NP染毒后小鼠腎小囊腔萎縮，腔內(nèi)有多量嗜酸性物質(zhì)，腎小管擴(kuò)張；腎體指數(shù)變化結(jié)果顯示NP染毒后小鼠腎體指數(shù)升高，結(jié)合組織學(xué)結(jié)果表明NP染毒后小鼠腎臟腫脹，相對(duì)質(zhì)量增加；而小鼠日增體質(zhì)量則在染毒后顯著降低。病理組織學(xué)結(jié)果、腎體指數(shù)和小鼠日增體質(zhì)量變化結(jié)果均顯示LYC干預(yù)可逆轉(zhuǎn)NP染毒導(dǎo)致的腎臟質(zhì)量和組織學(xué)變化變化。雖然對(duì)NP暴露后小鼠日增體質(zhì)量和腎體系數(shù)變化的檢測(cè)屬于非功能性評(píng)估，但日增體質(zhì)量和腎體指數(shù)變化可以直觀體現(xiàn)出外源性毒物的毒性作用[17]。研究發(fā)現(xiàn)，LYC不僅可抑制腎細(xì)胞癌變，還可抵抗多種毒物對(duì)機(jī)體的腎毒性[21-22]，保護(hù)腎臟組織。本研究結(jié)果表明，LYC干預(yù)后NP染毒小鼠血清中CREA、UREA和尿中UPC值均下降。綜合病理組織學(xué)結(jié)果及小鼠日增體質(zhì)量變化和腎體指數(shù)3組數(shù)據(jù)，說明LYC能干預(yù)NP誘導(dǎo)的小鼠腎毒性。

MDA是氧化應(yīng)激引起脂質(zhì)過氧化的生化標(biāo)志物[23]，是指示機(jī)體氧化平衡狀態(tài)的最常用指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示,NP染毒小鼠腎臟組織MDA顯著升高，說明小鼠體內(nèi)的氧化與抗氧化平衡狀態(tài)已經(jīng)被破壞。NP是親脂性化合物，因此細(xì)胞可能是脂質(zhì)過氧化的靶點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，NP暴露可對(duì)機(jī)體產(chǎn)生毒性，增加氧自由基和脂質(zhì)過氧化，抑制抗氧化酶活性，氧自由基的增加導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生膜脂過氧化，導(dǎo)致細(xì)胞損傷或死亡，并損害其周圍組織的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能[24]。經(jīng)LYC預(yù)處理，小鼠腎臟MDA水平比NP染毒小鼠顯著降低，說明LYC可以糾正機(jī)體氧化與抗氧化的失衡。經(jīng)LYC干預(yù)后小鼠MDA水平降低的同時(shí)，腎臟總抗氧化能力(T-AOC)和抗氧化酶(SOD、CAT和GSH-Px)活性增強(qiáng)，說明抗氧化作用是LYC抵抗NP毒性作用機(jī)制之一。此外，LYC分子結(jié)構(gòu)中含有開鏈多烯或富電子芳香環(huán)結(jié)構(gòu)，使得LYC能有效地清除超氧陰離子自由基，具備極強(qiáng)的抗氧化能力[25-26]。因此，LYC對(duì)NP毒性的保護(hù)作用與其直接清除自由基和增強(qiáng)抗氧化系統(tǒng)的抗氧化能力有關(guān)。

生理狀態(tài)下的細(xì)胞凋亡在控制細(xì)胞數(shù)量和維持細(xì)胞增殖活性中起著重要作用[27]，涉及p53、Bcl-2等多個(gè)基因和蛋白家族的表達(dá)與調(diào)控作用。研究證實(shí)，PI3K/Akt信號(hào)調(diào)控通路與細(xì)胞凋亡和增殖密切相關(guān)[28]，該通路可調(diào)控下游關(guān)鍵分子p53、Bcl-2及Bax等分子參與內(nèi)源性細(xì)胞凋亡。p53蛋白是凋亡通路中關(guān)鍵蛋白，可以下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2，上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，破壞Bcl-2和Bax平衡狀態(tài)，促使線粒體內(nèi)促凋亡蛋白外排，引起細(xì)胞凋亡。因此Bcl-2和Bax平衡狀態(tài)的破壞可以促進(jìn)凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，磷酸化的Akt可以抑制p53的表達(dá)[29]。本研究發(fā)現(xiàn)NP暴露可抑制PI3K蛋白表達(dá)，下調(diào)Akt磷酸化水平，而凋亡通路中關(guān)鍵分子p53蛋白在NP暴露小鼠中表達(dá)水平升高，說明NP可能抑制PI3K/Akt通路，上調(diào)p53蛋白表達(dá)水平，從而促進(jìn)腎臟細(xì)胞凋亡發(fā)揮毒性效應(yīng)。經(jīng)LYC處理后，檢測(cè)凋亡通路蛋白表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)LYC可上調(diào)PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)，抑制p53、Bax蛋白表達(dá)，說明LYC可能通過激活PI3K，上調(diào)Akt的磷酸化水平，抑制下游p53/Bax分子，對(duì)NP誘導(dǎo)腎臟細(xì)胞的過度凋亡發(fā)揮保護(hù)作用。本研究證實(shí)LYC能夠激活PI3K/Akt通路，下調(diào)p53蛋白表達(dá)，激活PI3K/Akt/p53通路，抑制Bax蛋白表達(dá)，激活Bcl-2蛋白，抑制腎臟細(xì)胞凋亡。

綜上所述，LYC對(duì)NP誘導(dǎo)的小鼠腎臟損傷具有保護(hù)作用，這與LYC增強(qiáng)腎臟抗氧化能力，抑制抑制PI3K/Akt/p53細(xì)胞凋亡通路有關(guān)。