陳椿樺，李 響，王 穎，許智強，李 可，劉蔓莉，王 卓，宋戰(zhàn)昀，馮 新* (.吉林大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林 長春 3006；.長春海關(guān)技術(shù)中心，吉林 長春 3006)

我國既是養(yǎng)豬大國，也是豬肉消費大國，生豬飼養(yǎng)量和豬肉消費量均占世界總量的1/2左右[1]。受高生長速率、高瘦肉率等指標(biāo)為主的需求導(dǎo)向影響，我國生豬產(chǎn)業(yè)的“芯片”——種質(zhì)資源，約有九成以上從國外引種擴繁，2008至2017年間我國從國外共引入種豬90 384頭[2]，2020年數(shù)量達22 091頭，創(chuàng)歷史新高。但我國生豬市場重引進、輕選育，易陷入“引種—退化—引種”的不良循環(huán)，正遭遇“卡脖子”風(fēng)險。

動物腸道微生物群的結(jié)構(gòu)和組成由許多因素決定，如品種、遺傳、年齡、飲食、系統(tǒng)發(fā)育及飼養(yǎng)環(huán)境[3]。不同品系腸道菌群組成不同，有研究表明中國金華豬腸道群落基本組成為厚壁菌門占70.4%、擬桿菌門占14.4%，而杜洛克豬、約克夏豬以及長白豬等西方品種豬腸道群落中厚壁菌門分別為39.6%、42.0%及45.6%，擬桿菌門分別為57.0%、51.4%及47.6%[4]。對不同遺傳背景的長白豬(生長速度快的瘦肉型豬)和梅花豬(生長速度慢的肥胖型豬)的結(jié)腸中微生物組和代謝組比較分析，發(fā)現(xiàn)長白豬結(jié)腸中短鏈脂肪酸(SCFA)和次級膽汁酸含量較高[5]。

腸道微生物與預(yù)防傳染病、維持腸道形態(tài)、營養(yǎng)消化、新陳代謝和宿主免疫調(diào)節(jié)相關(guān)聯(lián)[3,6]，在仔豬斷奶前通過口服的方式將健康本土豬的糞便微生物群轉(zhuǎn)移到商業(yè)雜交仔豬中，可降低仔豬腹瀉發(fā)生率[7]。丁酸梭菌和糞腸球菌可以促進斷奶仔豬的生長性能，保護腸道絨毛形態(tài)，提高免疫力，優(yōu)化腸道菌群[8]，許多共生細菌還可調(diào)節(jié)腸道病原體的免疫防御以及伴隨它們的病理性炎癥[9]。而有害的微生物群落可以改變腸道菌群的組成并引起疾病，誘發(fā)炎癥性疾病，如炎癥性腸病(IBD)[10]。消化道是非常復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)，宿主的微生物群與外部環(huán)境之間存在動態(tài)的共生關(guān)系[11]。仔豬腸道菌群的穩(wěn)態(tài)受各種因素的影響，包括微生物菌群的定植和演替、豬的日齡、遺傳因素、飼養(yǎng)環(huán)境、抗菌劑、膳食成分、飼料添加劑、飼養(yǎng)管理、疾病狀況、斷奶和季節(jié)等[12]。

我國主要引種斷奶仔豬，經(jīng)過純代培養(yǎng)后再雜交培養(yǎng)，最終成為商品豬。LU等[13]在雜交豬群中收集3個時間的糞便樣本，評估了每只動物糞便微生物組的組成隨時間的變化，在每個時間點確定了2種腸型，發(fā)現(xiàn)腸型與背部脂肪厚度相關(guān)。在另一項研究中，DE RODAS等[14]研究了豬腸道微生物組在7個時間點沿不同解剖部位的縱向變化，結(jié)果顯示年齡效應(yīng)在采樣的所有解剖部位中都很明顯。WANG等[15]對豬腸道微生物群從出生到市場進行了全面的動態(tài)的縱向研究，發(fā)現(xiàn)不同階段豬腸道微生物群可能由不同生長階段的飲食和/或腸道生理學(xué)差異決定。上述研究通過年齡、飲食、解剖部位等條件的變化調(diào)查了生豬腸道微生物群的組成和變化，評估的對象涉及雜交豬和商品豬。但跨境引種生豬純代培養(yǎng)期間在環(huán)境變化以及遺傳繁育過程中腸道菌群的變化和維持仍不清楚。

因此，本研究旨在揭示進境仔豬在遺傳及環(huán)境因素作用下腸道菌群的演替發(fā)育規(guī)律和變化趨勢，找出不同品種、不同日齡腸道菌群的關(guān)鍵差異菌屬，探討飼養(yǎng)方式和環(huán)境因素對腸道菌群的影響。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及分組采集相同飼養(yǎng)環(huán)境、飼養(yǎng)方式，同一批次法國引進種豬及其后代糞便樣本立即冷鏈運至實驗室，分組標(biāo)記后-80℃保存，開展豬糞便細菌16S rRNA基因的V3～V4區(qū)高通量測序，共計采集了36份合格樣品，樣品信息如表1所示。

表1 樣品信息表

1.2 儀器與試劑PCR擴增儀(ABI)；酶標(biāo)儀(BioTek)；電泳儀(北京六一生物科技有限公司)；凝膠成像系統(tǒng)(北京百晶生物技術(shù)有限公司)；QIAamp糞便DNA提取試劑盒(QIAGEN公司)；Q5?High-Fidelity DNA Polymerase(NEB公司)；Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit(Invitrogen公司)；Agarose(Invitrogen公司)；Marker(TaKaRa公司)；TAE(Invitrogen公司)；凝膠回收純化試劑盒(AXYGEN公司)；NanoDrop(Thermo Scientific公司)；TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit(Illumina公司)；MiSeq試劑盒V3(Illumina公司)。

1.3 樣品DNA提取和測序用QIAamp糞便DNA提取試劑盒提取樣品微生物基因組DNA，然后用NanoDrop ND 2000分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測樣品DNA的完整性。用Quant-iT PicoGreen dsDNA分析試劑盒和酶標(biāo)儀測定基因組DNA的質(zhì)量濃度，并將其稀釋至20 mg/L，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

針對16S rRNA V3～V4區(qū)域設(shè)計引物，用于樣品中細菌16S rRNA基因的V3～V4可變區(qū)測序，上游引物：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′；下游引物：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。擴增體系：5 μL反應(yīng)緩沖液(5×)、5 μL GC緩沖液(5×)、2 μL dNTP(2.5 mmol/L)、1 μL上游引物(10 μmol/L)、1 μL下游引物(10 μmol/L)、0.25 μL Q5?High-Fidelity聚合酶(NEB，USA)、2 μL DNA模板和8.75 μL ddH2O，共計25 μL。擴增條件：98℃預(yù)變性2 min；98℃變性15 s、55℃退火30 s、72℃延伸30 s、25個循環(huán)；72℃延伸5 min，10℃保溫。用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物，通過凝膠回收純化試劑盒回收純化目的片段。

1.4 測序文庫建立用TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit(Illumina公司)制備測序文庫。通過定量PCR對文庫進行定量，合格的文庫濃度應(yīng)在2 nmol/L以上。定量后，用Illumina MiSeq平臺和相應(yīng)的MiSeq試劑盒V3(Illumina公司)進行2×300 bp配對末端測序。對36個DNA樣品構(gòu)建測序文庫。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

1.5.1Illumina平臺對群落DNA片段進行雙端測序 通過質(zhì)量初篩的原始序列按照Index和Barcode信息，進行文庫和樣本劃分，去除Barcode序列。然后按照QIIME2 dada2或Vsearch軟件的分析流程進行序列去噪或OTU聚類分析。

1.5.2各組不同物種分類學(xué)水平的展示分析 使用QIIME2[16](2019.4版本)計算α多樣性并繪制稀疏曲線反映測序深度是否合適。使用非量度多維尺度分析(NMDS)和非加權(quán)配對平均法(UPGMA)衡量不同組間的β多樣性差異。通過R軟件繪制熱圖進行聚類分析。在QIIME2軟件中調(diào)用“qiime taxa barplot”命令，在物種分類學(xué)組成層面上進一步衡量不同組間的物種豐度組成差異，尋找標(biāo)志物種。通過PICRUSt微生物代謝功能預(yù)測工具，將樣本16S rRNA基因測序數(shù)據(jù)與MetaCyc (https://metacyc.org)，KEGG (http://www.genome.jp/kegg/pathway.html)數(shù)據(jù)庫進行比較，預(yù)測樣本的菌群代謝功能，分析差異通路。

2 結(jié)果

2.1 物種分類學(xué)注釋結(jié)果每個分類級別上的OTU數(shù)量統(tǒng)計結(jié)果如圖1所示，長白豬和杜洛克豬在各分類學(xué)水平上的OUT數(shù)無差異，皮特蘭豬在科水平上入境后(b組和d組)與入境時(a組)具有極顯著性差異，表明皮特蘭豬腸道菌群易受環(huán)境的影響。

A.物種分類學(xué)注釋；B，C，D.分別為長白豬、皮特蘭豬、杜洛克豬3個生長階段各分類水平的統(tǒng)計學(xué)分析。圖中(A)橫坐標(biāo)代表各組內(nèi)樣本(n=4)平均值，縱坐標(biāo)代表注釋結(jié)果中分類水平分別為門、綱、目、科、屬、種的ASV/OTU數(shù)圖1 物種分類學(xué)注釋

2.2 腸道微生物豐富度及多樣性的變化腸道微生物豐富度及多樣性圖2A所示，隨著樣品數(shù)量的增加，稀疏曲線逐漸飽和，說明36個樣品的微生物種群足以評估細菌豐富度和微生物群落多樣性。α多樣性指數(shù)結(jié)果如圖2(B、C、D)顯示，長白豬和杜洛克豬3組之間的豐富度和多樣性無顯著性差異。皮特蘭品種豬群落的豐富度和多樣性受環(huán)境影響大，入境后(b和d 2組)豐富度較入境時(a組)顯著增加；在我國飼養(yǎng)280 d后多樣性降低，但經(jīng)過傳代后菌群多樣性增加。初步說明環(huán)境和遺傳等因素對皮特蘭品種豬腸道菌群豐度和多樣性有顯著影響。

A.稀疏曲線；B，C，D.分別為長白豬、杜洛克豬、皮特蘭豬α多樣性指數(shù)豐度圖。圖中(A)橫坐標(biāo)為抽平深度，縱坐標(biāo)為10次計算的α多樣性指數(shù)的中位值與箱線圖。圖中(B、C、D)每個頂端灰色區(qū)域標(biāo)識對應(yīng)一種α多樣性指數(shù)，橫坐標(biāo)為分組標(biāo)簽，縱坐標(biāo)為相應(yīng)α多樣性指數(shù)的值圖2 稀疏曲線及α多樣性分析

2.3 腸道微生物β多樣性分析結(jié)果

2.3.1NMDS分析結(jié)果 NMDS分析結(jié)果如圖3所示，3個品種3組樣本之間的距離較大，表明入境后(b、d)與入境時(a)菌群組成差異顯著。3個品種均是b組的組內(nèi)樣本離散度小，說明在引進仔豬后飼養(yǎng)一段時間，樣本間菌群組成趨于相似，但在傳代后(d組)樣本間離散度再次變大，且長白豬的細菌群落組成最為多樣化。

NMDS分析認(rèn)為2點之間的距離越近(遠)，2個樣本中微生物群落的差異越小(大)，NMDS結(jié)果的應(yīng)力值(Stress)小于0.2時，NMDS分析的結(jié)果較可靠圖3 基于Bray-Curtis距離的NMDS分析

2.3.2層次聚類分析 UPGMA聚類分析(圖4A)結(jié)果顯示進境前后生豬腸道菌群的組成情況，進境前(a組)占比較高的菌屬是乳桿菌屬和不動桿菌屬；進境后(b組)占比較高的菌屬是鏈球菌屬；傳代后(d組)普氏菌、顫螺旋菌、布勞特氏菌和普拉梭菌占比接近。熱圖分析(圖4B)結(jié)果顯示前50個菌屬豐度隨環(huán)境的變化情況，菌群之間此消彼長，乳酸菌和不動桿菌豐度大量降低，普拉梭菌、普氏菌、顫螺菌屬、布勞特氏菌屬以及瘤胃球菌屬大量增加，且3個品種變化趨勢相同。

A.基于Bray-Curtis距離的層次聚類分析；B.熱圖分析。層次聚類分析左邊的面板是樣本根據(jù)彼此之間的相似度聚類，樣本間的分支長度越短，兩樣本越相似；右圖的面板為豐度排名前10的菌屬堆疊柱狀圖。熱圖分析橫坐標(biāo)為各組樣本名，縱坐標(biāo)為豐度前50的菌屬；右側(cè)豐度數(shù)值條，綠色到粉色表示菌屬豐度值由高到低圖4 層次聚類分析及熱圖分析

2.4 組間菌群組成差異分析由于3個品種菌群結(jié)構(gòu)的變化趨勢相同，因此在組間菌群組成差異分析中不對品種進行差異分析，只對3個批次的樣本進行差異分析。

在門級，OTU可以分為10個門，共享最多的OTU屬于厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門和梭桿菌門，其中厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門和約占總數(shù)的90%(圖5A)。統(tǒng)計分析圖(圖5B)結(jié)果顯示，在仔豬進境后，擬桿菌門和變形菌門的豐度有顯著差異(P<0.05)。其比例發(fā)生了變化：入境前(a組)變形菌門與擬桿菌們的比例接近于3∶1；入境后(b、d)變形菌門與擬桿菌門的比例接近1∶3，呈現(xiàn)完全相反的比例。且b、d 2組的變化趨勢相同，即進境仔豬在我國飼養(yǎng)280 d后腸道菌群組成發(fā)生巨大變化，且這種變化在傳代后也沒有逆轉(zhuǎn)。

A.門水平物種豐度圖；B.門水平物種差異分析圖；C.屬水平物種豐度圖；D.門水平物種差異分析圖圖5 物種組成分析

在屬級，如圖5C所示有20個屬被注釋。對柱狀圖中豐度較高的6個菌屬進行統(tǒng)計分析，結(jié)果如圖5D所示，入境前(a組)乳桿菌屬和不動桿菌屬豐度最高且與其他組有顯著性差異，入境后(b組)鏈球菌屬豐度最高且與其他組有極顯著差異，傳代后(d組)豐度較高的菌屬有普氏菌屬、顫螺旋菌屬、布勞特氏菌屬和普拉梭菌屬，但與其他組無顯著差異。柱狀圖和差異圖分析結(jié)果明顯表明，在境內(nèi)外飼養(yǎng)管理及環(huán)境條件變化下仔豬腸道菌群結(jié)構(gòu)差別很大，進一步說明飼養(yǎng)管理及環(huán)境變化導(dǎo)致菌群結(jié)構(gòu)的改變是導(dǎo)致性狀退化的重要原因之一。

2.5 代謝功能預(yù)測代謝功能單元Pcoa分析結(jié)果如圖6A所示，進境仔豬在我國經(jīng)過1次傳代后(d)，代謝功能組成上與入境前(a)已幾乎沒有交叉。將每組與代謝相關(guān)的糞便細菌樣本的注釋信息與MetaCyc數(shù)據(jù)庫以及KEGG數(shù)據(jù)庫進行比較并進行a和d 2組的差異分析，結(jié)果顯示引種仔豬傳代后(d組)的視黃醇代謝極顯著下調(diào)，細胞色素P450對異生素的代謝極顯著下調(diào)，氟苯甲酸甲酯降解功能顯著下調(diào)以及肽聚糖合成顯著下調(diào)(圖6B)。

A.功能單元Pcoa分析；B.代謝通路差異分析。注：圖A坐標(biāo)軸括號中的百分比代表對應(yīng)的坐標(biāo)軸所能解釋的樣本差異數(shù)據(jù)的比例；2點在坐標(biāo)軸上的投影距離越近，表明這2個樣本在相應(yīng)維度中的功能組成越相似；圖B中橫軸Log2(fold change)的正值代表變化組相對于對照組上調(diào)，負(fù)值為下調(diào)；縱坐標(biāo)為不同的代謝通路標(biāo)簽圖6 代謝功能預(yù)測

3 討論

豬的腸道微生物群是一個非常復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，隨著時間和胃腸道變化呈現(xiàn)出不同的動態(tài)組成和多樣性[17]。仔豬在出生過程和出生后會隨機接觸并獲取母豬產(chǎn)道、皮膚、糞便、母乳以及環(huán)境中的微生物，并迅速在自身腸道內(nèi)定植[18]，出生到斷奶后2周是仔豬腸道菌群定植與初步成熟的關(guān)鍵時期，早期腸道菌的定植和固化會影響豬后期的生長和生產(chǎn)性能[17,19]。研究表明仔豬斷奶后與母體分離、運輸、飲食和環(huán)境條件的變化，會對仔豬產(chǎn)生深刻影響[20]。在跨境引種這種環(huán)境條件巨變的情況下，必然會對斷奶仔豬腸道菌群產(chǎn)生影響，但影響的程度如何，且仔豬的變化會不會延續(xù)到下一代，還需后續(xù)深入研究。

經(jīng)過對3個時間段仔豬腸道菌群的監(jiān)測，我們發(fā)現(xiàn)，仔豬進境后經(jīng)過280 d飼養(yǎng)，皮特蘭豬腸道菌群多樣性降低，但在傳代后多樣性再次升高，顯示出環(huán)境和遺傳雙因素對腸道菌群的影響。進一步分析顯示，在進境時至傳代1次后，豬腸道菌群組成與剛進境時已完全不同，且b組和d組的變化趨勢相同，d組與a組即父代與子代有顯著性差異，說明環(huán)境因素對腸道菌群的影響更大，傳代并沒有逆轉(zhuǎn)環(huán)境導(dǎo)致的變化。XIAO等[21]對來自法國、丹麥和中國的287頭豬的糞便宏基因組進行了測序，發(fā)現(xiàn)性別、年齡和宿主遺傳因素可能會影響豬腸道微生物組。ROTHSCHILD等[22]對1 046名擁有相對共同的環(huán)境，具有幾個不同祖先起源的健康個體的基因型和微生物組數(shù)據(jù)進行分析，其研究結(jié)果表明基因型無關(guān)的個體具有相似的腸道微生物群組成，腸道微生物組與遺傳祖先沒有顯著的關(guān)聯(lián)。GOODRICH等[23]對英國的2 252對雙胞胎的研究結(jié)果顯示，只有1.9%～8.1%的微生物組群是可遺傳的?？梢娝拗鬟z傳在決定微生物組組成方面的作用很小。因此，在本研究除了環(huán)境和遺傳，還考察了品種和飼料對腸道菌群的影響。BIAN等[24]使用交叉飼養(yǎng)模型，首次揭示了品種對新生仔豬腸道菌群發(fā)育的影響，品種影響可能在整個時期持續(xù)存在，但所有仔豬同時攝入個體母豬奶和固體飼料的復(fù)雜性稀釋了品種對細菌的影響。這點在本研究熱圖分析中可以看出，3個品種菌群結(jié)構(gòu)變化趨勢相同，品種因素影響很小。

導(dǎo)致差異的菌屬，在門水平上厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門3個門占比達90%以上。擬桿菌門和厚壁菌門細菌是正常寄居在哺乳動物腸道的主要菌[25]。變形菌門是細菌中最大的一門，包括很多病原菌。在本研究中，進境仔豬腸道菌群中變形菌門豐度降低可以認(rèn)為是優(yōu)勢的變化。LAMENDELLA等[26]通過對豬宏基因組研究發(fā)現(xiàn)存在與抗生素抗性和碳水化合物代謝相關(guān)的基因，表明豬腸道微生物群可能受到飼養(yǎng)管理的影響，因此這種情況下需要考慮飼料等飼養(yǎng)管理方面的影響。

在屬水平，本研究發(fā)現(xiàn)進境后仔豬腸道內(nèi)乳桿菌屬豐度顯著低于進境時，且傳代后這種變化仍然存在；傳代后(d組)普氏菌屬豐度明顯增多。有多項研究表明乳桿菌是腸道中潛在的有益菌種，PERAN等[27]發(fā)現(xiàn)乳桿菌可以降低大鼠結(jié)腸炎模型中TNF-α的表達水平來減輕炎癥反應(yīng)；羅伊氏乳桿菌可以改善葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型小鼠的腸道炎癥并調(diào)節(jié)腸道微生物群和代謝紊亂[28]。普氏菌屬是人腸道微生物三大腸型代表菌屬之一，同時也是人腸道微生物的核心菌屬之一，多項研究表明其與胰島素抵抗、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和高血壓等疾病呈正相關(guān)[29]。斷奶后普氏菌豐度增加是由于它們能夠降解半纖維素例如植物性飼料中的木聚糖[26,30]，通過對差異菌屬的分析，我們發(fā)現(xiàn)飼料的因素是不可忽視的。目前我國用于配制豬飼料的能量飼料主要以玉米和豆粕為主，法國的飼料配方主要是大麥、小麥和高粱。全大麥、全小麥配制的豬飼料能夠提高肉豬瘦肉率、屠宰率、改善肉質(zhì)、提高肝臟重、降低十二指腸腸壁厚度[31]。但存在無法全部代替或容易導(dǎo)致豬腹瀉等瓶頸，這點或許可以解釋為什么進境前仔豬腸道內(nèi)變形菌門豐度高。

代謝功能預(yù)測發(fā)現(xiàn)，與仔豬剛進境時相比，傳代1次的d組仔豬幾種代謝功能顯著下調(diào)。視黃醇(維生素A)是一種脂溶性營養(yǎng)素[32]，是許多重要的生物功能的重要組成部分，包括生殖、胚胎發(fā)育、細胞分化、生長、免疫和視力[33]。細胞色素P450蛋白代表著具有廣泛重疊基質(zhì)特異性的亞鐵血紅素蛋白家族，負(fù)責(zé)許多外源性物質(zhì)和內(nèi)源性物質(zhì)的新陳代謝，如類固醇、脂肪酸和前列腺素。細胞色素P450蛋白在早期胚胎發(fā)育中起著關(guān)鍵作用，刪除細胞色素P450的小鼠胚胎在妊娠早到中期死亡[34]。肽聚糖是大多數(shù)細菌細胞壁的組成成分，是細菌主要承受壓力的結(jié)構(gòu)，也是真核生物免疫系統(tǒng)的有效刺激物[35]。目前來看，這些代謝功能的下調(diào)是劣勢的，提示我們在引種飼養(yǎng)中注意視黃醇等物質(zhì)補充。

綜上，本研究認(rèn)為環(huán)境變化導(dǎo)致腸道菌群結(jié)構(gòu)改變，菌屬之間的消長極有可能是優(yōu)良性狀快速退化的關(guān)鍵原因。遺傳和品種因素對腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響相對較小，研究中顯現(xiàn)出飼養(yǎng)管理及環(huán)境變化的影響，但仍需進行進一步研究驗證。