徐揚(yáng) 張冠初 丁紅 秦斐斐 張智猛 戴良香

（山東省花生研究所，青島 266100）

花生（Arachis hypogaea L.）是世界重要的油料作物之一，不僅可提供優(yōu)質(zhì)食用植物油，還具有豐富的蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)［1-2］。中國(guó)是世界上主要的花生生產(chǎn)國(guó)，總產(chǎn)、單產(chǎn)和產(chǎn)值均居世界第一。中國(guó)花生種植分布很廣，各地都有種植，主產(chǎn)區(qū)為河南、山東、河北、廣東、遼寧、四川、湖北、廣西、安徽、吉林、江西、湖南、福建、江蘇等省份［3-4］。因地域間社會(huì)、自然資源稟賦和土壤類(lèi)型差異，花生長(zhǎng)勢(shì)和產(chǎn)量不同。土壤是植物生長(zhǎng)發(fā)育的基礎(chǔ)，不同類(lèi)型的土壤理化特性和營(yíng)養(yǎng)元素不同，供應(yīng)作物生長(zhǎng)的養(yǎng)分存在差異，必然影響作物品質(zhì)和產(chǎn)量［5］。先前研究報(bào)道，不同土壤類(lèi)型對(duì)花生根系生長(zhǎng)、分布和產(chǎn)量均有影響，其中壤土較砂土和黏土具有更高的產(chǎn)量和有效果數(shù)［6］。不同土壤類(lèi)型花生品質(zhì)也存在差異和區(qū)域性，朱振林等［7］研究表明不同土壤類(lèi)型間各花生品質(zhì)指標(biāo)均有差異，脂肪和蛋白質(zhì)含量在地理空間分布上均呈明顯的變化趨勢(shì)，從北至南脂肪含量呈降低趨勢(shì)，而蛋白質(zhì)含量呈增高趨勢(shì)［8-9］。砂土土壤花生籽仁總糖、蔗糖含量和油酸/亞油酸比例明顯高于黏土［10］。另外不同土壤類(lèi)型理化特性和營(yíng)養(yǎng)元素也會(huì)影響植物根系外源分泌物，從而對(duì)根際微生物群落結(jié)構(gòu)有很大的調(diào)控作用［11-13］。但不同土壤類(lèi)型理化特性及營(yíng)養(yǎng)組成差異引起的花生根際微生物菌群結(jié)構(gòu)的空間分異與花生產(chǎn)量的關(guān)系尚不明確。研究花生與不同土壤類(lèi)型根際微生物菌群結(jié)構(gòu)間的復(fù)雜關(guān)系，揭示花生生產(chǎn)的區(qū)域土壤優(yōu)勢(shì)差異，以更有針對(duì)性地調(diào)控花生生產(chǎn)，對(duì)繼續(xù)保持花生產(chǎn)業(yè)穩(wěn)步發(fā)展至關(guān)重要。

植物根系向周?chē)寥婪置诨瘜W(xué)物質(zhì)和養(yǎng)分，吸引大量的微生物（包括細(xì)菌和真菌），形成一個(gè)以植物根為主體核心，以植物-土壤-微生物相互作用形成的微生態(tài)環(huán)境系統(tǒng)［14-16］。土壤類(lèi)型對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和種群代謝功能產(chǎn)生重大影響，是影響根際細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的重要因素之一［17-19］。相同土壤類(lèi)型通過(guò)不同栽培措施和肥料配施調(diào)控土壤微生物和花生產(chǎn)量的研究結(jié)果已有報(bào)道。如輪作栽培模式能提高花生根表有益微生物假單胞菌（Pseudomonas sp.）和白地霉（Geotrichum candidum）的豐度，降低病原菌比例，較連作栽培模式下產(chǎn)量提高45.8%、根瘤數(shù)提高57.5%、植株生物量提高24.1%［20］。持續(xù)施用生物有機(jī)肥可以改良紅壤理化環(huán)境，進(jìn)而優(yōu)化連作花生根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)并提高根際抗病性能，提高產(chǎn)量［21］。鹽堿土施加鈣肥和Arbuscular Mycorrhizal Fungi（AMF）菌肥也會(huì)改變花生根際微生物菌群結(jié)構(gòu)，提高氮固定相關(guān)細(xì)菌鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）的相對(duì)豐度，增強(qiáng)花生耐鹽性，百果重提高17.04%［22］。但是不同土壤類(lèi)型理化因子和營(yíng)養(yǎng)組成差異引起的花生根際微生物菌群結(jié)構(gòu)的空間分異及其與花生產(chǎn)量的關(guān)系目前研究較少。本研究旨在探討不同花生主產(chǎn)區(qū)主要土壤類(lèi)型對(duì)其根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和產(chǎn)量的影響。以不同花生主產(chǎn)區(qū)土壤（主要來(lái)源于河南、山東、河北、吉林、新疆和湖南等6個(gè)省份）為材料，設(shè)置盆栽實(shí)驗(yàn)，以成熟期花生根際土壤為研究對(duì)象，利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)土壤中細(xì)菌種類(lèi)及多樣性進(jìn)行系統(tǒng)分析，結(jié)合莢果產(chǎn)量，探討不同土壤類(lèi)型花生根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和產(chǎn)量的關(guān)系，明確土壤類(lèi)型優(yōu)勢(shì)，旨在為研究花生根際土壤類(lèi)型和菌群結(jié)構(gòu)平衡、優(yōu)質(zhì)花生生產(chǎn)提供參考，為花生主產(chǎn)區(qū)高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)栽培提供依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇花生品種花育25號(hào)（Huayu25）為試驗(yàn)材料。供試土壤為河南焦作潮褐土（簡(jiǎn)寫(xiě)為焦作潮褐土）、山東沂南褐土（簡(jiǎn)寫(xiě)為沂南褐土）、河北灤縣褐土（簡(jiǎn)寫(xiě)為灤縣褐土）、吉林公主嶺黑土（簡(jiǎn)寫(xiě)為黑土）、新疆石河子棕鈣土（簡(jiǎn)寫(xiě)為棕鈣土）和湖南邵陽(yáng)紅壤（簡(jiǎn)寫(xiě)為紅壤）6種。各土壤類(lèi)型采集地區(qū)經(jīng)緯度、年平均氣溫和年平均降水量見(jiàn)表1，土壤類(lèi)型營(yíng)養(yǎng)成分和理化因子見(jiàn)表2。

表1 不同土壤經(jīng)緯度、年平均氣溫和年平均降水量Table 1 Different soils latitude and longitude，annual average temperature，and annual mean precipitation

表2 不同土壤類(lèi)型營(yíng)養(yǎng)成分和理化因子分析Table 2 Analysis of nutrient components and physicochemical factors in different soil types

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)于山東省花生研究所試驗(yàn)站防雨棚中進(jìn)行，設(shè)置盆栽種植花生和盆栽不種植花生2個(gè)處理。采取的各地各類(lèi)型土壤風(fēng)干、過(guò)篩（1 cm）后裝入同規(guī)格塑料盆中（底部直徑為36 cm，高為26 cm），每盆裝土18 kg。選取子粒飽滿(mǎn)均勻的花生種子，每盆播6粒，播深3 cm，出苗后留取長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗4株，重復(fù)10次。5月10日播種，9月20日收獲，隔2日重量法補(bǔ)水，保持土壤濕度為田間持水量的75%-80%至收獲期。收獲時(shí)以多點(diǎn)混合采樣法分別采集各處理根際土壤樣本和非根際土壤樣品［23］。每3株花生根際土壤樣品和每3點(diǎn)采集的非根際土壤樣品分別混合為1個(gè)重復(fù)，每種土壤類(lèi)型3次重復(fù)。6種土壤類(lèi)型均設(shè)有對(duì)照非根際土和根際土。焦作潮褐土的非根際土和根際土樣品分別表示為HNCS、HNRS，沂南褐土非根際土和根際土樣品分別表示為SDCS、SDRS，灤縣褐土分別表示為HBCS、HBRS，黑土分別表示為JLCS、JLRS，棕鈣土分別表示為XJCS、XJRS，紅壤分別表示為HUCS、HURS。相關(guān)測(cè)試由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行。

1.2.2 土壤DNA提取及高通量測(cè)序 利用OMEGA土壤試劑盒（OMEGA soil DNA kit）對(duì)所采集的土壤樣本進(jìn)行DNA提取，Nanodrop 2000分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度，并根據(jù)260 nm/280 nm和260 nm/230 nm的比值評(píng)估DNA質(zhì)量，進(jìn)一步利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的完整性［24］。利用引物340F：5′-CCTACGGGNBGCASCAG-3′以 及805R：5′-GACTACNVGGGTATCTAATCC-3′，對(duì)土壤細(xì)菌16S rRNA基因V3-V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。應(yīng)用HiSeq2500平臺(tái)進(jìn)行PE250測(cè)序。使用Trimmomatic［25］（version 0.33）對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量過(guò)濾，去除adapter和尾部質(zhì)量值20以下的堿基，然后使用Cutadapt［26］（version 1.9.1）按照允許最大錯(cuò)配率20%，最小覆蓋度80%的參數(shù)進(jìn)行引物序列的識(shí)別與去除，其后使用USEARCH［27］（version 10）對(duì)雙端reads進(jìn)行拼接并去除嵌合體（UCHIME［28］version 8.1），最終得到高質(zhì)量的序列用于后續(xù)分析。相似度高于97%的定義為一個(gè)聚類(lèi)操作分類(lèi)單元（operational taxonomic units，OTUs），根據(jù)測(cè)序及計(jì)算結(jié)果進(jìn)行OTUs聚類(lèi)和物種分類(lèi)分析，然后在SILVA細(xì)菌16S rRNA數(shù)據(jù)庫(kù)（Release 119，http://www.arb-silva.de）中比對(duì)分析，得到每個(gè)樣本的OTUs分類(lèi)學(xué)注釋結(jié)果［29］。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 所有的測(cè)序數(shù)據(jù)在美吉I-Sanger云數(shù)據(jù)分析平臺(tái)上進(jìn)行在線(xiàn)數(shù)據(jù)分析（www.majorbio.com）。對(duì)根際土壤細(xì)菌群落多樣性和豐富度進(jìn)行α多樣性分析，包括繪制稀釋性曲線(xiàn)（rarefaction curve）、等級(jí)豐度曲線(xiàn)（rank abundance），以及Chao（度量豐富度）和Shannon指數(shù)（度量多樣性）分析［30］。稀釋性曲線(xiàn)趨于平緩或者達(dá)到平臺(tái)期時(shí)可認(rèn)為測(cè)序深度基本覆蓋到樣品中所有的物種［31］。等級(jí)豐度曲線(xiàn)可同時(shí)解釋樣品所含物種的豐富度和均勻度［32］。樣本間的β多樣性分析包括主坐標(biāo)分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）、樣本層次聚類(lèi)統(tǒng)計(jì)分析、相似性分析（ANOSIM），更深入挖掘樣本間的組成差異［33-36］。多組樣本菌群差異分析采用克氏秩和檢驗(yàn)（Kruskal-Wallis H test），土壤細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)與土壤理化因子之間的相關(guān)性通過(guò)redundancy analysis（RDA）預(yù)測(cè)［37-38］。

1.2.4 莢果產(chǎn)量測(cè)定 于成熟期各處理分別收獲并選取代表性植株15株，摘取所有具有經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量的莢果，自然曬干后考種、計(jì)產(chǎn)。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 18.0軟件中Student’s t-test（P=0.05）和單因素方差分析（One-Way ANOVA）進(jìn)行方差分析。利用Excel 2003和GraphPad Prism 7軟件作圖，圖表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果

2.1 不同土壤類(lèi)型營(yíng)養(yǎng)成分和花生莢果產(chǎn)量

6種土壤類(lèi)型具有不同的土壤營(yíng)養(yǎng)成分和理化因子，表2顯示黑土具有較高的土壤有機(jī)質(zhì)和堿解氮含量；棕鈣土較其他類(lèi)型土壤具有更高的速效鉀含量，但堿解氮含量較低；沂南褐土的速效磷含量高于其他土壤類(lèi)型；而紅壤各指標(biāo)均較低。除紅壤pH較低（4.8）為酸性土外，其余各土類(lèi)pH均在6.3（沂南褐土）以上，棕鈣土pH最高，為8.12。表3可以看出，不同地區(qū)莢果產(chǎn)量存在顯著性差異，黑土莢果產(chǎn)量最高，其次為棕鈣土和沂南褐土，紅壤花生百果重、百仁重以及莢果產(chǎn)量顯著低于其他幾種土壤類(lèi)型。

表3 不同土壤類(lèi)型對(duì)花生莢果產(chǎn)量的影響Table 3 Effects of soil types on pod yield of peanut

2.2 α多樣性分析

2.2.1 稀釋性曲線(xiàn)和等級(jí)豐度曲線(xiàn) α多樣性分析可以檢測(cè)土壤細(xì)菌群落的豐富度和多樣性，其中稀釋性曲線(xiàn)可以用來(lái)評(píng)價(jià)測(cè)序量是否足以覆蓋所有類(lèi)群，并間接反映樣本中物種的豐富程度。圖1-A所示，各樣本在測(cè)序量達(dá)到8 000時(shí)，所有土壤樣本曲線(xiàn)均趨于平緩，說(shuō)明測(cè)序深度足夠，基本覆蓋所測(cè)樣本內(nèi)的所有物種。等級(jí)豐度曲線(xiàn)能直觀地顯現(xiàn)各樣本物種的均勻度和豐富度，如圖1-B所示，當(dāng)OTU數(shù)量大于1 000時(shí)曲線(xiàn)較為平緩，物種分布較均勻。

2.2.2 Chao和Shannon指數(shù)分析 對(duì)6種土壤樣本的細(xì)菌α多樣性指數(shù)分析結(jié)果表明，黑土和紅壤細(xì)菌的豐富度（Chao指數(shù)）低于其他地區(qū)土壤樣本，并以紅壤的豐富度最低，且該土壤細(xì)菌多樣性（Shannon指數(shù)）也較低，而灤縣褐土細(xì)菌豐富度和多樣性均較高。另外，焦作潮褐土和棕鈣土的土壤樣本細(xì)菌多樣性也較高（圖1-C、D）。綜合分析，紅壤細(xì)菌豐富度和多樣性均低于其他土壤類(lèi)型，推測(cè)紅壤環(huán)境較不利于土壤細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖。

圖1 α多樣性分析Fig.1 α diversity analysis

2.3 物種組成及樣本間差異比較

2.3.1 全樣本門(mén)水平菌群結(jié)構(gòu)分析 由圖2可見(jiàn)，各土壤樣本均以放線(xiàn)菌門(mén)（Actinobacteria）、變形菌門(mén)（Proteobacteria）、綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）、酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）及芽單胞菌門(mén)（Gemmatimonadetes）等為共有優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，其相對(duì)豐度之和占總菌量的80%以上，但在不同類(lèi)型土壤樣本中存在明顯的菌群豐度差異。焦作潮褐土、沂南褐土、灤縣褐土、黑土以及棕鈣土中放線(xiàn)菌門(mén)和變形菌門(mén)均較豐富，但是紅壤中這些菌門(mén)的相對(duì)豐度顯著低于其他地區(qū)土壤樣本，綠彎菌門(mén)是其最豐富的細(xì)菌門(mén)類(lèi)，占總菌量的33.7%-52.3%。另外，根際土與非根際土細(xì)菌門(mén)豐度間有差異，紅壤根際土與非根際土各細(xì)菌菌門(mén)（包括放線(xiàn)菌門(mén)、變形菌門(mén)、綠彎菌門(mén)、酸桿菌門(mén)、芽單胞菌門(mén)以及厚壁菌門(mén)）豐度變化比其他地區(qū)大。灤縣褐土、黑土和棕鈣土3地區(qū)根際土酸桿菌門(mén)相對(duì)豐度低于非根際土，而變形菌門(mén)相對(duì)豐度高于非根際土。紅壤根際土中放線(xiàn)菌門(mén)、變形菌門(mén)、酸桿菌門(mén)和芽單胞菌門(mén)相對(duì)豐度高于非根際土，但是酸桿菌門(mén)相對(duì)豐度低于非根際土。

圖2 門(mén)水平各樣本細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)Fig.2 Bacterial community structure of each sample at the phylum level

2.3.2 全樣本綱、目、科水平菌群結(jié)構(gòu)分析 綱水平的分析結(jié)果（圖3-A）顯示，除紅壤外，其他地區(qū)土壤優(yōu)勢(shì)菌綱主要為放線(xiàn)菌綱（Actinobacteria）、α-變 形 菌 綱（Alphaproteobacteria）、γ-變 形 菌 綱（Gammaproteobacteria）、Subgroup_6和 芽 單 胞 菌綱（Gemmatimonadetes）。紅壤優(yōu)勢(shì)菌綱為放線(xiàn)菌綱（Actinobacteria）、α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）、纖線(xiàn)桿菌綱（Ktedonobacteria）、TK10和AD3（圖3-A）。目水平的分析結(jié)果（圖3-B）顯示，除紅壤外，其他地區(qū)土壤優(yōu)勢(shì)菌目主要為Gaiellales、根瘤菌目（Rhizobiales）、β-變形菌目（Betaproteobacteriales）、norank_c__Subgroup_6和鞘脂單胞菌目（Sphingomonadales），紅壤優(yōu)勢(shì)菌目為芽孢桿菌目（Bacillales）、norank_c__TK10、norank_c__AD3和纖線(xiàn)桿菌目（Ktedonobacterales）?？扑椒治鼋Y(jié)果（圖3-C）顯示，焦作潮褐土、沂南褐土、灤縣褐土和黑土優(yōu)勢(shì)菌科主要為norank_o__Gaiellales、norank_o__norank_c__Subgroup_6、鞘脂單胞菌科（Sphingomonadaceae）和芽單胞菌科（Gemmatimonadaceae），棕鈣土優(yōu)勢(shì)菌科為Nocardioidaceae、Geminicoccaceae和norank_o__norank_c__Gemmatimonadetes，紅壤以norank_o__norank_c__TK10、norank_o__norank_c__AD3和纖線(xiàn)桿菌科（Ktedonobacteraceae）為優(yōu)勢(shì)菌科。

圖3 綱、目、科水平各樣本菌群結(jié)構(gòu)Fig.3 Structure of bacterial community at the class，order and family level

2.3.3 全樣本屬水平菌群結(jié)構(gòu)分析 在屬層次上調(diào)查分析發(fā)現(xiàn)，所有菌屬的相對(duì)豐度均小于17%，菌屬數(shù)量較多，未命名菌屬比例較高，表明花生根際土壤細(xì)菌菌群多樣性高，菌群構(gòu)成較復(fù)雜（圖4-A）。6個(gè)地區(qū)的花生根際土壤和非根際土壤的菌群結(jié)構(gòu)在屬水平上差異較大，各樣品菌群分類(lèi)中相對(duì)豐度占比最高的前15個(gè)屬的豐度在不同地區(qū)存在顯著性差異（圖4-B）。不同土壤類(lèi)型優(yōu)勢(shì)菌屬顯著不同，焦作潮褐土優(yōu)勢(shì)菌屬為norank_f__norank_o__norank_c__Subgroup_6和norank_f__norank_o__Gaiellales，沂南褐土和黑土優(yōu)勢(shì)菌屬為norank_f__norank_o__Gaiellales、norank_f__norank_o__norank_c__Subgroup_6和鞘氨醇單胞菌屬，灤縣褐土優(yōu)勢(shì)菌屬為norank_f__norank_o__Gaiellales，棕鈣土優(yōu)勢(shì)菌屬為norank_f__norank_o__norank_c__Subgroup_6、norank_f__norank_o__norank_c__Gemmatimonadetes和norank_f__norank_o__Actinomarinales；而未分類(lèi) 菌 屬norank_f__norank_o__norank_c__TK10和norank_f__norank_o__norank_c__AD3以及鏈霉菌屬（Streptomyces）僅在紅壤中表現(xiàn)出較高豐度，為該土壤優(yōu)勢(shì)菌屬。在屬水平上，樣品間菌種豐度整體差異較大，并在個(gè)別菌種豐度上呈現(xiàn)出特有性。

圖4 屬水平各樣本細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)Fig.4 Bacterial community structure of each sample at the genus level

2.4 β多樣性分析

主坐標(biāo)分析是研究數(shù)據(jù)相似性或差異性的可視化方法，可以通過(guò)樣本點(diǎn)間的相互位置關(guān)系分析個(gè)體或群體間的差異。如圖5-A所示，紅壤細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)差異較大，單獨(dú)分布在一個(gè)象限，焦作潮褐土和棕鈣土分布于一個(gè)象限，其余地區(qū)土壤菌群相似度大，差異較小，分布于同一象限。同一樣本的3次重復(fù)間差異較小，分布較集中，說(shuō)明3次平行重復(fù)性較好。樣本層次聚類(lèi)分析顯示，同一土類(lèi)的根際和非根際土壤樣本重復(fù)聚集到同一分支，不同地區(qū)土壤樣本聚集于不同分支，距離較遠(yuǎn)，差異較大（圖5-B）。相似性分析顯示，不同地區(qū)土壤樣本組間差異較大，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于樣本組內(nèi)差異（R=0.931 2，P=0.01，圖5-C）。由此可知，不同土壤類(lèi)型細(xì)菌群落多樣性組間差異較大。

圖5 花生根際細(xì)菌群落β多樣性分析Fig.5 β diversity analysis of bacterial communities on the rhizosphere of A. hypogaea

2.5 土壤細(xì)菌菌群與土壤理化因子的相關(guān)性分析

本研究將6個(gè)不同地區(qū)不同類(lèi)型土壤的酸堿度（pH）、有機(jī)質(zhì)（ORM）、堿解氮（N），速效磷（P）和速效鉀（K）等因子作為土壤理化因子，與土壤門(mén)水平細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)細(xì)菌在門(mén)水平上的相對(duì)豐度與pH、ORM、N、P和K等理化因子間有顯著或極顯著相關(guān)性，其中，表現(xiàn)顯著或極顯著正相關(guān)的有擬桿菌門(mén)與pH、ORM、P和K間，芽單胞菌門(mén)與ORM、P和K間，變形菌門(mén)與ORM、N、P間，放線(xiàn)菌門(mén)、酸桿菌門(mén)和疣微菌門(mén)與N間，Patescibacteria、藍(lán)細(xì)菌門(mén)和硝化螺旋菌門(mén)與P間；而Rokubacteria僅與pH間呈極顯著正相關(guān)，與N間呈顯著負(fù)相關(guān)。綠彎菌門(mén)與GAL4與ORM、P和K間均呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)（圖6-A）。

樣品門(mén)分類(lèi)水平與土壤理化因子聚類(lèi)結(jié)果進(jìn)行RDA分析（圖6-B）。從圖中各理化因子箭頭與樣品中心連線(xiàn)的夾角大小可以看出，焦作潮褐土根際土與非根際土與pH、ORM、N、P和K間的夾角均為銳角，呈正相關(guān)；而紅壤根際土與非根際土與所有因子間均為鈍角，呈負(fù)相關(guān)。沂南褐土非根際土與ORM、N、P和K間為銳角，呈正相關(guān)，與pH間無(wú)相關(guān)性；而其根際土與所有土壤理化因子間的夾角均為鈍角，即均呈負(fù)相關(guān)。灤縣褐土非根際土與ORM、N和P間為銳角，呈正相關(guān)，與pH和K間為鈍角，呈負(fù)相關(guān)。黑土根際土與非根際土與ORM、N、P和K間的夾角為銳角，呈正相關(guān)，與pH間為鈍角，呈負(fù)相關(guān)。棕鈣土根際土與非根際土與pH和K間為銳角，呈正相關(guān)，與ORM、N和P間為鈍角，呈負(fù)相關(guān)。通過(guò)從樣品點(diǎn)向數(shù)量型環(huán)境因子的箭頭做投影，其投影點(diǎn)與原點(diǎn)的距離用于評(píng)價(jià)該環(huán)境因子對(duì)樣本群落分布相對(duì)影響的大小。各環(huán)境因子對(duì)焦作潮褐土、沂南褐土、灤縣褐土以及黑土影響力小于對(duì)棕鈣土和紅壤的影響力。各環(huán)境因子對(duì)棕鈣土影響程度的大小順序?yàn)閜H＞N＞K，而ORM和P兩理化因子未表現(xiàn)出對(duì)該樣品細(xì)菌菌群的影響力。各環(huán)境因子對(duì)湖南紅壤的影響程度較大，負(fù)相關(guān)性影響力大小順序?yàn)镻＞ORM＞K＞pH＞N。

圖6 各土壤樣品細(xì)菌群落與土壤理化因子的相關(guān)性分析Fig.6 Correlation analysis between soil bacterial community and soil physical and chemical factors

3 討論

根際土壤細(xì)菌作為根際-土壤-微生物微生態(tài)系統(tǒng)中關(guān)鍵參與者，在維持根際微生物生態(tài)平衡，協(xié)調(diào)植物生長(zhǎng)發(fā)育與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的攝取等方面具有重要作用［39］。本研究采用盆栽試驗(yàn)對(duì)分別從花生主產(chǎn)區(qū)河南、山東、河北、吉林、新疆、湖南等地采集的6種不同類(lèi)型的土壤的花生根際與非根際土壤細(xì)菌菌群多樣性進(jìn)行了研究，并對(duì)土壤細(xì)菌菌群與環(huán)境因子間的相關(guān)性進(jìn)行了分析。土壤樣本細(xì)菌菌群豐富度和多樣性分析顯示，紅壤細(xì)菌菌群豐富度和多樣性低于其他5個(gè)地區(qū)，而灤縣褐土、焦作潮褐土和棕鈣土土壤樣本細(xì)菌的多樣性均較高。在細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)分析上，不同地區(qū)土壤樣本中細(xì)菌組成具有一定的相似性，但是差異性明顯，個(gè)別菌群豐度上呈現(xiàn)出特有性。其中，紅壤中綠彎菌門(mén)的豐度特異性提高，其他土壤類(lèi)型放線(xiàn)菌門(mén)和變形菌門(mén)優(yōu)勢(shì)較明顯。RDA分析顯示土壤理化因子土壤pH、有機(jī)質(zhì)（ORM）、堿解氮（N）、速效磷（P）和速效鉀（K）等對(duì)樣品細(xì)菌菌群組成和物種豐度均有不同程度的影響。相同盆栽管理措施下以紅壤花生莢果產(chǎn)量最低。綜合本研究結(jié)果顯示，紅壤與其他土壤類(lèi)型相比其花生生產(chǎn)的土壤稟賦優(yōu)勢(shì)較低。

目前，分析土壤微生物α多樣性常用指數(shù)為Chao指數(shù)和Shannon指數(shù)。本研究通過(guò)對(duì)不同花生主產(chǎn)區(qū)根際與非根際土壤細(xì)菌的α多樣性研究表明，不同類(lèi)型土壤細(xì)菌的α多樣性指數(shù)不同，說(shuō)明不同地區(qū)土壤花生根際土壤細(xì)菌的豐富度和多樣性發(fā)生了改變，其中湖南邵陽(yáng)紅壤Chao指數(shù)和Shannon指數(shù)均最低。不同地區(qū)的土壤類(lèi)型、氣候以及品種特性和栽培方式都會(huì)影響土壤微生物的α多樣性［40-41］。在本研究中，供試土壤樣品均同時(shí)采自花生播種前，于相同處理和管理措施下進(jìn)行盆栽，因此不同地區(qū)各類(lèi)型土壤花生根際細(xì)菌的變化主要是來(lái)自于土壤類(lèi)型的差異。對(duì)不同地區(qū)土壤理化性質(zhì)研究表明，不同地區(qū)土壤pH、有機(jī)碳、堿解氮、速效磷和速效鉀均出現(xiàn)差異，土壤細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)與多種土壤理化因子具有顯著相關(guān)性，但理化因子之間的相互作用機(jī)制和對(duì)微生物群落的影響方式還需進(jìn)一步深入研究。紅壤有機(jī)碳、速效磷和速效鉀均低于其他地區(qū)，pH較低，細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)與各土壤理化因子呈顯著負(fù)相關(guān)性，故與多種土壤理化因子顯著負(fù)相關(guān)的細(xì)菌門(mén)如綠彎菌門(mén)與GAL4在該土壤中特異性提高，但與土壤理化因子正相關(guān)的細(xì)菌門(mén)如變形菌門(mén)、芽單胞菌門(mén)和擬桿菌門(mén)在該土壤中豐度很低。相關(guān)性分析結(jié)果與土壤細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)分析兩結(jié)果互相佐證。

植物和微生物共存于土壤，土壤微生物的生長(zhǎng)繁殖直接或間接受植被覆蓋的影響，并且其種類(lèi)和多樣性易受土壤類(lèi)型、肥料種類(lèi)及栽培方式的影響［42］。本研究發(fā)現(xiàn)，不同地區(qū)土壤理化性質(zhì)互有差異，導(dǎo)致各地區(qū)土壤細(xì)菌結(jié)構(gòu)也不相同，說(shuō)明適應(yīng)于某類(lèi)微生物生長(zhǎng)的土壤類(lèi)型未必適應(yīng)其他微生物類(lèi)群的生存，這也是土壤微生物對(duì)于土壤生境具有選擇適應(yīng)性的體現(xiàn)，與之前研究報(bào)道一致［43］。南方酸性紅壤呈現(xiàn)酸、粘、瘠、毒的特點(diǎn)，土壤環(huán)境惡劣，與其他地區(qū)菌群結(jié)構(gòu)差異尤其大。綠彎菌門(mén)在紅壤中豐度最高，占總菌量的33.7%-52.3%。綠彎菌門(mén)是一個(gè)深度分支的門(mén)級(jí)別細(xì)菌類(lèi)群，形態(tài)多樣，代謝途徑十分豐富，參與了碳、氮、硫等一系列重要營(yíng)養(yǎng)元素的循環(huán)過(guò)程［44］。張靜等［45］對(duì)紅壤水稻土中的微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)研究表明，酸化土壤中綠彎菌門(mén)的相對(duì)豐度最高，與本文的研究結(jié)果一致。Epelde等［46］對(duì)長(zhǎng)期遭受重金屬污染的土壤微生物進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示綠彎菌門(mén)的相對(duì)豐度隨污染物濃度的增高而不斷增加，說(shuō)明綠彎菌門(mén)對(duì)外界惡劣環(huán)境的抵抗力較強(qiáng)。因而，綠彎菌門(mén)能夠耐受酸性紅壤環(huán)境，通過(guò)改善土壤中的碳、氮循環(huán)來(lái)促進(jìn)自身生長(zhǎng)繁殖，成為該類(lèi)土壤中最豐富的細(xì)菌門(mén)類(lèi)。

土壤微生物對(duì)于植物的生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要，研究不同產(chǎn)地花生根際土壤微生物與土壤理化性質(zhì)之間的關(guān)系，對(duì)揭示不同地域花生生長(zhǎng)發(fā)育、因地制宜增產(chǎn)增效具有重要意義。根據(jù)不同土壤細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，沂南褐土、黑土以及棕鈣土中變形菌門(mén)豐富度高于紅壤，屬水平鞘氨醇單胞菌屬在沂南褐土和黑土也較高。莢果產(chǎn)量統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示，黑土、棕鈣土和沂南褐土莢果產(chǎn)量顯著高于紅壤。推測(cè)根際土壤變形菌門(mén)和鞘氨醇單胞菌屬可能與花生產(chǎn)量有一定關(guān)系，其相對(duì)豐度的增高可能對(duì)花生生長(zhǎng)和莢果產(chǎn)量提高有幫助。變形菌門(mén)能夠利用有機(jī)物分解產(chǎn)生的氨氣、甲烷等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行生長(zhǎng)代謝活動(dòng)［47］，其豐度隨土壤全氮含量和有機(jī)碳含量的增加而提高［48］，本研究中變形菌門(mén)與土壤有機(jī)物含量呈顯著正相關(guān)，有機(jī)物含量較高的土壤（黑土以及棕鈣土）中其豐度均較豐富，與之前研究結(jié)果一致。變形菌門(mén)利用有機(jī)碳為土壤提供固氮能力并促進(jìn)土壤養(yǎng)分碳、硫循環(huán)［49-50］，鞘脂單胞菌屬主要參與土壤中芳香族化合物的降解及碳循環(huán)過(guò)程［51］，可以改善土壤環(huán)境、降解有毒物質(zhì)，二者可能為花生根系生長(zhǎng)提供良好微環(huán)境，在一定程度上促進(jìn)花生形態(tài)建成，進(jìn)一步提高花生莢果產(chǎn)量。未來(lái)將分離純化變形菌門(mén)中優(yōu)勢(shì)菌群和鞘脂單胞菌屬，按需接種到根際周?chē)?，結(jié)合花生植株形態(tài)和莢果產(chǎn)量統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，深入驗(yàn)證根際土壤變形菌門(mén)和鞘脂單胞菌屬在花生生長(zhǎng)發(fā)育和莢果產(chǎn)量中的生物學(xué)作用。分離純化并培養(yǎng)利于植物存活和生長(zhǎng)的微生物，結(jié)合不同花生主產(chǎn)區(qū)土壤微生物菌群結(jié)構(gòu)差異，因地制宜地改良土壤微生物環(huán)境對(duì)不同花生主產(chǎn)區(qū)土壤的高效利用和花生高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)具有指導(dǎo)意義。

4 結(jié)論

本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)和莢果產(chǎn)量分析，明確了6種不同土類(lèi)花生根際土壤細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)特征及其與花生產(chǎn)量的關(guān)系。湖南邵陽(yáng)紅壤中綠彎菌門(mén)優(yōu)勢(shì)最明顯，其他土壤類(lèi)型放線(xiàn)菌門(mén)和變形菌門(mén)優(yōu)勢(shì)較明顯。變形菌門(mén)和鞘氨醇單胞菌屬可能分別是與花生莢果產(chǎn)量提高相關(guān)的有益菌門(mén)和菌屬。相同盆栽管理措施下以紅壤花生莢果產(chǎn)量最低，紅壤與其他土壤類(lèi)型相比其花生生產(chǎn)的土壤稟賦優(yōu)勢(shì)較低。