高小寧 劉睿 吳自林 吳嘉云

（1. 廣東省科學院南繁種業(yè)研究所，廣州 510316；2. 廣州甘蔗糖業(yè)研究所湛江甘蔗研究中心，湛江 524300）

甘蔗（Saccharum spp. hybrids）是我國最重要的糖料作物，宿根栽培因其節(jié)種、省工、早熟及節(jié)本增效成為一項重要的甘蔗栽培制度［1］。甘蔗宿根矮化?。╮atoon stunting disease，RSD）是由木質(zhì)部賴氏菌木質(zhì)部亞種（Leifsonia xyli subsp. xyli）引起的一種世界范圍廣泛發(fā)生的細菌性病害。感染RSD的甘蔗植株出現(xiàn)矮化、分蘗減少、節(jié)間縮短，蔗糖分降低，在宿根蔗中極易發(fā)生［2］。對我國甘蔗主產(chǎn)區(qū)（廣西、云南、廣東和海南）的12個蔗區(qū)和15個甘蔗栽培品種的調(diào)查和檢測發(fā)現(xiàn)，RSD在我國主蔗區(qū)發(fā)生普遍，是影響宿根蔗產(chǎn)量的重要因素之一［3］。尤其是在干旱條件下，RSD可導致60%的產(chǎn)量損失及蔗糖分降低0.5%［4］。為了有效控制宿根矮化病在生產(chǎn)中所帶來的產(chǎn)量和經(jīng)濟損失，自該病害被報道以來，研究人員從組織形態(tài)變化、生理生化特性、基因表達特征、蛋白組學等不同方面研究了甘蔗與RSD致病菌的互作機制，從而為了解RSD發(fā)生規(guī)律和有效防控措施的提出奠定了理論基礎(chǔ)［5-8］。

植物內(nèi)生微生物生活于健康植物的各種組織和器官的細胞間隙或細胞內(nèi)部，在與寄主植物的長期協(xié)同進化過程中形成互惠共存、相互制約的和諧關(guān)系。內(nèi)生微生物決定著宿主植物的健康、生長發(fā)育以及次生代謝等，并賦予其更廣泛的環(huán)境適應(yīng)能力［9］。同時，植物自身的基因型也能夠影響植物內(nèi)生微生物的多樣性［10］。Walitang等［11］發(fā)現(xiàn)水稻自身的基因型是影響其種子內(nèi)生細菌組成的重要因素。在對甘蔗屬不同種和品種根系內(nèi)生細菌的多樣性研究中，Dong等［12］發(fā)現(xiàn)4個甘蔗屬和2個甘蔗栽培品種內(nèi)生細菌的群落多樣性和豐富度呈現(xiàn)出顯著 不同。

在甘蔗微生物與RSD互作關(guān)系的研究中，楊尚東等［1，13］比較了RSD感病與非感病植株根際和根系內(nèi)生細菌的群落結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示相較于未感病植株，RSD感病植株根際細菌和根系內(nèi)生細菌優(yōu)勢菌群的豐度和排位順序發(fā)生了顯著變化，這種細菌多樣性的顯著下降、特有內(nèi)生細菌優(yōu)勢菌屬和菌種數(shù)量減少是甘蔗植株抗病性降低的重要原因。目前，有關(guān)蔗莖內(nèi)生真菌和細菌的多樣性與甘蔗抗感RSD是否存在關(guān)聯(lián)還未見相關(guān)研究報道。為此，本研究采用Illumina Miseq高通量測序平臺，通過對不同抗感RSD甘蔗品種蔗莖內(nèi)生真菌和細菌組成結(jié)構(gòu)和多樣性的分析，旨在揭示內(nèi)生真菌和細菌在甘蔗抗病中的作用，從而為構(gòu)建生態(tài)防控RSD提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣地概況 采樣地位于廣東省韶關(guān)市翁源縣官渡鎮(zhèn)東三村甘蔗試驗基地（24°16′59″N，113°56′24″E），該區(qū)域?qū)儆诖竺娣e甘蔗種植區(qū)。供試甘蔗品種均于2017年4月份種植于試驗基地，按照常規(guī)大田管理措施進行栽種。

1.1.2 樣品采集 2020年10月中旬在甘蔗生長期的末期分別采集宿根矮化病高感品種粵糖60（YT60）和抗病品種HoCP95988宿根3年的蔗莖［4，14］。選取的植株應(yīng)為無任何病蟲害危害癥狀，用經(jīng)75%酒精消毒后的砍刀砍取距地面50 cm的蔗莖，表面消毒后去除蔗莖外皮，將莖內(nèi)組織放入無菌的自封袋中，置于低溫采樣箱帶回實驗室，-80℃冷凍保存，用于DNA提取和高通量測序。每個品種按照五點取樣法取5株蔗莖，共計10個樣品。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取、PCR擴增及高通量測序 采用FastDNA?Spin Kit按照說明書進行蔗莖總DNA的提取，每個品種包括5個重復蔗莖DNA。經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質(zhì)量和濃度。對內(nèi)生細菌16S rRNA 基因V5-V7區(qū)進行PCR擴增，引物 為799F（5′-AACMGGATTAGATACCCKG-3′）和1193R（5′-ACGTCATCC CCACCTTCC-3′）；對內(nèi)生真菌rDNA ITS1區(qū)進行PCR擴增，引物為ITS1F（5′- CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）和ITS1R（5′-G- CTGCGTTCTTC ATCGATGC-3′）。PCR擴 增 體 系（25 μL）：5×reaction buffer 5 μL，5×GC buffer 5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）2 μL，正、反向引物（10 umol/L）各1 μL，DNA 模板2 μL，ddH2O 8.75 μL，Q5 DNA Polymerase 0.25 μL。PCR反應(yīng)條件：98℃ 2 min；98℃ 15 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，30個循環(huán)；72℃ 5 min。PCR擴增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用QIA DNAMicroKit（QIAGEN公司）回收目的條帶產(chǎn)物。委托上海派森諾生物科技有限公司使用Illumina Miseq高通量測序。

1.2.2 數(shù)據(jù)處理及分析 利用Illumina MiSeq平臺對群落DNA片段進行雙端（Paired-end）測序，測序原始數(shù)據(jù)采用DADA2方法［15］進行去引物、質(zhì)量過濾、去噪、拼接和去嵌合體等步驟，產(chǎn)生的每個去重的序列ASVs（amplicon sequence variants）用于后續(xù)分析。細菌和真菌分別選用Greengenes 和 UNITE數(shù)據(jù)庫進行物種分類學注釋?；谛蛄形锓N分類學注釋的結(jié)果，獲得每個樣本中真菌和細菌群落在各分類水平的具體組成；使用軟件QIIME2（2019.4）分析微生物群落的Alpha多樣性。

2 結(jié)果

2.1 蔗莖內(nèi)生真菌和細菌群落測序數(shù)據(jù)及其多樣性指數(shù)

2.1.1 測序數(shù)據(jù) 通過對2個品種10個蔗莖樣品進行16S rRNA 基因和ITS基因的高通量測序，分別獲得1 121 670和995 478條有效序列（表1）。其中，感病品種YT60蔗莖內(nèi)生真菌的有效序列高于抗病品種HoCP95988，而內(nèi)生細菌有效序列少于品種HoCP95988。品種YT60蔗莖內(nèi)生細菌和真菌分別有3 061和176個ASVs，HoCP95988蔗莖內(nèi)生細菌和真菌的ASVs僅有1 365和96個。

2.1.2 Alpha多樣性分析 Alpha多樣性提供了樣本內(nèi)微生物群落的豐富度和多樣性信息。為了能全面地評估蔗莖內(nèi)生細菌和真菌群落的多樣性，本研究對供試樣本的Chao1、Observed species、Shannon和Simpson指數(shù)進行了比較，結(jié)果詳見表1。感病品種YT60內(nèi)生細菌的 Chao1和Observed species指數(shù)顯著高于抗病品種HoCP95988（P＜0.05），但Shannon和Simpson指數(shù)無顯著差異。內(nèi)生真菌群落的多樣性指數(shù)分析顯示：兩個供試品種的Shannon和Simpson指數(shù)存在顯著性差異（P＜0.05），且感病品種YT60的多樣性指數(shù)明顯高于抗病品種HoCP95988。

表1 不同甘蔗品種蔗莖內(nèi)生真菌和細菌測序數(shù)據(jù)、分類單元及多樣性指數(shù)Table 1 Sequencing data, ASVs and diversity index of endophytic fungi and bacteria in the stalks of different sugarcane cultivars

2.2 蔗莖內(nèi)生真菌和細菌類群組成分析

2.2.1 內(nèi)生細菌類群組成分析 蔗莖內(nèi)生細菌群落在門水平上的組成和豐度如圖1-A所示。在門的分類水平上，2個品種蔗莖樣品共檢測到17個細菌門。內(nèi)生細菌主要分布在變形菌門Proteobacteria、放線菌門Actinobacteria、厚壁菌門Firmicutes、異常球菌-棲熱菌門Deinococcus-Thermus、擬桿菌門Bacteroidetes，其中變形菌門為最優(yōu)勢菌門，占比86.2%-92.7%。同一生境下抗感病品種蔗莖內(nèi)生細菌門的相對豐度不同，放線菌門和芽單胞菌門Gemmatimonadetes的相對豐度在YT60（8.36%和1.15%）中明顯高于HoCP95988（1.69%和0.003%），而異常球菌-棲熱菌門在YT60（0.22%）中的相對豐度卻低于HoCP95988（2.54%）；此外，僅在感病品種YT60中檢測到浮霉菌門（Planctomycetes）。在屬分類水平上，水小桿菌屬Aquabacterium（11.06%-13.86%）、柄 桿 菌 屬Caulobacter（6.22%-11.22%）、Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia（5.59%-16.05%）、新鞘脂菌屬Novosphingobium（2.48%-2.60%）在供試品種中均有較高的相對豐度（圖2-A）。同時，發(fā)現(xiàn)放線桿菌屬Actinobacillus在抗病品種HoCP95988中為優(yōu)勢屬（9.99%）。

2.2.2 內(nèi)生真菌類群組成分析 甘蔗蔗莖內(nèi)生真菌群落在門水平上的組成和豐度如圖1-B所示。在真菌門分類水平上，2個品種蔗莖內(nèi)生真菌主要的門有子囊菌門（Ascomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）、被孢霉門（Mortierellomycota）。其中子囊菌門占主導地位，占真菌總數(shù)的77.4%-80.9%，其次為擔子菌門，占比為10.2%-14.8%。此外，感病品種YT60單獨檢測到Rozellomycota、壺菌門（Chytridiomycota）、芽枝霉門（Blastocladiomycota）。在真菌的屬分類水平上（圖2-B），擬青霉屬Simplicillium（14.35%-18.78%）、曲霉屬Aspergillus（6.92%-12.97%）和馬拉色菌屬Malassezia（5.74%-6.70%）在2個樣品中均有較高豐度。但是，不同抗感病品種中真菌屬的豐度出現(xiàn)差異，如鏈格孢屬Alternaria在抗病品種HoCP95988中為優(yōu)勢屬，占比18.78%；而腐質(zhì)霉屬Humicola和鐮刀菌屬Fusarium在感病品種YT60中有較高豐度，占比分別為13.12%和7.96%。

圖1 不同甘蔗品種蔗莖內(nèi)生細菌（A）和真菌（B）菌群門分類水平結(jié)構(gòu)組成Fig. 1 Dominant phyla detected from endophytic bacterial（A）and fungal（B）community in the stalks of different suga-rcane cultivars

圖2 不同甘蔗品種蔗莖內(nèi)生細菌（A）和真菌（B）菌群屬分類水平結(jié)構(gòu)分布圖Fig. 2 Dominant genera detected from endophytic bacterial（A）and fungal（B）community in the stalks of different sugarcane cultivars

2.3 蔗莖內(nèi)生真菌和細菌群落物種差異分析

維恩圖（Venn）可以直觀地表現(xiàn)不同樣品間微生物群落ASVs 數(shù)目組成相似性、重疊情況以及特異性。根據(jù)抗感病甘蔗品種蔗莖細菌和真菌的ASVs繪制Venn圖，結(jié)果如圖3所示：品種YT60和HoCP95988蔗莖內(nèi)生細菌中共有的ASVs為247個，占全部ASVs的5.91%；蔗莖內(nèi)生真菌的共有ASVs為24個，占比9.72%；2個品種的蔗莖細菌和真菌中各自特有的ASVs均超過90%。以上數(shù)據(jù)表明，宿根矮化病抗感病品種的蔗莖內(nèi)生真菌和細菌類群存在明顯差異。

圖3 不同甘蔗品種蔗莖內(nèi)生細菌（A）和真菌（B）ASV維恩圖Fig. 3 ASV Venn diagram of endophytic bacteria（A）and fungi（B）in the stalks of different sugarcane cultivars

LEfSe（LDA Effect Size）分析可以直接對所有分類水平同時進行差異分析，并從分組之間找到穩(wěn)健的差異物種?？垢胁「收崞贩N蔗莖內(nèi)生細菌LEfSe分析結(jié)果如圖4所示：供試品種在浮霉菌門（Planctomycetes）、綠彎菌門（Chloroflexi）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）和軟壁菌門（Tenericutes）的4個門、33個科和34個屬的物種組成上存在顯著差異。在差異物種中，僅有柄桿菌目（Caulobacterales）中的柄桿菌科（Caulobacteraceae）在抗病品種HoCP95988有較高豐度，其余的物種均在感病品種YT60呈現(xiàn)較高豐度。然而，與蔗莖細菌群體組成差異不同，蔗莖真菌的物種組成在2個品種間僅有一個分類單元（糞殼菌目Sordariales）表現(xiàn)出顯著差異，且該分類單元在YT60中具有較高豐度。

圖4 不同甘蔗品種間蔗莖內(nèi)生細菌LEfSe分析的物種分類學分枝圖Fig. 4 LEfSe cladogram of endophytic bacteria in the stalks of different sugarcane cultivars

3 討論

植物內(nèi)生微生物是植物微生態(tài)系統(tǒng)中必不可少的組成部分，其與寄主植物在長期的共同進化中，形成了緊密的共生關(guān)系，在促進植物生長、增強植物抗逆能力、調(diào)節(jié)寄主體內(nèi)微生態(tài)平衡等方面發(fā)揮著重要作用［16］。已有研究表明，植物生長的環(huán)境條件（季節(jié)變化、地理位置、栽培措施等）、不同組織器官（根、莖、葉、花、果實等）、寄主的基因型、發(fā)育階段、健康狀態(tài)和功能性狀等對植物內(nèi)生微生物的菌群組成和多樣性會產(chǎn)生重要影響［17-19］。蘋果樹枝條、葉片［20］和梨果實［21］內(nèi)生細菌的種群組成和功能在品種間存在較大差異。同時，研究表明植物的抗病性是驅(qū)動內(nèi)生微生物群落變化的重要因素。Kiani等［22］通過常規(guī)的分離培養(yǎng)方法研究了條銹病抗感小麥品種根、莖和葉部內(nèi)生細菌的組成，發(fā)現(xiàn)抗、感病品種間內(nèi)生細菌數(shù)量差異顯著，抗病品種豐度高于感病品種。采用高通量測序技術(shù)對大斑病抗、感玉米品種葉際細菌群落組成的分析顯示，抗病品種細菌多樣性指數(shù)高于感病品種，且品種間細菌群落組成差異顯著［23］。針對不同抗感病特性的甘蔗品種與其內(nèi)生微生物之間的互作關(guān)系卻較少受到關(guān)注。本研究利用 Illumina Miseq 高通量測序技術(shù)分析了RSD抗感病甘蔗品種內(nèi)生細菌和真菌的多樣性和群落組成，發(fā)現(xiàn)甘蔗的抗病表型能夠影響蔗莖內(nèi)生細菌和真菌群落的豐富度和多樣性；與抗感病小麥、玉米品種內(nèi)生細菌群落組成差異表現(xiàn)不同，RSD感病品種YT60的內(nèi)生細菌和真菌多樣性指數(shù)高于抗病品種HoCP95988，具有更為復雜的物種組成。然而，在樣品選擇中本研究只關(guān)注了生長健康的抗感病品種內(nèi)生細菌和真菌組成的多樣性和差異，并未比較RSD侵染后不同品種內(nèi)生細菌和真菌群落組成變化特征。Ginnan等［24］分析了黃龍病引發(fā)的柑橘葉、莖稈和根組織細菌和真菌的多樣性和組成，結(jié)果顯示柑橘核心微生物菌群和群落多樣性受到病菌侵染的不同時期和病害發(fā)生嚴重程度的影響。那么，宿根矮化病菌的侵染如何影響甘蔗莖部內(nèi)生微生物的組成將是下一步研究內(nèi)容之一。

已有較多研究關(guān)注了甘蔗根際和根系內(nèi)生細菌的多樣性及其功能性菌株的開發(fā)和利用［12，25］，但是對甘蔗蔗莖內(nèi)生微生物群落多樣性的分析還相對較少。本研究對2個甘蔗品種蔗莖內(nèi)生細菌多樣性進行的比較分析顯示，變形菌門為優(yōu)勢菌群，分別覆蓋了供試品種內(nèi)生細菌的86.2%-92.7%，表明在門分類水平上蔗莖內(nèi)生細菌群體組成相似。這與甘蔗根系內(nèi)生細菌組成的研究結(jié)果基本一致［1］。在屬級分類水平上，蔗莖內(nèi)生微生物種類較多，感病品種的多樣性較抗病品種豐富，優(yōu)勢菌群存在較大差異?？共∑贩NHoCP95988內(nèi)生細菌中有較多鞘氨醇菌屬、芽孢桿菌屬、黃桿菌屬、假單胞菌屬等具有抑菌作用、促生活性和抗逆功能的類群［26-28］。RSD病原菌所屬的賴氏菌屬Leifsonia在感病品種YT60的健康蔗莖中有較高豐度，這符合宿根矮化病無癥狀帶菌的特性［29］。有關(guān)甘蔗內(nèi)生真菌的組成一直未見報道。本研究基于ITS區(qū)的分析較為全面的描述了蔗莖內(nèi)生真菌的組成：子囊菌門和擔子菌門為優(yōu)勢菌門；擬青霉屬、曲霉屬、鏈格孢屬、鐮刀菌屬和馬拉色菌屬等在屬水平具有較高豐度。以上研究結(jié)果將為進一步分離和挖掘?qū)Ω收岵【哂修卓购涂共」δ芫晏峁┝司€索。

本研究采用高通量測序技術(shù)分析了宿根矮化病抗感品種蔗莖內(nèi)生細菌和真菌的多樣性和種群組成。在今后的研究工作中，將進一步分析不同抗病水平、不同發(fā)育階段以及不同種屬甘蔗資源內(nèi)生微生物群落組成和變化與宿根矮化病菌的互作關(guān)系。這些研究將有助于更為全面地揭示內(nèi)生微生物與甘蔗抗病性之間的關(guān)系，從而為RSD的生態(tài)防控提供理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

宿根矮化病抗感2個甘蔗品種莖部內(nèi)生細菌和真菌的多樣性較為豐富，感病品種YT60 Alpha多樣性指數(shù)高于抗病品種HoCP95988?？垢胁∑贩N間莖部內(nèi)生細菌和真菌的類群明顯不同，主要菌群的組成和豐度存在顯著差異，部分優(yōu)勢菌群豐度的差異可能在一定程度上影響了甘蔗對宿根矮化病的抗性。差異物種的分類信息為宿根矮化病生防菌的挖掘和利用提供了依據(jù)。