徐紅云 張明意

（貴州民族大學生態(tài)環(huán)境工程學院，貴陽 550025）

非生物脅迫嚴重影響植物的生長發(fā)育，造成農林生產的重大損失［1］。滲透脅迫是限制植物生長、分布，影響作物產量的重要因素之一，會導致細胞水分缺失而引起損傷［2］。干旱、鹽害、低溫和冰凍災害等都會引起滲透脅迫。為了適應滲透脅迫，植物在生理生化方面會發(fā)生改變，如關閉氣孔、增加過氧化物酶活、積累滲透物質等，以適應逆境脅迫［3-4］。同時，滲透脅迫會誘導大量抗逆基因的表達，來調控植物的生理變化。

GRAS家族為植物體內一類非常重要的轉錄因子，GRAS蛋白有1個可變的N末端區(qū)域和1個高度保守的C末端區(qū)域。GRAS蛋白含有5個關鍵結構域：LHR-I、VHIID、LHR-II、PFYRE和SAW［5］。擬南芥GRAS蛋白可分為10個亞家族，即LISCL、AtPAT1、AtSCL3、DELLA、AtSCR、AtSHR、AtLAS、HAM、AtSCL4/7、DLT［6］。截至目前，已從多種植物中鑒定出多個GRAS家族成員，如在楊樹、擬南芥和水稻中分別鑒定出有106、34和60個GRAS家族基因［7］，此外，在煙草［8］、青梅［9］、大白菜［10］、番茄［11］、蓮藕［12］等植物中也分別鑒定出GRAS基因。

GRAS轉錄因子參與調控植物應答各種非生物脅迫。例如，水稻OsGRAS23可被干旱、NaCl和茉莉酸誘導表達，并且OsGRAS23過表達轉基因植株可通過減少H2O2含量和促進抗氧化相關基因的表達，進而提高植物抗旱性和抗氧化性［13］。山葡萄VaPAT1轉入擬南芥，轉基因植株可通過增加脯氨酸和可溶性糖含量，提升植株的耐寒性、耐旱性和耐鹽性；此外，VaPAT1可誘導抗逆相關基因的表達，如AtSIZ1、AtCBF1、ATATTR1、MYB34、AtMYC2、AtCOR15A、AtRD29A和AtRD29B等［14］。楊樹GRAS蛋白PeSCL7通過增強α-淀粉酶和超氧化物歧化酶活性，提高了植物應對干旱和高鹽的耐受性［15］。鹽穗木HcSCL13基因的過表達提高植株的耐鹽性［16］。盡管從不同的植物中克隆出許多GRAS基因，但GRAS家族基因調控植物響應滲透脅迫的生理和分子機制還有待進一步深入研究。

AtSCL4為GRAS轉錄因子家族中非常重要的一個成員，但目前對其功能研究較少。本研究通過比較野生型和AtSCL4突變體擬南芥應對滲透脅迫的抗逆能力差異，并分析不同植株間生理及相關抗逆基因的表達情況，為GRAS蛋白在非生物脅迫中的功能研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

野生型擬南芥（Arabidopsis thaliana，WT）為Columbia（Col）生態(tài)型，由東北林業(yè)大學林木遺傳育種實驗室提供。AtSCL4（AT5G66770）T-DNA插入突變體植株（SALK_031569）購買自擬南芥生物資源中心（Arabidopsis Biological Resource Center，ABRC）。

1.2 方法

1.2.1 AtSCL4受滲透脅迫誘導表達分析 3周齡的野生型擬南芥用200 mmol/L甘露醇處理3、6、12、24和48 h后分別取樣，以0 h清水處理為對照。根和葉分開取樣后，用液氮速凍后放-80℃保存。提取植株RNA，利用qRT-PCR方法測定AtSCL4在不同處理條件下及不同組織中的表達量。

1.2.2 非生物脅迫耐受實驗 用10%次氯酸鈉消毒W(wǎng)T和AtSCL4純合突變體的種子，放置在添加200 mmol/L甘露醇的1/2 Murashige Skoog（MS）培養(yǎng)基上培養(yǎng)，7 d后計算幼苗發(fā)芽率。將WT和AtSCL4突變體的種子放置在1/2 MS培養(yǎng)基上生長4 d后，將幼苗轉移至含200 mmol/L甘露醇的1/2 MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d，測定苗根長和鮮重。

1.2.3 逆境相關生理指標測定 氣孔孔徑測定：將3周齡擬南芥葉片下表皮剝離，浸泡在30 mmol/L KCl和10 mmol/L MES-KOH（pH6.15）的 溶 液 中， 22℃培養(yǎng)2.5 h，誘導氣孔開放，然后添加200 mmol/L甘露醇，再孵育2 h。在光學顯微鏡下（Olympus BX43，Japan）觀察氣孔孔徑，并使用IMAGEJ 1.36b軟件測量氣孔開放度。

葉片失水率測定：將3周齡擬南芥的葉片剝離植株后立即稱量鮮重（fresh weight，F(xiàn)W），然后每30 min稱一次分離葉片失水后重量（leaf desiccated weight，LDW）。4 h后，將葉片置于80℃烘箱中過夜后稱量干重（dry weight，DW）。失水率（water loss rates，WLR）計算公式為：WLR（%）=［（FWLDW）/（FW-DW）］×100%。

葉片組織染色：用水和200 mmol/L甘露醇處理3周齡的野生型和突變體植株24 h后取葉片，浸泡在3，30-二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB，1.0 mg/mL）和硝基四氮唑藍（nitroblue tetrazolium，NBT，1 mg/mL）溶液中染色，保持真空15 min后于黑暗處反應6 h，然后用95%乙醇于沸水浴脫色。

脯氨酸、甜菜堿和抗氧化酶活測定：用200 mmol/L甘露醇處理3周齡野生型和突變體植株3 d后，采用ELISA試劑盒測定脯氨酸、甜菜堿、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和過氧化物酶（peroxidase，POD）等指標。

1.2.4 抗逆基因的qRT-PCR檢測 用TRIzol試劑（Invitrogen）提取植物總RNA，用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix kit（TRANSGEN BIOTECH）試劑盒合成cDNA，并稀釋10倍用于下一步試驗。qRT-PCR反應體系包括10 μL TransStart-Top-Green-qPCR-SuperMix（TRANSGEN BIOTECH）、10 μmol/L正 向 和 反 向 引 物 和2 μL cDNA稀釋產物。采用熒光定量PCR儀進行產物擴增（qTOWER3，Analytikjena，德國）。qRT-PCR反應條件為94℃ 30 s；94℃ 10 s，58℃ 30 s，72℃ 40 s，79℃ 1 s，read plate，44個反應循環(huán)；55-99℃， 每0.5℃維持1 s。選擇Act7（AT5G09810）和Tub2（AT5G62690）為內參，對目標基因表達進行標準化。并用2-ΔΔCT方法計算抗逆基因的相對表達量，用-ΔΔCT方法計算AtSCL4在突變體中的表達情況，qRT-PCR的引物見表1。

表1 qRT-PCR所用引物序列Table 1 Primer sequences used in qRT-PCR

1.2.5 基因序列號 本文的序列數(shù)據(jù)可以在擬南芥信息資源（http://www.arabidopsis.org/）中找到下列基因序列號：AtSCL4（AT5G66770）、ATMYB61（AT1G09540）、P5CS1（AT2G39880）、BADH（AT3G48170）、SOD1（AT1G08830）、PER4（AT1G14540）。

2 結果

2.1 AtSCL4受滲透脅迫誘導表達分析

利用qRT-PCR方法分析AtSCL4是否受滲透脅迫所誘導（圖1），與未處理對照相比，甘露醇脅迫下，AtSCL4在根和葉中的表達量明顯升高，在葉片中的表達水平隨處理時間變化逐漸升高并在12 h時達到高峰，在根系當中在24 h時達到高峰。結果表明，AtSCL4受滲透脅迫誘導表達明顯。

圖1 甘露醇處理下AtSCL4基因在不同時間段的表達分析Fig. 1 Expression profiles of AtSCL4 at different times in response to mannitol stress

2.2 AtSCL4負向調控植物應對滲透脅迫的耐受性分析

運用qRT-PCR的方法驗證篩選出的AtSCL4擬南芥純和突變體（圖2），KO1-KO8株系的表達量均低于野生型對照，說明T-DNA的插入阻礙了AtSCL4的表達，并且KO1、KO6和KO8株系中AtSCL4的表達量顯著降低（P＜0.05），被用作后續(xù)試驗。

圖2 AtSCL4在突變體中的表達量分析Fig. 2 Expression analysis of AtSCL4 in mutants

比較野生型擬南芥（WT）和AtSCL4突變體株系（KO1、KO6、KO8）在滲透脅迫下種子的萌發(fā)和生長情況（圖3）。在正常條件下，WT和AtSCL4突變體株系的幼苗萌發(fā)、生長表型、根長和鮮重沒有差異，但在甘露醇脅迫下，KO植株幼苗發(fā)芽率、根長和鮮重顯著高于WT（圖3）。結果顯示，敲除AtSCL4提高擬南芥應對滲透脅迫的耐受性。

圖3 滲透脅迫下AtSCL4調控苗的萌發(fā)和生長分析Fig. 3 Analysis of seedling germination and growth regulated by AtSCL4 under osmotic stress

2.3 滲透脅迫下AtSCL4負向調控氣孔開度

為了研究AtSCL4是否影響擬南芥的蒸騰作用，測定不同株系葉片的失水率。滲透條件下WT的失水率顯著高于KO植株（圖4-A），KO植株表現(xiàn)出更強的保水能力。由于水分損失與氣孔開度關系密切，因此對葉片氣孔開度進行了測定。在正常條件下，WT和KO植株的氣孔開度沒有明顯差異。但在甘露醇脅迫下，與野生型相比，KO不同植株的氣孔孔徑顯著減?。▓D4-B、C）。結果表明，AtSCL4可能通過負向調控氣孔開度和葉片水分蒸騰來提高植物的抗?jié)B透脅迫能力。進一步測定與調節(jié)氣孔孔徑有關的AtMYB61的表達情況。正常情況下，不同株系間AtMYB612的表達無顯著差異（圖4-D）。當植物暴露于甘露醇脅迫時，與WT相比，KO株系中AtMYB61的轉錄水平顯著上調（圖4-D），表明在滲透脅迫下AtSCL4可能負向調控AtMYB61的表達，進而調節(jié)氣孔開放度。

圖4 滲透脅迫下AtSCL4調控苗的氣孔開放度分析Fig. 4 Stomatal aperture assay of seedlings regulated by AtSCL4 under osmotic stress

2.4 滲透脅迫下AtSCL4負向調控滲透物質的積累

為了確定AtSCL4是否能調節(jié)植物滲透物質的合成而應對逆境脅迫，測定脯氨酸和甜菜堿的含量。與野生型相比，KO株系在甘露醇脅迫下顯著提高了脯氨酸和甜菜堿的含量（圖5-A、B）。隨后，測定了一個脯氨酸生物合成基因（P5SC1）和一個甜菜堿生物合成基因（BADH）在不同株系的表達量，甘露醇脅迫下，P5SC1和BADH在KO植株中顯著上調。以上結果表明，AtSCL4可能負向調節(jié)脯氨酸和甜菜堿代謝基因，促進滲透物質積累，從而提高AtSCL4突變體對滲透脅迫的耐受性。

圖5 滲透脅迫下AtSCL4調控苗滲透物質合成分析Fig. 5 Synthesis analysis of osmolyte in seedlings mediated by AtSCL4 under osmotic stress

2.5 滲透脅迫下AtSCL4負向調控ROS清除能力

通過NBT和DAB染色法測定葉片中O2-·和H2O2的含量。發(fā)現(xiàn)在正常生長條件下，野生型和突變體植株葉片經(jīng)NBT和DAB染色后沒有差異（圖6-A、B）。然而，甘露醇脅迫下，野生型葉片的顏色明顯比突變體深，表明AtSCL4突變體株系的O2-·和H2O2含量顯著降低。此外，為測定不同植株對活性氧（reactive oxygen species，ROS）的清除能力，分別測定植株POD和SOD活性。在甘露醇脅迫下，KO植株的SOD和POD活性顯著高于WT植株（圖6-C、D）。同時，進一步測定SOD基因（AtSOD1）和POD基因（PER4）在不同植株中表達情況。在甘露醇脅迫下，AtSOD1和PER4在KO植株中顯著上調（圖6-E、F）。以上結果表明，滲透脅迫下AtSCL4對SOD和POD基因的表達具有負調控作用。

圖6 滲透脅迫下AtSCL4調控苗活性氧清除能力分析Fig. 6 ROS scavenging capacity assay of seedlings regulated by AtSCL4 under osmotic stress

3 討論

植物遭受逆境脅迫的時候，易引起氣孔的關閉而減少因蒸騰作用造成葉片水分缺失的情況。Zhang等［17］研究發(fā)現(xiàn)毛果楊PtrWRKY75過表達可減小氣孔開放度而提高植株抗旱能力。本研究發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象，應對滲透脅迫，AtSCL4突變植株減小氣孔孔徑以防止葉片水分損失。前期報道發(fā)現(xiàn)擬南芥R2R3-MYB轉錄因子AtMYB61能夠調控氣孔開度［18］，本研究發(fā)現(xiàn)滲透脅迫下，AtMYB61在AtSCL4突變植株中顯著上調表達，所以推測AtSCL4可能負調控AtMYB61的表達，控制氣孔關閉，減少水分流失，但后期還需要結合更多的方法驗證這一結論。

植物受到滲透脅迫，一些調節(jié)滲透壓的物質（如脯氨酸、可溶性糖和甜菜堿）就會被誘導合成以適應脫水脅迫［19］。脯氨酸、可溶性糖和甜菜堿可以保護植物細胞膜系統(tǒng)免受非生物脅迫的傷害［20］。Yuan等［14］發(fā)現(xiàn)山葡萄轉錄因子VaPAT1正調控脯氨酸和可溶性糖積累，增強轉基因擬南芥的耐寒性、耐旱性和耐鹽性。P5CS和BADH分別編碼脯氨酸和甜菜堿生物合成的關鍵酶［21-22］，本研究發(fā)現(xiàn)，脯氨酸和甜菜堿在AtSCL4突變植株中顯著富集，且P5SC1和BADH在KO植株中上調表達明顯。結果表明，AtSCL4可能通過負調控脯氨酸和甜菜堿代謝基因的表達，進而影響脯氨酸和甜菜堿生物合成，而調控植物的抗?jié)B透脅迫能力。

ROS清除對植物耐受非生物脅迫具有重要意義。非生物脅迫下，植物易積累大量的活性氧而引起植物損傷和突變、阻礙代謝功能和造成細胞死亡［23］。本研究發(fā)現(xiàn)AtSCL4可能負調控AtSOD1和PER4的表達，提高SOD和POD活性，增強植物對活性氧的清除能力，從而提高其抗?jié)B透脅迫能力，該研究結果與Wang等［24］研究類似。

4 結論

滲透脅迫下，AtSCL4可能負向調控AtMYB61、P5SC1、BADH、AtSOD1和PER4等基因的表達，而減小氣孔開度、增加滲透物質（脯氨酸、甜菜堿）合成和提高抗氧化酶（SOD和POD）活性，提高植物抗?jié)B透能力。