周?chē)?guó)彥 銀珊珊 高佳鑫 武春成 閆立英 謝洋

（河北科技師范學(xué)院園藝科技學(xué)院 河北省園藝種質(zhì)資源挖掘與創(chuàng)新利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，秦皇島 066004）

細(xì)胞分裂素是重要的植物激素之一，通過(guò)調(diào)控植物組織或細(xì)胞的分化與生長(zhǎng)，影響植物的生長(zhǎng)與發(fā)育［1］。細(xì)胞分裂素還通過(guò)抑制植物中葉綠素、核酸、蛋白質(zhì)等物質(zhì)的分解，將必需的氨基酸、激素、無(wú)機(jī)鹽等化合物重新分配到植物的其他部位，從而阻礙植物衰老［2］。越來(lái)越多研究表明，細(xì)胞分裂素在調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育和逆境響應(yīng)等方面發(fā)揮重要的作用［3-4］。

組氨酸磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（histidine phosphotransfer proteins，AHP）是細(xì)胞分裂素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的正向調(diào)控蛋白［5］。在細(xì)胞質(zhì)中，受體組氨酸蛋白激酶（histidine kinases，HK）與細(xì)胞分裂素結(jié)合后自磷酸化，AHP上保守的組氨酸位點(diǎn)自動(dòng)識(shí)別來(lái)自HK的磷酸基團(tuán)，并將磷酸基團(tuán)從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核上的系列反應(yīng)調(diào)節(jié)因子（response regulators，RR），激活下游相關(guān)基因完成細(xì)胞分裂素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，從而調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育［6］。據(jù)報(bào)道，擬南芥中有6個(gè)AHP基因家族成員，其中AHP2、AHP3和AHP5響應(yīng)鹽、干旱脅迫，其三重突變體ahp2，3，5對(duì)鹽和干旱的耐受性顯著增強(qiáng)［7］；水稻中有5個(gè)AHP基因家族成員，其中OsAHP1和OsAHP2的RNAi轉(zhuǎn)基因株表現(xiàn)出對(duì)鹽敏感且對(duì)干旱耐性增強(qiáng)的特性［8］；小麥中有4個(gè)AHP基因家族成員，其中TaAHP4響應(yīng)鹽、干旱和脫落酸脅迫且為抑制表達(dá)［9］。

黃瓜是重要的世界性蔬菜之一［10-11］。聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織（FAO）2020年統(tǒng)計(jì)，我國(guó)黃瓜栽培面積與產(chǎn)量躍居全球第一，占比分別為全球56.4%和81.2%。黃瓜是喜溫不耐高溫、抗旱能力弱、不耐弱光的蔬菜作物。當(dāng)光照強(qiáng)度低于外界自然光照的1/2時(shí)，其同化量基本不增加，影響最終產(chǎn)量和效益［12］。因此，低溫弱光、高溫、干旱等非生物脅迫是限制黃瓜高效生產(chǎn)和品質(zhì)育種的重要因子［13-15］。AHP作為細(xì)胞分裂素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要調(diào)控者，在逆境脅迫響應(yīng)方面發(fā)揮著重要作用［16］。然而，關(guān)于黃瓜AHP基因家族鑒定及其在系列非生物脅迫下基因表達(dá)情況鮮見(jiàn)報(bào)道。

本研究對(duì)黃瓜AHP基因家族進(jìn)行鑒定，系統(tǒng)分析其進(jìn)化關(guān)系、基因結(jié)構(gòu)、順式作用元件及其在非生物脅迫下表達(dá)模式，為進(jìn)一步探究黃瓜AHP基因的功能和提高植物的非生物脅迫耐受性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)于2021年4-7月在河北科技師范學(xué)院園藝實(shí)驗(yàn)樓人工氣候室內(nèi)進(jìn)行。將黃瓜‘津研四號(hào)’（購(gòu)于山東魯蔬種業(yè)有限責(zé)任公司）播種于草炭∶蛭石∶珍珠巖=3∶1∶1混合基質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)缽中，置于溫室中培養(yǎng)（晝/夜溫度為25℃/16℃，光照14 h/黑暗8 h）。將25 d苗齡的幼苗進(jìn)行不同脅迫處理：干旱（3 d，50%田間持水量）、高溫（42℃，48 h）、低溫弱光（3 d，光照強(qiáng)度2 klx，晝/夜溫度為12℃/8℃，7 d）。采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，每種處理3次重復(fù)，混合取樣，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 黃瓜AHP基因家族成員鑒定 利用Pfam在線(xiàn)軟件（http://pfam.xfam.org/）檢索擬南芥AHP蛋白，獲取AHP結(jié)構(gòu)特征序列的種子文件PF01627，隨后通過(guò)HMMER 3.0軟件以該種子文件為索引在黃瓜數(shù)據(jù)庫(kù)（http://cucurbitgenomics.org/，V3版本）中檢索，獲得與該蛋白結(jié)構(gòu)特征相匹配的序列，即為黃瓜AHP家族候選成員［17］。利用NCBI（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）在線(xiàn)網(wǎng)站Blastp驗(yàn)證已獲得的黃瓜AHP家族候選成員，具有AHP結(jié)構(gòu)域的候選蛋白即為黃瓜AHP家族成員，將編碼這些蛋白質(zhì)的基因定為CsAHP基因。

1.2.2 黃瓜AHP基因家族的染色體定位與共線(xiàn)性分析 利用Map Inspect軟件分析AHP家族基因在染色體上的分布情況。在黃瓜基因組內(nèi)進(jìn)行BLASTP搜索（E＜1×10-5），利用MCScanX軟件進(jìn)行共線(xiàn)性區(qū)塊預(yù)測(cè)（閾值≤1×10-5）［18］。

1.2.3 黃瓜AHP基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建 分別在黃瓜、擬南芥tair和葫蘆科數(shù)據(jù)庫(kù)（CuGenDB，http://cucurbitgenomics.org/）下載黃瓜、擬南芥、南瓜、西瓜、甜瓜、冬瓜、西葫蘆、葫蘆等蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)，提取其AHP基因家族的蛋白序列，利用MEGA 6.0軟件，采用Neighbor-Joining方法，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)［19］。

1.2.4 黃瓜AHP基因順式作用元件預(yù)測(cè) 從黃瓜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中提取CsAHP基因5′UTR上游1 000 bp序列，提交至PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）數(shù)據(jù)庫(kù)，用于基因啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件分析［20］。

1.2.5 黃瓜AHP家族成員基因結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域分析 從黃瓜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中提取黃瓜AHP家族基因的DNA、CDS和氨基酸序列；利用MEME（http://meme-suite.org/tools/meme）網(wǎng)站在線(xiàn)分析該家族共有的保守結(jié)構(gòu)；利用TBtools展示基因結(jié)構(gòu)和保守基序圖［21］。

1.2.6 黃瓜AHP基因的表達(dá)模式分析 樣品總RNA提取和cDNA合成分別采用RNAprep Pure Plant Kit和FastKing RT Kit（With gDNase）試劑盒（天根，中國(guó)）。利用Beacon Designer 7.0軟件進(jìn)行基因引物設(shè)計(jì)，并委托中美泰和生物技術(shù)（北京）有限公司合成引物（表1）。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（伯樂(lè)CFX96 Touch）進(jìn)行實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)與數(shù)據(jù)分析［22］。利用前人報(bào)道的黃瓜RNA-Seq數(shù)據(jù)信息，獲取黃瓜在鹽脅迫［23］、硅［24］、高溫/低溫/長(zhǎng)日照/短日照［25］、開(kāi)花前后［26］、正常子房與超級(jí)子房不同發(fā)育時(shí)期［27］等中AHP家族基因的表達(dá)量（每百萬(wàn)reads中來(lái)自某基因每千堿基長(zhǎng)度的reads數(shù)，RPKM）信息，再利用Cluster 3.0和Tree View軟件進(jìn)行基因表達(dá)量分析。

表1 qRT-PCR引物設(shè)計(jì)Table 1 qRT-PCR primer design

2 結(jié)果

2.1 黃瓜AHP基因家族成員鑒定、染色體定位與共線(xiàn)性分析

在黃瓜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)Cucumber（Chinese Long）v3 Genome中，共檢索到8條與AHP結(jié)構(gòu)序列特征相匹配的蛋白序列（E-value＜0.01）。利用NCBI在線(xiàn)網(wǎng)站blastp驗(yàn)證候選基因蛋白序列的保守性，鑒定結(jié)果顯示，有7條序列含有AHP結(jié)構(gòu)序列特征，說(shuō)明黃瓜AHP基因家族有7個(gè)成員。依據(jù)蛋白序列檢索的score值由高到低，依次將其命名為CsAHP1-CsAHP7。

染色體定位結(jié)果（圖1）顯示，這7個(gè)AHP成員不均勻分布于黃瓜6條染色體上，而第5染色體上不存在AHP基因。CsAHP1（CsaV3_6G005590.1）、CsAHP2（CsaV3_7G035290.1）、CsAHP3（CsaV3_1G039330.1）、CsAHP5（CsaV3_2G030700.1）和CsAHP6（CsaV3_4G001620.1）分別成功定位到黃 瓜Chr.6、Chr.7、Chr.1、Chr.2和Chr.4染 色 體上，基因CsAHP4（CsaV3_3G014010.1）和CsAHP7（CsaV3_3G023600.1）成功定位到黃瓜Chr.3染色體上。利用MCScanX軟件進(jìn)行共線(xiàn)性預(yù)測(cè)（閾值≤1×10-5），發(fā)現(xiàn)這7個(gè)基因不存在片段重復(fù)或串聯(lián)重復(fù)等基因復(fù)制現(xiàn)象。

圖1 黃瓜AHP基因家族成員染色體定位分布圖Fig. 1 Chromosome location distribution map of AHP gene family members in C. sativus

2.2 黃瓜AHP基因家族系統(tǒng)進(jìn)化分析

為揭示黃瓜AHP蛋白與模式作物擬南芥及葫蘆科其他物種的AHP蛋白親緣關(guān)系，利用MEGA7.0軟件對(duì)黃瓜（Cs）、擬南芥（At）、南瓜（Cmo）、西瓜（Cla）、甜瓜（MEL）、冬瓜（Bhi）、西葫蘆（Cp）、葫蘆（Lsi）的AHP蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果 （圖2）顯示，黃瓜、擬南芥和葫蘆科AHP家族蛋白可以分為4個(gè)大的亞群（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ），其中Ⅱ類(lèi)亞群（16個(gè)成員）中，黃瓜CsAHP2和CsAHP7分別與冬瓜Bhi09M000375和甜瓜MELO3C030799.2.1 親緣關(guān)系最近，Ⅲ類(lèi)亞群（7個(gè)成員）中，黃瓜CsAHP5與甜瓜MELO3C030319.2.1親緣關(guān)系最近；Ⅳ類(lèi)亞群（31個(gè)成員）中，黃瓜CsAHP1、CsAHP3、CsAHP4、CsAHP6分別與冬瓜Bhi12M001571、甜瓜MELO3C015359.2.1、擬南芥AT3G21510.1（AtAHP1）、冬瓜Bhi01M002749親緣關(guān)系最近；而Ⅰ類(lèi)亞群（2個(gè)成員）中沒(méi)有黃瓜AHP家族成員。

圖2 黃瓜、擬南芥和葫蘆科AHP家族成員進(jìn)化樹(shù)分析Fig. 2 Phylogenetic tree analysis of AHP family members in C. sativus，Arabidopsis thaliana and Cucurbitaceae

2.3 黃瓜AHP基因順式作用元件分析

為預(yù)測(cè)黃瓜AHP基因的調(diào)控方式，利用PlantCARE軟件對(duì)該基因家族啟動(dòng)子區(qū)的序列進(jìn)行順式作用元件分析。結(jié)果（圖3）顯示，黃瓜AHP基因家族成員含有CAAT-box、TATA-box、光響應(yīng)（13種，I-box、LAMP-element、TCT-motif、GATA-motif、TCCC-motif、MRE、GT1-motif、AAAC-motif、G-box、ACE、ATCT-motif、Box 4、AE-box）、低溫響應(yīng)（1種，LTR）、干旱響應(yīng)（1種，MBS）、激素響應(yīng)（8種，TGA-element、TATC-box、TCA-element、ABRE、CGTCA-motif、TGACG-motif、P-box、TGA-box）、厭氧響應(yīng)（2種，ARE、GC-motif）、玉米蛋白代謝響應(yīng)（1種，O2-site）和防御與應(yīng)激（1種，TC-rich repeats）等29種作用元件。

圖3 黃瓜AHP家族基因啟動(dòng)子序列順式作用元件分析Fig. 3 Analysis of cis-acting element in promoter sequence of AHP family gene in C. sativus

黃瓜AHP基因家族7個(gè)成員均含有光響應(yīng)作用元件，CsAHP1、CsAHP2和CsAHP3含有赤霉素響應(yīng)作用元件，CsAHP2、CsAHP3和CsAHP6含有脫落酸響應(yīng)作用元件，CsAHP2、CsAHP4和CsAHP5含有生長(zhǎng)素響應(yīng)作用元件，CsAHP2和CsAHP5含有茉莉酸甲酯響應(yīng)作用元件，CsAHP5和CsAHP7含有干旱脅迫響應(yīng)作用元件，CsAHP1和CsAHP7含有低溫脅迫響應(yīng)作用元件。

2.4 黃瓜AHP家族成員基因結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域 分析

基因結(jié)構(gòu)分析（圖4）顯示，黃瓜CsAHP1、CsAHP2、CsAHP3、CsAHP4、CsAHP5和CsAHP7均含有6個(gè)外顯子，而CsAHP6僅含有5個(gè)外顯子。黃瓜AHP家族蛋白含8個(gè)保守motif，其中CsAHP1、CsAHP2、CsAHP7均 含Motif1-Motif6，CsAHP3含Motif1-Motif3和Motif5-Motif7，CsAHP4含Motif1-Motif5，CsAHP6含Motif1-Motif3、Motif5、Motif7-Motif8。

圖4 黃瓜AHP家族基因結(jié)構(gòu)與保守結(jié)構(gòu)域分析Fig. 4 Gene structure and conservative domain analysis of AHP family in C. sativus

2.5 黃瓜AHP基因在發(fā)育和非生物脅迫下的表達(dá)模式分析

利用前人發(fā)表的黃瓜表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫(kù)，提取鹽脅迫、硅脅迫、高/低溫且長(zhǎng)/短日照脅迫、不同開(kāi)花時(shí)期、超級(jí)子房與正常子房等非生物脅迫和發(fā)育時(shí)期的AHP家族基因表達(dá)譜信息（RPKM值）。結(jié)果 （圖5）表明，鹽脅迫下CsAHP1、CsAHP3和CsAHP4顯著下調(diào)表達(dá)，尤其CsAHP4在對(duì)照和處理組中基因表達(dá)量的差異倍數(shù)達(dá)15倍；高溫長(zhǎng)日照/短日照和低溫長(zhǎng)日照/短日照條件下，基因表達(dá)模式相近，均為CsAHP1和CsAHP4高，其余表達(dá)量都低；硅脅迫下CsAHP3顯著上調(diào)表達(dá)，其余都下調(diào)表達(dá)且差異不顯著；CsAHP1在開(kāi)花期較其他CsAHPs基因表達(dá)量最高，開(kāi)花前6 d，CsAHP3表達(dá)量最高；CsAHP7在正常子房和超級(jí)子房開(kāi)花前1 d表達(dá)量均為最高，CsAHP1在正常子房和超級(jí)子房開(kāi)花期表達(dá)量最高。

圖5 黃瓜非生物脅迫與不同發(fā)育時(shí)期AHP家族基因表達(dá)模式分析Fig. 5 Expression pattern analysis of AHP family in abiotic stress and different developmental stages of C. sativus

進(jìn)一步利用qRT-PCR技術(shù)分析黃瓜AHP家族基因在干旱、高溫和低溫弱光脅迫下相對(duì)表達(dá)量情況。結(jié)果（圖6）發(fā)現(xiàn)，CsAHP1和CsAHP3均在干 旱、高溫脅迫下較對(duì)照顯著上調(diào)表達(dá)，CsAHP1、CsAHP2和CsAHP5在低溫弱光脅迫下較對(duì)照顯著上調(diào)表達(dá)。以上數(shù)據(jù)說(shuō)明黃瓜AHP家族基因響應(yīng)干旱、高溫和低溫弱光等非生物脅迫且推測(cè)該家族基因成員間可能存在功能冗余現(xiàn)象。

圖6 在干旱、高溫和低溫弱光脅迫下黃瓜AHP家族基因qRT-PCR分析Fig. 6 qRT-PCR analysis of AHP family gene under drought，high temperature，and low temperature and low light stress in C. sativus

3 討論

近些年，隨著高通量測(cè)序技術(shù)迅猛發(fā)展，重要性狀的基因大數(shù)據(jù)的公開(kāi)，利用生物信息學(xué)技術(shù)將相關(guān)數(shù)據(jù)信息進(jìn)行有效整合，將為挖掘重要性狀相關(guān)基因及其功能研究提供理論基礎(chǔ)［28］。本研究運(yùn)用生物信息學(xué)手段，分別從黃瓜、南瓜、西瓜、甜瓜、冬瓜、西葫蘆、葫蘆和擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定到7（Cs）、8（Cmo）、7（Cla）、7（MEL）、7（Bhi）、7（Cp）和6（Lsi）個(gè)基因家族成員，且黃瓜AHP家 族成員與葫蘆科中冬瓜、甜瓜的親緣關(guān)系較近。葫蘆科作物與十字花科的擬南芥（6個(gè)）和蘿卜（6個(gè)）成員個(gè)數(shù)相當(dāng)，說(shuō)明AHP家族具有保守性［29］。

為了探究黃瓜AHP基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)機(jī)制，本研究對(duì)黃瓜AHP家族基因啟動(dòng)子序列進(jìn)行順式作用元件分析。結(jié)果顯示，黃瓜AHP基因家族7個(gè)成員均含有光響應(yīng)作用元件，且CsAHP1和CsAHP7含有低溫脅迫響應(yīng)作用元件。qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)CsAHP1在低溫弱光脅迫下較對(duì)照顯著上調(diào)表達(dá)，說(shuō)明CsAHP1響應(yīng)低溫弱光脅迫。侯凌燕［30］研究發(fā)現(xiàn)擬南芥AHP1-5缺失可以提高植物的抗凍能力，與本研究結(jié)果相近，可能是因?yàn)榈蜏厝豕庀翪sAHP1表達(dá)量增多造成植株出現(xiàn)脅迫癥狀。本研究中，在干旱、高溫脅迫下CsAHP1和CsAHP3較對(duì)照顯著上調(diào)表達(dá)，鹽脅迫下CsAHP1、CsAHP3和CsAHP4顯著下調(diào)表達(dá)，與擬南芥AHP2、AHP3、AHP5響應(yīng)鹽、干旱脅迫相一致［7］，但與水稻OsAHP1、OsAHP2響應(yīng)鹽和干旱脅迫的表達(dá)模式相反［9］，說(shuō)明其參與響應(yīng)黃瓜逆境脅迫的生物學(xué)過(guò)程。

進(jìn)一步利用基因表達(dá)譜與qRT-PCR分析黃瓜AHP家族基因的表達(dá)情況，結(jié)果顯示CsAHP1和CsAHP4均響應(yīng)鹽脅迫、高/低溫/長(zhǎng)/短日照，CsAHP3響應(yīng)鹽脅迫、硅脅迫，暗示著CsAHP1、CsAHP3和CsAHP4參與調(diào)控逆境脅迫響應(yīng)機(jī)制。在蘿卜中研究發(fā)現(xiàn)RsAHP1、RsAHP2和RsAHP5響應(yīng)鹽脅迫且均為上調(diào)表達(dá)［31］，與本研究結(jié)果相反，其可能原因是不同物種對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)不同。本研究還鑒定到CsAHP7在正常子房和超級(jí)子房開(kāi)花前1 d表達(dá)量均為最高，而CsAHP1在正常子房和超級(jí)子房開(kāi)花期表達(dá)量最高，說(shuō)明CsAHP1和CsAHP7可能參與黃瓜開(kāi)花調(diào)控過(guò)程。綜上推測(cè)，CsAHP1可能通過(guò)參與細(xì)胞分裂素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控黃瓜提前開(kāi)花響應(yīng)植物逆境脅迫，使植物提前進(jìn)入生殖生長(zhǎng)階段。

4 結(jié)論

鑒定到的7個(gè)黃瓜AHP基因家族成員與葫蘆科物種及十字花科蘿卜、擬南芥的AHP家族具有很強(qiáng)的保守性；基因啟動(dòng)子序列中含有光響應(yīng)、低溫響應(yīng)、干旱響應(yīng)、激素響應(yīng)和防御應(yīng)激與脅迫響應(yīng)等多種順式作用元件；黃瓜AHP基因家族與植物發(fā)育和非生物脅迫響應(yīng)有著密切的關(guān)系。