朱浩 張嚴偉 劉潤 梁艷 楊奕 徐天樂 楊章平

（1. 揚州大學農業(yè)科技發(fā)展研究院，揚州 225000；2. 揚州大學動物科學與技術學院，揚州 225000；3. 江蘇省農墾集團有限公司， 南京 210019；4. 揚州大學獸醫(yī)學院，揚州 225000）

自1929年亞歷山大·弗萊明發(fā)現(xiàn)青霉素以來，國內外研究人員逐漸發(fā)現(xiàn)了多種抗生素，抗生素極大地減少了由細菌感染引起的死亡，然而抗生素的過度使用和濫用不可避免地導致了細菌耐藥性的出現(xiàn)［1-2］。近年，來自人類、動物和其他來源的新型多藥耐藥基因不斷被鑒定出，包括編碼新德里金屬-β-內酰胺酶基因（NDM），MCR基因和耐藥基因Tet（X3/X4），這些基因分別介導了對碳青霉烯類藥物、可樂定和替加環(huán)素的抗性［3］。新型耐藥基因導致更多的多重耐藥性（MDR）細菌出現(xiàn)，成為全球公共衛(wèi)生安全的一大難題［4］。1970年以來，隨著新型抗生素的開發(fā)進度愈加緩慢以及耐藥基因的不斷涌現(xiàn)，抗生素治療的選擇愈發(fā)困難［5］。因此，尋找具有創(chuàng)新性，成本效益性的策略來解決細菌耐藥性問題成為目前迫切的需要，而抗生素增效劑則是一種很好的選擇［6］。

開發(fā)抗生素佐劑作為一種新的策略來減緩耐藥性細菌的傳播或降低細菌耐藥性，已成為一個新的研究熱點。隨著研究的不斷深入，已有報道表明抗生素佐劑與抗生素聯(lián)合使用能有效增強現(xiàn)有抗生素對耐藥菌的抗菌活性，提高殺菌效果［7］。本文概述了目前關于細菌病原體耐藥的主要分子機制，這是確定有效藥物組合的基礎和關鍵。另外，描述了涵蓋所有典型分類的藥物組合策略及其作用機制。

1 細菌耐藥現(xiàn)狀及耐藥機制

抗生素發(fā)現(xiàn)的益處會被抗生素耐藥性的出現(xiàn)逐漸抵消［8-9］。目前絕大多數人認為抗生素耐藥性是一種獲得性生物現(xiàn)象，是因為在臨床環(huán)境和農業(yè)過程中頻繁和過度使用抗生素［10］。迄今為止，抗生素耐藥性已發(fā)展成為全球公共衛(wèi)生面臨的最大挑戰(zhàn) 之一［11-12］。

細菌對抗生素的耐藥分為固有耐藥和獲得耐藥［13］。固有耐藥是由細菌染色體基因決定的，可以通過細菌染色體基因突變等方式產生。除固有耐藥外，細菌還可以通過水平基因轉移（如接合、轉化和轉導）或染色體突變獲得耐藥基因，從而獲得對抗生素的耐藥。如圖1所示，抗生素耐藥性可以通過3種不同的機制來實現(xiàn)，包括通過水解酶或化學修飾酶使抗生素失活，抗生素靶標修飾，以及通過上調主動外排和下調OM（細胞外膜）通透性來預防抗生素在細胞內的積累［14-15］。

圖1 細菌耐藥機制示意圖Fig. 1 Schematic diagram of bacterial drug resistance mechanism

2 抗生素佐劑協(xié)同抗生素對殺傷耐藥細菌的增效作用

2.1 植物源天然產物

2.1.1 生物堿類 生物堿是從一類從植物中分離出來的含氮雜環(huán)化合物，具有數量多，結構多樣復雜等特點［16］。從中藥黃連中提取的總生物堿已經被發(fā)現(xiàn)可以與環(huán)丙沙星聯(lián)用顯著增強環(huán)丙沙星對沙門氏菌的抗菌作用［17］。黃連總生物堿中包含的物質很多，例如小檗堿；小檗堿又稱黃連素，是黃連抗菌的主要有效成分［18］，Laudadio等［19］發(fā)現(xiàn)與妥布霉素單獨使用相比，小檗堿與妥布霉素聯(lián)合應用對銅綠假單胞菌臨床分離株的抑制活性顯著增加，小檗堿可

以作為妥布霉素的佐劑增強抑菌作用。除了從黃連中提取的生物堿被證實是抗生素佐劑，從胡椒中提取的生物堿已經被證實，例如胡椒堿。胡椒堿是一種廣譜抗驚厥藥［20］，但是Mgbeahuruike等［21］發(fā)現(xiàn)胡椒堿還可以作為抗生素佐劑，增強四環(huán)素對金黃色葡萄球菌的抑菌效果，能夠用來治療金黃色葡萄球菌感染。

2.1.2 多酚類 多酚是一種廣泛存在于自然界中的植物次生代謝產物，具有抗氧化、抗炎、抗菌等生物活性［22］。ECG（表兒茶素沒食子酸酯）和EGCG（表沒食子兒茶素沒食子酸酯）是從茶葉中提取的酚類物質，能增強苯唑西林、頭孢呋辛、美羅培南對 MRSA（耐甲氧西林金黃色葡萄球菌）和MSSA（甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌）的抑菌作用［23-24］。黃腐酚是啤酒花中特有的一類酚類物質，具有抗癌作用［25］，Bocquet等［26］發(fā)現(xiàn)黃腐酚可以作為佐劑增強環(huán)丙沙星、慶大霉素和惡唑西林的抑菌效果。除此之外，目前還發(fā)現(xiàn)一些水果果渣的酚類物質也是潛在的抗生素佐劑，例如葡萄果渣酚類提取物可以提高四環(huán)素對大腸桿菌的殺菌效果［27］。部分多酚類物質例如ECG，EGCG等，雖然已經被證實與抗生素聯(lián)用可以恢復耐藥菌株對抗生素的敏感性，但是其自身性質不穩(wěn)定，聯(lián)用效果容易受到外界環(huán)境的影響，所以目前很難應用到臨床來治療細菌感染。

2.1.3 黃酮類 黃酮類化合物廣泛存在于各種藥用植物中，是許多中草藥的活性成分，對多種耐藥菌株具有抗菌活性［28］。黃岑苷、槲皮素、楊梅素等黃酮類化合物已經被證實能夠與抗生素聯(lián)合應用有效提高耐藥菌株對抗生素的敏感性。槲皮素是具有多種生物活性的黃酮醇類化合物，廣泛存在于許多植物的莖皮、花、葉、芽、種子、果實中［29］。Kim等［30］發(fā)現(xiàn)槲皮素與氨芐青霉素聯(lián)合對MRSA表現(xiàn)出部分協(xié)同作用，槲皮素可以作為氨芐青霉素的佐劑提高對MRSA的抗性。楊梅素在楊梅等植物中廣泛存在，到目前為止，楊梅素已經被證明具有多種生物學功能［31］，Lin等［32］評估了楊梅素和頭孢西丁聯(lián)合使用治療產ESBL肺炎克雷伯菌的治療效果，結果發(fā)現(xiàn)楊梅素與頭孢西丁聯(lián)用對產ESBLs的肺炎克雷伯菌有增效增效作用。此外，黃岑苷是從黃芩根中提取分離出來的一種黃酮類化合物［33］，同樣具有顯著的生物活性，具有抑菌和抗炎作用，黃芩苷也能提高氨芐青霉素、阿莫西林、甲氧西林、頭孢噻肟的抑菌效果，具有恢復β-內酰胺類抗生素對耐-β內酰胺金黃色葡萄球菌和其他耐β-內酰胺金黃色葡萄球菌療效的潛力［34］。

2.1.4 揮發(fā)油類 植物中揮發(fā)性油類一般分為萜烯類化合物、芳香族化合物、脂肪族化合物、含氮和硫化合物［35］。香菜精油是以壓碎的成熟種子為原料，采用蒸餾法提取出來的揮發(fā)性油類物質，目前已知的是其具有皮膚以及生理心理療效，但Duarte 和Aelenei發(fā)現(xiàn)，香菜精油與慶大霉素對大腸桿菌ATCC 25922和鮑曼不動桿菌有協(xié)同抑菌作用，香菜精油增加了大腸桿菌對慶大霉素和環(huán)丙沙星的敏感性［36-37］。Elalfi等［38］發(fā)現(xiàn)慶大霉素與黃連葉精油聯(lián)用時，黃連素精油顯著增強慶大霉素的活性，重新恢復革蘭氏陰性大腸桿菌和革蘭氏陽性表皮葡萄球菌對慶大霉素的敏感性。揮發(fā)油類具有揮發(fā)性和難溶性，由于溶劑的影響，聯(lián)用效果不穩(wěn)定。

2.2 動物源天然產物

2.2.1 高分子糖類 目前，高分子糖類中研究最廣泛的是殼聚糖，殼聚糖是一種天然聚陽離子多糖，無毒無害，廣泛存在于甲殼類動物、節(jié)肢動物中［39］。Mu等［40］發(fā)現(xiàn)殼聚糖聯(lián)合氨基糖苷類抗生素如阿米卡星，對單增李斯特菌生物膜的抑制或破壞效果優(yōu)于單獨使用抗生素，強調了殼聚糖/阿米卡星聯(lián)合應用可能有助于提高抗生素的有效性。Tin等［41］發(fā)現(xiàn)低聚殼聚糖與磺胺甲惡唑聯(lián)用對銅綠假單胞菌有協(xié)同抑菌作用。殼聚糖具有無毒無污染，生物相容性好等優(yōu)點，開發(fā)殼聚糖及其衍生物作為抗生素佐劑擁有良好的前景。

2.2.2 抗菌肽 抗菌肽是宿主非特異性免疫防御系統(tǒng)產生的一類對抗外源性病原體的肽類活性物質，是天然免疫的效應分子［42］。劉倚帆等［43］發(fā)現(xiàn)牛乳鐵蛋白肽和昆蟲類抗菌肽天蠶素 A與金霉素聯(lián)用對4種細菌（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、豬霍亂沙門氏菌和銅綠假單胞菌）表現(xiàn)為協(xié)同抑菌作用，天蠶素A與牛乳鐵蛋白肽是兩種效果良好的抗生素佐劑。Hwang等［44］也證實了抗菌肽coprisin和萬古霉素聯(lián)用對金黃色葡萄球菌表現(xiàn)為協(xié)同作用，在萬古霉素存在的情況下，抗菌肽coprisin的協(xié)同活性會降低菌株在較低濃度下的生存能力，尤其對革蘭氏陰性菌有明顯的增效作用。與傳統(tǒng)抗生素相比，抗菌肽具有廣譜抗微生物活性的優(yōu)點，多數抗菌肽可以高效地殺死數百種微生物，所以對于抗菌肽的研究側重于其自身的抗菌特性，而不是其作為抗生素佐劑的特性。

2.3 人工合成類

一些人工合成的物質現(xiàn)在也被發(fā)現(xiàn)可以作為抗生素佐劑，例如納米材料，合成的多肽等。納米材料中的納米銀已經被證實可以作為慶大霉素和氯霉素的佐劑，增強慶大霉素和氯霉素對糞腸球菌的抑菌作用［45］。SLAP-S25是一種人工合成的多肽，在亞mic水平下，SLAP-S25與四環(huán)素、氧氟沙星、利福平、頭孢吡肟和萬古霉素之間存在協(xié)同抑菌作用，SLAP-S25可以作為一種潛在的廣譜抗生素佐劑用于治療細菌感染［46］。由于人工合成的抗生素佐劑沒有進行安全性評價，暫時只能停留在實驗室階段。

2.4 其他類型

除了植物源、動物源天然產物以及人工合成的能夠作為抗生素佐劑之外，還有一些噬菌體和治療疾病的藥物，可以作為抗生素佐劑，提高抗生素的殺菌作用。周鐵麗等［47］總結了部分噬菌體與抗生素聯(lián)用具有協(xié)同作用，比如長尾科噬菌體與頭孢曲松聯(lián)用，可以協(xié)同減少銅綠假單胞菌的生長；肌尾科噬菌體與環(huán)丙沙星聯(lián)合使用，可以降解肺炎克雷伯菌的生物膜，提高環(huán)丙沙星的抑菌效果［48-49］。Liu等［50］研究發(fā)現(xiàn)用于治療Ⅱ型糖尿病的二甲雙胍與多西環(huán)素聯(lián)用可以恢復耐藥細菌對多西環(huán)素的敏感性，二甲雙胍顯著抑制了細菌的外排泵活性并增強了多西環(huán)素的殺傷效果，而注入1/2 MIC的二甲雙胍和1/2 MIC的多西環(huán)素可顯著減少99%的細菌。

3 抗生素佐劑的作用機制

3.1 耐藥酶抑制劑作用

耐藥酶通過多種途徑削弱抗生素活性，如抗生素水解或修飾，或抗生素靶點修飾。抑制酶介導的耐藥已被證明是一種臨床成功的方案，可恢復特定抗生素的活性［51］。最成功的例子是β-內酰胺酶抑制劑［52］。β-內酰胺酶抑制劑分為不可逆抑制劑和可逆抑制劑。不可逆抑制劑利用β-內酰胺的結構或適當的等甾體附著在內酰胺酶的活性位點或附近，從而抑制酶的功能［53］。目前市場上只有3種β-內酰胺酶抑制劑可以作為不可逆抑制劑與抗生素聯(lián)用，分別是：奧格門?。ò⒛髁?克拉維酸）、特美?。ㄌ婵ㄎ髁?克拉維酸）、優(yōu)立新（氨芐西林+舒巴坦）和Zosyn（哌拉西林+他唑巴坦）；其中最著名的組合是奧格門汀，作用原理是克拉維酸通過與關鍵β-內酰胺酶功能位點的絲氨酸殘基形成不可逆鍵，防止阿莫西林水解［54］。

可逆抑制劑是在結合到酶的臨時基礎上，使酶的活性最終恢復。這些藥劑都是動態(tài)平衡的，通過簡單的稀釋抑制劑就可以減少它們的抑制作用，例如2015年發(fā)現(xiàn)的阿維巴坦和2017年發(fā)現(xiàn)的法硼巴坦［55］。由此，以β-內酰胺酶作為靶點控制細菌耐藥仍是較為普遍的抗耐藥技術研發(fā)的重要途徑。

3.2 外排泵抑制劑作用

細菌通過外排泵主動將抗生素外排，是抗生素治療失效的重要原因之一［56］。目前研究發(fā)現(xiàn)的抗生素佐劑主要通過兩種方式來影響細菌外排泵外排抗生素，第一種方式是直接破壞外排泵結構，例如喹啉衍生物7-硝基-8-甲基-4-（2′-（哌啶乙基）-氨基喹啉［57］對大腸桿菌AcrAB外排泵具有較高的抑制活性。當該衍生物與氯霉素聯(lián)合使用時，可以觀察到氯霉素在細胞內的積累增加。該衍生物如何抑制流出泵的一個可能的解釋是基于大腸桿菌的TolC外排泵結構，該結構顯示了一個直徑為35?的內部通道。由于烷基氨基喹啉的直徑為20?，對泵的抑制可能發(fā)生在內膜的載體上或泵的內部與外部通道的交界處，破壞了泵的結構。

另一種方式是通過抑制編碼外排泵的基因的表達。Salaheen等［58］研究酚類藍莓（Vaccinium corymbosum）和黑莓（Rubus fruticosus）果渣提取物（BPE）對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的治療作用及其機制。BPE中原兒茶酸、香豆酸、香草酸、咖啡酸、沒食子酸等5種主要酚酸以及粗品BPE完全抑制了MRSA體外生長，探究作用機制發(fā)現(xiàn)BPE通過下調金黃色葡萄球菌外排泵（norA、norB、norC、mdeA、sdrM和sepA）基因的表達恢復了甲氧西林對MRSA的作用。然而，有研究指出，杜洛西汀與氯霉素聯(lián)用后促進了大腸桿菌的多重耐藥性，其中包括外排泵的活性增加［59］。因此，對外排泵相關基因的抑制作用不一定確保細菌在長期抗生素壓力的情況仍能維持一定藥物敏感性。

3.3 細菌膜通透性改變

大多數抗生素在細胞內發(fā)揮作用，這需要它們通過細胞膜滲透到細菌細胞內。疏水性抗生素通過脂質雙分子層擴散，而親水性抗生素僅通過細菌孔進入。因此，膜組成、膜脂和孔都影響膜的通透性，并影響細菌對抗生素的敏感性［60］。

一些佐劑已被發(fā)現(xiàn)能夠通過耗散細菌膜電位（ΔΨ），進而上調跨膜質子梯度，來促進細菌對抗生素的攝取，從而克服內在耐藥性［61］。例如，止瀉藥洛哌丁胺被確定為半合成四環(huán)素類抗生素米諾環(huán)素的一種佐劑。進一步實驗表明，洛哌丁胺降低了質子動力（PMF）的電組分（Δψ），為了對抗這種影響并維持ATP合成水平，細菌增加了內膜的pH梯度（ΔpH），這又反過來促進了細菌對米諾環(huán)素的 攝?。?2］。

部分佐劑也可通過調控相關膜蛋白基因的方式，增加細胞膜的通透性，促進抗生素在細胞內的積累，從而提高抗生素的作用效果。例如Dhara等［63］通過觀察肉桂醛與頭孢他啶聯(lián)合對大腸桿菌細胞膜結構的影響，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合作用 6 h 后細菌細胞質膜破裂、細胞質流失；研究促進孔蛋白基因（ompC、ompF、ompK35和 ompK36）的轉錄水平發(fā)現(xiàn)，肉桂醛提高了孔蛋白基因轉錄水平，從而提高了細菌細胞膜的滲透性，促進抗生素流入細胞內，呈現(xiàn)出明顯的協(xié)同抗菌作用。

4 總結與展望

目前已發(fā)現(xiàn)較多物質可作為抗菌增效劑，這些物質與抗生素聯(lián)用呈現(xiàn)協(xié)同或部分協(xié)同作用，抗菌增效劑可以通過改變細菌膜的通透性、改變抗生素的靶標、抑制細菌外排泵活性和抑制抗生素水解等作用機制來增強抗生素的抗菌活性。但是，目前研究模式太過單一，大部分研究停留于找到抗菌增效劑，證明其與抗生素有協(xié)同作用，但沒有具體闡釋抗菌增效劑的作用機制。實驗中也只針對一種或者幾種耐藥菌，而聯(lián)合試驗也只針對一種抗生素，實驗結果不夠系統(tǒng)全面。聯(lián)合治療面臨的挑戰(zhàn)是能否在體內發(fā)揮協(xié)同作用，具體涉及到許多關鍵決定因素，如復雜的藥理學、藥代動力學和體內藥物動力學。此外，聯(lián)用藥物的協(xié)同作用可能伴有毒副作用增強。因此，需要在臨床試驗之前進行系統(tǒng)的毒理學評價。

盡管面臨挑戰(zhàn)和困難，但是在抗生素開發(fā)受限且細菌耐藥性增加的大環(huán)境下，聯(lián)合療法，特別是抗生素增效劑的選擇，無疑是治療耐藥細菌感染的一個新途徑。此外，值得關注的是，聯(lián)合治療的耐藥發(fā)展要比單藥治療慢，所以聯(lián)合治療在未來治療細菌感染具有極大開發(fā)潛力和應用前景。