徐 欣，楊 璐，馬婕妤，陳敏皎，周 杰,3

(1.江蘇省生產(chǎn)力促進(jìn)中心，江蘇 南京 210018；2.南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 211800；3.南京工業(yè)大學(xué) 材料化學(xué)工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 211800)

乳酸廣泛存在于生物體內(nèi)，是無(wú)氧呼吸條件下的碳代謝中間產(chǎn)物，也是參與人體內(nèi)循環(huán)的代謝物質(zhì)。乳酸濃度的檢測(cè)在臨床診斷[1-2]、食品風(fēng)味評(píng)估[3-4]和工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)[5-6]中都尤為重要。然而，傳統(tǒng)的乳酸檢測(cè)方法，如比色法[7]、伏安法[8]和液相色譜法[9]，都存在操作復(fù)雜、技術(shù)要求高或便攜性差等問(wèn)題。生物傳感器由于具有使用方便、特異性強(qiáng)及檢測(cè)準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，是乳酸有效檢測(cè)手段之一[10]。目前，已經(jīng)報(bào)道的乳酸生物傳感器能夠?qū)崿F(xiàn)復(fù)雜組分中的乳酸含量檢測(cè)[11-13]，但仍存在響應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)、檢測(cè)范圍窄等問(wèn)題，且主要應(yīng)用于臨床檢測(cè)，尚缺乏應(yīng)用于發(fā)酵過(guò)程中高濃度乳酸含量檢測(cè)的生物傳感器。

乳酸生物傳感器的檢測(cè)元件多為乳酸氧化酶(LOX)。LOX專(zhuān)一性地催化底物乳酸產(chǎn)生丙酮酸和過(guò)氧化氫(H2O2)，并伴有電子轉(zhuǎn)移。這種電子轉(zhuǎn)移信號(hào)被電極采集，經(jīng)電化學(xué)換能器轉(zhuǎn)化為可視的電流波動(dòng)。高活力的酶元件在維持傳感器的靈敏度和穩(wěn)定性方面至關(guān)重要[14]。目前，綠色氣球菌來(lái)源的乳酸氧化酶(AvLOX)已實(shí)現(xiàn)商業(yè)化，并廣泛應(yīng)用于電化學(xué)傳感器檢測(cè)，然而其制備困難、價(jià)格昂貴。此外，在生物傳感器工作過(guò)程中，除了面臨物理性洗脫外，復(fù)雜的檢測(cè)環(huán)境也會(huì)嚴(yán)重影響酶的檢測(cè)活力。因此，建立合適的酶固定化技術(shù)，可以有效提高傳感器的穩(wěn)定性能，對(duì)于生物傳感器的制備具有重要意義[14]。

本文首先在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了AvLOX的異源可溶性表達(dá)，并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了表征，然后考察戊二醛(GA)交聯(lián)法、聚賴(lài)氨酸吸附以及殼聚糖(CS)包埋法等不同固定化策略對(duì)AvLOX固定化效率的影響。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)層層組裝技術(shù)將檢測(cè)酶元件、氧化石墨烯(GO)固定于玻碳(GC)電極上，制備AvLOX/CS/GO/GC乳酸生物傳感電極，對(duì)其電化學(xué)性能參數(shù)，包括靈敏度、線(xiàn)性關(guān)系、響應(yīng)時(shí)間、抗干擾性、重現(xiàn)性以及使用壽命等進(jìn)行表征，并考察其在不同工作條件下的檢測(cè)靈敏度。最后將制備的乳酸生物傳感器在模擬和真實(shí)的乳酸發(fā)酵體系中進(jìn)行檢測(cè)，為其規(guī)?；瘧?yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

酵母粉和蛋白胨，北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司；殼聚糖(50 000)和聚賴(lài)氨酸(<5 000)，上海麥克林生化科技有限公司；25%戊二醛溶液和氧化石墨烯(>99%)，阿拉丁試劑(上海)有限公司；5% Nafion溶液(全氟磺酸樹(shù)脂，D-250)，杜邦公司；NaCl、Na2HPO4、KH2PO4、L-乳酸、谷氨酸、蘋(píng)果酸、蔗糖和乳糖均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

Biometra-T Gradient PCR儀，德國(guó)TRobot公司；MQD-M2R型恒溫振蕩培養(yǎng)箱，上海旻泉儀器有限公司；JY92-2D型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；CHI660E型電化學(xué)工作站，上海辰華儀器有限公司；UltiMate 3000 型高效液相色譜，美國(guó)Dionex公司。

1.2 AvLOX的克隆與表達(dá)

提取綠色氣球菌WDCM 00061的基因組作為模板，參照NCBI的基因登錄號(hào)(WP_003142047)設(shè)計(jì)引物AvLox-F(GGTGCCGCGCGGCAGC CATATGATGCCTATCACCCAGAAGATT)和AvLox-R(GTGGTGGTGGTGGTG CTCGAGAAGCTTGACGATGGCGG)，并用該引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增出目的基因AvLox。利用NdeI和XhoI對(duì)pET-28a(+)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切并回收線(xiàn)性載體片段，隨后通過(guò)一步克隆將目的基因AvLox與表達(dá)載體pET-28a(+)相連，轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α中。將測(cè)序無(wú)誤的pET-28a(+)-AvLox轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，構(gòu)建表達(dá)菌株，用于下一步的蛋白表達(dá)。重組菌接種在37 ℃培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.5～0.6后，加入終濃度為 0.5 mmol/L IPTG，轉(zhuǎn)移至恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，于20 ℃、160 r/min低溫誘導(dǎo)24 h。發(fā)酵完成后，離心收集菌體，使用超聲細(xì)胞破碎儀進(jìn)行破碎，隨后在4 ℃、12 000 r/min條件下離心20 min獲得破碎上清液。破碎上清液利用Ni-NTA柱純化，在4 ℃條件下以截留分子量為1.0×104的超濾管進(jìn)行超濾以去除咪唑，濃縮后得到AvLOX純酶。

AvLOX的酶活單位的定義：在37 ℃下，每分鐘催化生成1 μmol/L H2O2所需的酶量。蛋白濃度采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定，酶活測(cè)定參照文獻(xiàn)[15]的方法進(jìn)行。AvLOX的溫度穩(wěn)定性為在相應(yīng)溫度下孵育30 min后的相對(duì)酶活，pH穩(wěn)定性為AvLOX在相應(yīng)pH的緩沖液下孵育30 min后的相對(duì)酶活，以最適溫度和最適pH時(shí)的酶活為100%。

1.3 乳酸生物傳感器的制備

用Al2O3粉末拋光處理玻碳電極，得到鏡面的玻碳電極，分別于50%(體積分?jǐn)?shù))硝酸溶液、無(wú)水乙醇和超純水中進(jìn)行超聲處理，并于N2氛圍下干燥。為了進(jìn)一步提高傳感電極的電子傳導(dǎo)能力與比表面積，將5 mg氧化石墨烯粉末溶于20 mL超純水中，超聲分散均勻后，取5 μL滴至潔凈的玻碳電極上，室溫下干燥。再取一定量的AvLOX純酶與不同固定化試劑混合滴加在電極表面,在4 ℃下靜置3～4 h至其表面干燥。以上述制備的電極為工作電極，Ag/AgCl為參比電極，鉑絲為對(duì)電極，搭建乳酸生物傳感三電極體系。

1.4 AvLOX的固定化性能表征

分別配制2.5、5.0、7.5、10.0和12.5 g/L的殼聚糖溶液和聚賴(lài)氨酸溶液，體積分?jǐn)?shù)為0.25%、0.50%、0.75%、1.0%和1.25%的戊二醛溶液和Nafion溶液，超聲30 min，使其完全溶解，放入4 ℃冰箱保存待用。

生物相容性計(jì)算：所制備的AvLOX分別與上述4種固定化試劑等體積混合，靜置10 min后檢測(cè)剩余酶活，以不添加固定化試劑的酶活作為對(duì)照(100%)，計(jì)算相對(duì)酶活。

固定化率計(jì)算：所制備的AvLOX分別與上述4種固定化試劑等體積混合，取6 μL混合液滴于所制備的電極上，待酶液晾干后，將電極完全浸入50 mL磷酸鹽緩沖液(PBS，50 mmol/L，pH 7.0)中，攪拌速度為200 r/min，24 h后檢測(cè)電極上殘留酶活，以不添加固定化試劑的酶活作為對(duì)照(100%)，計(jì)算相對(duì)酶活。

酶負(fù)載量計(jì)算：根據(jù)上述優(yōu)化的檢測(cè)酶元件固定化方式，分別滴加2、4、6、8、10和12 μL預(yù)混液于所制備的電極上，待酶液晾干后，檢測(cè)對(duì)L-乳酸的靈敏度，獲取最優(yōu)酶負(fù)載量。以上所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.5 乳酸生物傳感器電化學(xué)性能表征

傳感電極的電化學(xué)性能檢測(cè)在含有50 mL磷酸鹽緩沖液(50 mmol/L，pH 7.0)的反應(yīng)池中進(jìn)行，工作電壓為-0.05 V，持續(xù)攪拌轉(zhuǎn)速為200 r/min，檢測(cè)溫度為20 ℃。采用計(jì)時(shí)電流法觀(guān)察酶電極對(duì)乳酸溶液的響應(yīng)情況，計(jì)算其靈敏度、線(xiàn)性范圍和響應(yīng)時(shí)間?？垢蓴_性根據(jù)依次加入等濃度的乳酸、干擾物(蘋(píng)果酸、谷氨酸、蔗糖以及乳糖)和乳酸后的電流變化進(jìn)行評(píng)估。重復(fù)穩(wěn)定性為連續(xù)重復(fù)實(shí)驗(yàn)電極對(duì)乳酸的響應(yīng)情況。生物傳感器的使用壽命通過(guò)每隔12 h測(cè)試實(shí)驗(yàn)電極對(duì)乳酸的響應(yīng)靈敏度進(jìn)行考察。

進(jìn)一步考察所制備電極的最佳工作條件，包括工作溫度和工作pH。將AvLOX/CS/GO/GC乳酸電化學(xué)生物傳感器分別在不同溫度(20、30、40、50和60 ℃)和不同pH(5.0、6.0、7.0、8.0和9.0)下進(jìn)行乳酸靈敏度測(cè)試，將工作條件為20 ℃和電極緩沖液pH 7.0下的靈敏度定義為100%。

1.6 發(fā)酵體系乳酸濃度檢測(cè)

利用所制備的電極對(duì)模擬和真實(shí)乳酸發(fā)酵體系進(jìn)行檢測(cè)。在50 mL谷氨酸棒狀桿菌發(fā)酵液中加入500 μL乳酸溶液(10 mol/L)，配制成0.1 mol/L乳酸的模擬發(fā)酵液，在反應(yīng)池中添加不同體積的模擬發(fā)酵液進(jìn)行檢測(cè)。

對(duì)真實(shí)發(fā)酵液中乳酸含量進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)乳酸過(guò)程定時(shí)取樣(每隔24 h取發(fā)酵上清液)，利用時(shí)間-電流擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出模擬和真實(shí)發(fā)酵液中的乳酸含量。將傳感檢測(cè)數(shù)據(jù)與實(shí)際含量或高效液相色譜法測(cè)試出的乳酸含量做對(duì)比，以評(píng)估乳酸生物傳感器檢測(cè)性能的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與討論

2.1 AvLOX的重組異源表達(dá)與酶學(xué)性質(zhì)

乳酸生物傳感器的檢測(cè)酶元件AvLOX的重組表達(dá)與蛋白質(zhì)純化情況如圖1所示。由圖1可知：與空載菌株的破碎上清液相比，目的菌株在IPTG的誘導(dǎo)下成功實(shí)現(xiàn)了可溶性表達(dá)，蛋白大小為4.25×104左右，與AvLOX的理論大小一致，且粗酶液酶活達(dá)18.5 U/mL。利用載體pET-28a(+)上的His-Tag標(biāo)簽，通過(guò)Ni-NTA親和柱進(jìn)行純化，經(jīng)200和250 mmol/L咪唑溶液洗脫，成功獲得了較純的AvLOX重組蛋白。進(jìn)一步通過(guò)超濾去除咪唑，濃縮后得到AvLOX純酶。經(jīng)酶活測(cè)定，純化濃縮后的AvLOX酶活和比酶活分別為34.0 U/mL和28.8 U/mg。

M—標(biāo)準(zhǔn)蛋白；1—空載上清液；2—粗酶液；3—破碎沉淀；4—穿過(guò)液；5～8—50、100、200和250 mmol/L咪唑洗脫液圖1 AvLOX重組蛋白的表達(dá)與純化分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of recombinant protein AvLOX

為了更好地匹配應(yīng)用場(chǎng)景，對(duì)所制備的AvLOX酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行考察，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知：所制備的AvLOX最適催化溫度為40 ℃，在35～65 ℃時(shí)，其相對(duì)酶活的變化較小且維持在90%以上，能夠適應(yīng)較寬溫度范圍的催化環(huán)境。此外，該AvLOX的最適pH為6.5。酶生物傳感器需要在一定溫度和pH的環(huán)境下才能連續(xù)工作，因此也要求酶元件具備一定的溫度和pH耐受性。AvLOX的耐受性結(jié)果表明：所制備的AvLOX在30～60 ℃時(shí)孵育30 min，AvLOX仍可以保持80%以上的相對(duì)酶活；AvLOX在pH 6.0～7.5時(shí)具有較好的穩(wěn)定性，能維持90%以上的相對(duì)酶活。綜上所述，在大腸桿菌中異源重組表達(dá)的AvLOX具有優(yōu)良的溫度和pH穩(wěn)定性，能適應(yīng)更多的檢測(cè)應(yīng)用場(chǎng)景。

圖2 AvLOX的酶學(xué)性質(zhì)Fig.2 Enzymatic properties of recombinant AvLOX

2.2 AvLOX固定化方式優(yōu)化結(jié)果

優(yōu)異的檢測(cè)酶元件的固定化策略可以穩(wěn)定酶活，緩解酶的脫落，是實(shí)現(xiàn)電化學(xué)生物傳感器高檢測(cè)性能的關(guān)鍵。因此從固定化材料的生物相容性、固定化率和酶負(fù)載量等方面詳細(xì)考察戊二醛、殼聚糖、聚賴(lài)氨酸和Nafion這4種固定試劑的固定效果，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知：將2.5～15 g/L的殼聚糖與AvLOX等體積混合后，酶活均保持在90%以上。低質(zhì)量濃度的聚賴(lài)氨酸(<7.5 g/L)與AvLOX混合，對(duì)其酶活的影響也較小，酶活可保持在80%以上。當(dāng)聚賴(lài)氨酸的質(zhì)量濃度高于10 g/L，酶活則下降到70%以下。而戊二醛和Nafion對(duì)酶活影響較大，體積分?jǐn)?shù)0.75%戊二醛與酶混合后，酶活僅保留30%；體積分?jǐn)?shù)0.25% Nafion與酶混合后，酶活僅保留20%，表明戊二醛與Nafion對(duì)重組AvLOX蛋白的生物相容性較差，不適合作為其固定化材料。根據(jù)生物相容性確定了最優(yōu)的2種固定化材料，即12.5 g/L殼聚糖和2.5 g/L聚賴(lài)氨酸。

進(jìn)一步以不添加固定化材料的酶液直接滴加的玻碳電極作為對(duì)照，未固定的AvLOX的酶活已經(jīng)降至50%以下。其中，利用12.5 g/L殼聚糖固定化制備的酶電極在5 d后能保持80%以上的酶活，而2.5 g/L聚賴(lài)氨酸固定化制備的酶電極在2 d后酶活就已經(jīng)降至60%左右。綜上，優(yōu)選12.5 g/L殼聚糖與AvLOX等體積混合的固定化方式進(jìn)行固定。

測(cè)定不同酶負(fù)載量對(duì)傳感器電極響應(yīng)電流的影響，以確定乳酸生物傳感器最優(yōu)的酶負(fù)載量，結(jié)果如圖3(c)所示。由圖3(c)可知：在酶負(fù)載量為0.33、0.67和1.0 U(蛋白質(zhì)加量分別為0.96、1.92和2.9 mg)時(shí)，電流響應(yīng)隨著酶量的增加而上升，其原因是電流信號(hào)的增加效果大于電阻的增加；而當(dāng)酶量大于1.0 U時(shí)，電極對(duì)電子轉(zhuǎn)移的捕捉已經(jīng)達(dá)到飽和，酶量的增加只會(huì)導(dǎo)致電阻的增加，進(jìn)而導(dǎo)致電流響應(yīng)的減小。根據(jù)電流響應(yīng)與酶負(fù)載量的關(guān)系，確定了所制備電極的最優(yōu)酶負(fù)載量為1.0 U(蛋白量為2.9 mg)。

圖3 AvLOX的固定化優(yōu)化Fig.3 Optimization of immobilization strategy for recombinant AvLOX

2.3 乳酸生物傳感器電化學(xué)性能表征結(jié)果

氧化石墨烯具有比表面積大、生物相容性好以及電學(xué)特性?xún)?yōu)異等特點(diǎn)，可為酶的固定提供高容量和穩(wěn)定作用。結(jié)合上述優(yōu)化的最佳AvLOX固定化方案，在玻碳電極通過(guò)層層組裝，將氧化石墨烯、殼聚糖、AvLOX固定于玻碳電極上，制備AvLOX/CS/GO/GC乳酸電化學(xué)生物傳感器，對(duì)該傳感器性能進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知：當(dāng)加入0.1 mmol/L底物乳酸時(shí)，AvLOX/CS/GO/GC乳酸傳感器有明顯階躍，且響應(yīng)信號(hào)平穩(wěn)，對(duì)乳酸濃度和響應(yīng)電流進(jìn)行線(xiàn)性擬合得到I=0.317 9C+0.403(R2=0.999)，線(xiàn)性關(guān)系良好，線(xiàn)性范圍為0.1～0.9 mmol/L，靈敏度為45 μA·L /(mmol · cm2)。該電極的響應(yīng)時(shí)間僅為4 s。一般來(lái)說(shuō)，乳酸生物傳感器的響應(yīng)時(shí)間通常在20 s以上[11-12]。該電極較短的響應(yīng)時(shí)間可歸功于較高的比酶活與氧化石墨烯良好的導(dǎo)電性與大的比表面積。因?yàn)楸让富钤礁撸孜锱c酶反應(yīng)的速率就越高，氧化還原反應(yīng)進(jìn)行得越快，進(jìn)而達(dá)到穩(wěn)態(tài)電流的時(shí)間就越短。

該乳酸生物傳感器對(duì)蘋(píng)果酸、谷氨酸、蔗糖以及乳糖等發(fā)酵液中常見(jiàn)的干擾物質(zhì)均無(wú)響應(yīng)(圖4(d))，表明其具有良好的抗干擾性能，可用于發(fā)酵過(guò)程復(fù)雜環(huán)境中乳酸含量的特異性檢測(cè)。由重復(fù)穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果可知，所制備電極在10次重復(fù)性檢測(cè)中，相對(duì)靈敏度均保持在96%以上，能夠滿(mǎn)足連續(xù)多次檢測(cè)的要求。此外，將電極浸泡在持續(xù)攪拌的電極緩沖液中，每隔12 h取出進(jìn)行測(cè)試，該電極在0～96 h內(nèi)均保持95%以上的相對(duì)靈敏度。由此可見(jiàn)，本研究制備的乳酸生物傳感器具有較長(zhǎng)使用壽命與檢測(cè)穩(wěn)定性。

圖4 所制備的乳酸生物傳感器的電化學(xué)性能表征Fig.4 Electrochemical performance of the as-prepared lactic acid biosensor

再對(duì)制備的乳酸生物傳感器的工作pH與溫度環(huán)境進(jìn)行了研究，結(jié)果如圖5所示。由圖5可知：AvLOX/CS/GO/GC乳酸生物傳感器在酸性條件下靈敏度下降較為明顯，當(dāng)pH為5.0時(shí)，相對(duì)檢測(cè)靈敏度低于60%；在偏堿性(pH 7.0～9.0)條件下，該電極可以保持80%以上的相對(duì)靈敏度，表明所制備的電極不適宜在酸性條件下工作，而在中性以及偏弱堿性條件下可以保持較高的檢測(cè)靈敏性。此外，在20～40 ℃時(shí)，該電極的相對(duì)靈敏度隨溫度的升高而增加，但在40 ℃以后靈敏度逐漸下降。綜上，本研究所制備的AvLOX/CS/GO/GC乳酸生物傳感器較適用于40 ℃和弱堿性的工作環(huán)境。

2.4 實(shí)際發(fā)酵體系中乳酸含量的檢測(cè)結(jié)果

在谷氨酸棒狀桿菌發(fā)酵液中添加已知濃度的乳酸溶液作為測(cè)試的模擬體系和在凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)乳酸的真實(shí)發(fā)酵體系中考察乳酸生物傳感器的性能，結(jié)果見(jiàn)表1～2。由表1～2可知：當(dāng)乳酸濃度為0.20～0.80 mmol/L時(shí)，所制備的AvLOX/CS/GO/GC乳酸生物傳感器對(duì)模擬體系中乳酸的檢測(cè)較為準(zhǔn)確，相對(duì)誤差維持在6.5%以下。在凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)乳酸的真實(shí)發(fā)酵體系中，AvLOX/CS/GO/GC乳酸生物傳感器的檢測(cè)與高效液相色譜檢測(cè)的結(jié)果較為吻合，在24、48和72 h的發(fā)酵樣品中，檢測(cè)相對(duì)誤差分別為9.7%、4.07%和8.61%，表明傳感器在低濃度底物下誤差相對(duì)較大，總體檢測(cè)誤差較小(表2)。與高效液相色譜檢測(cè)相比，該傳感器可以快速獲取發(fā)酵液中乳酸含量。由此可知，所制備的乳酸生物傳感器能夠?qū)崿F(xiàn)復(fù)雜發(fā)酵體系中的乳酸檢測(cè)，檢測(cè)準(zhǔn)確性良好，具有良好的應(yīng)用潛力。

表1 乳酸生物傳感器在模擬發(fā)酵體系中的檢測(cè)結(jié)果Table 1 Detection results in simulated fermentation broth by as-preparedlactic acid biosensor

表2 乳酸生物傳感器在真實(shí)發(fā)酵體系中的檢測(cè)結(jié)果Table 2 Detection results in real fermentation broth by as-preparedlactic acid biosensor and HPLC

將AvLOX/CS/GO/GC乳酸生物傳感器與目前文獻(xiàn)中的乳酸生物傳感器的性能進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知：AvLOX/CS/GO/GC乳酸生物傳感器表現(xiàn)出較好檢測(cè)低濃度乳酸的能力，相比于其他乳酸生物傳感器，本研究所構(gòu)建的乳酸生物傳感器響應(yīng)時(shí)間短，可實(shí)現(xiàn)發(fā)酵液中乳酸含量的快速檢測(cè)。

表3 乳酸生物傳感器檢測(cè)性能參數(shù)比較Table 3 Analytical characteristics of the lactic acid biosensors.

3 結(jié)論

通過(guò)高效檢測(cè)酶元件表達(dá)與固定化方案優(yōu)化制備了靈敏度高、響應(yīng)時(shí)間短且穩(wěn)定性強(qiáng)的乳酸生物傳感器。在大腸桿菌中異源重組表達(dá)的AvLOX比酶活高達(dá)28.8 U/mg，在溫度為30～60 ℃和pH為6.0～7.5時(shí)，具有良好的穩(wěn)定性，為電極的高靈敏度和快速響應(yīng)提供了優(yōu)異的檢測(cè)酶元件。進(jìn)一步，從生物相容性、固定化率和酶量3個(gè)方面優(yōu)化了重組AvLOX酶的固定化條件，確定了1.0 U的酶負(fù)載量與12.5 g/L殼聚糖固定化試劑的組合固定化方式，可有效提高電極的檢測(cè)靈敏性與穩(wěn)定性。最后，通過(guò)層層組裝，將氧化石墨烯、殼聚糖和AvLOX固定于玻碳電極上，制備了AvLOX/CS/GO/GC乳酸電化學(xué)生物傳感器，其靈敏度為45 μA·L /(mmol· cm2)，線(xiàn)性范圍為0.1～0.9 mmol/L，響應(yīng)時(shí)間為4 s，儲(chǔ)存96 h后仍可以維持95%以上檢測(cè)活性，最佳工作溫度和pH分別為40 ℃和7.0。所制備的乳酸生物傳感器實(shí)現(xiàn)了在模擬和真實(shí)發(fā)酵體系中乳酸含量的快速檢測(cè)，相對(duì)誤差分別小于6.5%和10%，具有應(yīng)用于乳酸發(fā)酵過(guò)程檢測(cè)的潛力。