陳文忠，丘曉丹，肖 杭，莊 翌，程 光

(1.南京綠葉制藥有限公司 研發(fā)中心，江蘇 南京 210061；2.南京醫(yī)科大學 實驗動物中心，江蘇 南京 210009)

羥基喜樹堿(hydroxycamptothecin，HCPT)為拓撲異構(gòu)酶Ⅰ特異性抑制劑，是有效的抗腫瘤藥物。羥基喜樹堿注射液(M-HCPT)已經(jīng)用于臨床，因為存在半衰期較短、靶向性較差的缺點，臨床應(yīng)用時需延長給藥時間或延長療程，導致骨髓抑制和消化道毒性相關(guān)的劑量限制性毒性(DLT)也隨之增加，從而限制了其臨床應(yīng)用[1-5]。脂質(zhì)體作為一種新型劑型，可以通過增加羥基喜樹堿重要活性基團δ內(nèi)酯環(huán)在水溶液和血液中的穩(wěn)定性來改善藥物的藥代動力學特性和體內(nèi)組織分布，增加其對腫瘤組織的靶向性和緩釋性，從而達到增強療效、降低毒性的目的[6-13]。

本課題組前期已經(jīng)完成羥基喜樹堿脂質(zhì)體的研制及制備，同時評價了羥基喜樹堿脂質(zhì)體的小鼠體內(nèi)抗腫瘤藥效且取得突破性的進展[14]。本研究依據(jù)中國食品藥品監(jiān)督管理局(NMPA)發(fā)布的新藥非臨床藥理毒理相關(guān)指導原則[11-12]，進行了羥基喜樹堿脂質(zhì)體給予Beagle犬靜脈滴注4周的長期毒性試驗，觀察其毒性反應(yīng)及其可逆性，發(fā)現(xiàn)潛在毒性靶器官，并與市售普通制劑羥基喜樹堿注射液的毒性進行比較研究，以期為臨床研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與儀器

羥基喜樹堿原料藥，美爾雅(集團)美升藥業(yè)有限公司；蛋黃卵磷脂，南京綠葉制藥有限公司；膽固醇，南京新百藥業(yè)有限公司；環(huán)磷酰胺(批號：03112721)，江蘇省恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；甲醇、乙腈為色譜純試劑，其他試劑為市售分析純。

ADVIA 120型全自動血液分析儀，拜耳公司；CA-1500型血凝儀，希森美康醫(yī)用電子(上海)有限公司；XPAND全自動生化儀，Dade-Behring公司；EasyLyte plus鉀鈉氯電解分析儀，MEDICA公司；ECG-651心電圖儀，上海光電公司；徠卡-2015切片機，德國徠卡公司；TSJ-Q型全自動封閉式組織脫水機、BMJ-III型包埋機、PHY-III型病理組織漂烘儀，常州中威公司；顯微鏡，尼康儀器(上海)有限公司；Mastersize 2000型激光粒徑分析儀，英國MALVERN公司；島津高效液相色譜儀，日本島津公司。

1.2 動物

普通級Beagle犬30只，雌雄對半，7～8月齡，體質(zhì)量7～9 kg，南京新學人科技開發(fā)有限公司，合格證號：SCXK(蘇)2002-0028。

1.3 方法

1.3.1 羥基喜樹堿脂質(zhì)體的制備及表征

1)羥基喜樹堿脂質(zhì)體的制備。將蛋黃卵磷脂、膽固醇、羥基喜樹堿溶于適量無水乙醇中，過0.22 μm濾膜除菌，濾液置茄形瓶中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，減壓抽干成膜[13]。將枸櫞酸鈉、枸櫞酸溶于適量質(zhì)量分數(shù)5%葡萄糖注射液，pH 5.0左右過0.22 μm濾膜除菌，再將此溶液加入上述茄形瓶中洗膜，洗膜完全后置于熱水浴中孵育20 min，再冷卻后進行高壓均質(zhì)處理，并經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除菌。按每瓶含2 mg羥基喜樹堿進行分裝、凍干、壓塞、出箱、軋口，即得羥基喜樹堿脂質(zhì)體。

2)羥基喜樹堿脂質(zhì)體的粒徑及分布研究。取一瓶羥基喜樹堿脂質(zhì)體，加5%葡萄糖注射液4 mL振蕩溶解，搖勻，取適量樣品加入到5%葡萄糖分散溶劑中，用Mastersize2000型激光粒徑分析儀進行測定。

3)羥基喜樹堿脂質(zhì)體的含量測定。采用高效液相色譜外標法測定含量，該法準確、靈敏、分離效果好，專屬性強，是制劑分析的首選方法。色譜柱為Lichrospher 5- C18，4.6 mm×250 mm，5 μm(江蘇漢邦科技有限公司)，流動相為甲醇-水溶液(兩者體積為55∶45)，檢測波長266 nm，流速1 mL/min，進樣量20 μL，理論塔板數(shù)≥1 500。精密稱取羥基喜樹堿對照品適量，用甲醇制成每1 mL中約含100 μg的溶液作為儲備液，然后分別取儲備液適量，加流動相2 mL并用甲醇稀釋制成1 mL中含0.2、1.0、5.0、10.0、20.0、35.0和50.0 μg羥基喜樹堿溶液作為標準溶液，取20 μL進樣，記錄色譜圖，以質(zhì)量濃度ρ為Y，峰面積A為X，進行線性回歸，繪制標準曲線。將樣品峰面積帶入標準曲線即可測得羥基喜樹堿含量。

4)羥基喜樹堿脂質(zhì)體的包封率及載藥量測定。精密量取供試品溶液0.2 mL，加入已平衡好的凝膠柱內(nèi)，用洗脫溶液洗脫。先定量收集15 mL混濁液(脂質(zhì)體部分)，置于25 mL量瓶中加水至刻度后搖勻，精密量取1 mL置于2 mL量瓶中加甲醇至刻度后搖勻，按照含量測定方法精密量取20 μL，進行液相色譜分析，記錄色譜圖，測得峰面積(Ae)。

凝膠柱接著用5 mL 33%乙醇、5 mL 66%乙醇和100%乙醇進行梯度洗脫，定量收集25 mL(即未包入脂質(zhì)體的游離羥基喜樹堿部分)，搖勻，按照含量測定方法精密量取20 μL，進行液相色譜分析，記錄色譜圖，測得峰面積(Af)。

另精密吸取供試品溶液0.2 mL置于10 mL量瓶內(nèi)，先加2 mL流動相，再用甲醇稀釋至刻度后搖勻，照含量測定方法精密量取20 μL，進行液相色譜分析，記錄色譜圖，測得總峰面積(At)。

按式(1)～(2)計算包封率和回收率。

羥基喜樹堿脂質(zhì)體載藥量的計算見式(3)。

(1)

(2)

(3)

1.3.2 劑量選擇依據(jù)

根據(jù)前期荷瘤小鼠藥效學結(jié)果，羥基喜樹堿脂質(zhì)體1 mg/kg劑量對小鼠移植性腫瘤H22、S180均有明顯抑制作用，與溶媒對照組比較，抑瘤率為80%左右。羥基喜樹堿脂質(zhì)體的臨床擬用劑量為6 mg/(人·日)，按體質(zhì)量60 kg計，約相當于0.10 mg/(kg·d)。

綜合動物模型有效劑量、臨床擬用劑量及毒性預(yù)試驗結(jié)果，設(shè)置本研究高、中、低組劑量為1.2、0.6和0.3 mg/kg，約相當于臨床擬用劑量的12、6和3倍。

1.3.3 分組與給藥

成年Beagle犬30只按照體質(zhì)量和性別隨機分為生理鹽水對照組，市售羥基喜樹堿注射液對照組，羥基喜樹堿脂質(zhì)體低、中、高劑量實驗組，每組6只，雌雄對半。低、中、高劑量實驗組分別給藥0.3、0.6和1.2 mg/kg的羥基喜樹堿脂質(zhì)體，市售普通制劑對照組給予1.2 mg/kg羥基喜樹堿注射液，4.0 mL/kg靜脈滴注，給藥速度為1 mL/min，每日1次，連續(xù)給藥2 d停藥2 d，共連續(xù)滴注4周，共給藥14次。停藥后繼續(xù)觀察兩周。

1.3.4 檢測指標

給藥期及恢復(fù)期每日兩次觀察動物的臨床癥狀，體質(zhì)量和攝食量每周稱量1次。給藥前、給藥4周及恢復(fù)2周結(jié)束時檢查動物的體溫、心電、尿液和糞便，采集靜脈血液進行血生化及血液學檢查。

給藥結(jié)束每組取4只動物，恢復(fù)期結(jié)束取剩余2只動物安樂死后進行解剖，對肝、肺、腎及腦等臟器進行稱質(zhì)量并計算臟器系數(shù)(臟器系數(shù)=器官質(zhì)量(濕質(zhì)量)/體質(zhì)量×100%)。

所有臟器采用10%福爾馬林溶液室溫固定24 h以上，用全自動封閉式組織脫水機對固定的組織進行脫水，采用石蠟包埋機進行包埋，用切片機進行切片，切片厚度為3～5 μm，將組織切片移入40 ℃的恒溫熱水器中，待組織片完全展開后將其貼附于載玻片上，經(jīng)組織漂烘儀56～60 ℃烤片30～60 min后，采用蘇木素和伊紅進行染色(HE染色)和封片后，在顯微鏡下觀察組織病理學變化。同時采集胸骨骨髓制作涂片，瑞氏和姬姆薩氏混合染色后進行骨髓細胞分類計數(shù)。

1.3.5 統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)均采用x±s 表示，試驗計量數(shù)據(jù)以方差分析、t-檢驗進行藥物組與對照組之間的差異比較。

2 結(jié)果與討論

2.1 羥基喜樹堿脂質(zhì)體的表征

2.1.1 羥基喜樹堿脂質(zhì)體粒徑及分布

經(jīng)馬爾文激光粒度分析儀測定，所得羥基喜樹堿脂質(zhì)體031031、031105及031109這3批平均粒徑結(jié)果見表1。由表1可知：3個批號的羥基喜樹堿脂質(zhì)體的平均粒徑(D50)為0.357～0.406 μm，粒徑分布特征值D10、D50和D90的結(jié)果相似，說明制備的羥基喜樹堿脂質(zhì)體的重現(xiàn)性好。

表1 羥基喜樹堿脂質(zhì)體粒徑及分布Table 1 Particle size and distribution of hydroxycamptothecin liposomes

2.1.2 羥基喜樹堿脂質(zhì)體的含量測定

采用高效液相色譜外標法測定含量，羥基喜樹堿對照品以質(zhì)量濃度(ρ)對主峰面積A進行回歸，結(jié)果見表2。由表2的數(shù)據(jù)得ρ= 0.000 009 722A-0.054 72，R=0.999 9，表明羥基喜樹堿在0.204～51.0 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈線性關(guān)系。

表2 羥基喜樹堿的標準曲線Table 2 Standard curve of hydroxycamptothecin

取3個不同批次031031、031105和031109脂質(zhì)體供試品，根據(jù)主峰峰面積，以外標法計算出羥基喜樹堿的質(zhì)量分別為1.98、1.96 和1.97 mg，質(zhì)量分數(shù)分別為98.9%、98.0%、98.5%，由此得到本方法的最低檢測限為0.04 ng。

2.1.3 羥基喜樹堿脂質(zhì)體的包封率及載藥量測定

采用凝膠柱法測定羥基喜樹堿脂質(zhì)體的包封率和載藥量，結(jié)果見表3。由表3可知：3批羥基喜樹堿脂質(zhì)體包封率為93%～95%，包封率較高，重現(xiàn)性好，滿足藥典對脂質(zhì)體藥物的包載要求。計算載藥量為0.75%左右。

表3 羥基喜樹堿脂質(zhì)體包封率及載藥量測定結(jié)果Table 3 Encapsulation efficiency and drug loading of hydroxycamptothecin liposomes

2.2 羥基喜樹堿脂質(zhì)體對Beagle犬體質(zhì)量和攝食量的影響

考察羥基喜樹堿脂質(zhì)體經(jīng)靜脈滴注給藥(0.3、0.6和1.2 mg/kg)對Beagle犬體質(zhì)量及攝食量的影響，結(jié)果見表4。給藥期間，籠旁觀察結(jié)果：在1.2 mg/kg羥基喜樹堿脂質(zhì)體及同劑量的羥基喜樹堿注射液給藥后動物陸續(xù)出現(xiàn)食欲不佳、糞便稀溏和活動抑制現(xiàn)象，部分動物出現(xiàn)嘔吐和便血。在0.6 mg/kg劑量下部分動物出現(xiàn)類似反應(yīng)，但癥狀較輕。由表4可知：給藥期后兩周，與對照組相比，1.2 mg/kg羥基喜樹堿脂質(zhì)體及羥基喜樹堿注射液引起動物的體質(zhì)量和攝食量顯著降低(P<0.01)。以上變化與羥基喜樹堿脂質(zhì)體給藥治療相關(guān)，但停藥后可自行恢復(fù)。

表4 羥基喜樹堿脂質(zhì)體對Beagle犬體質(zhì)量的影響(Mean±SD)Table 4 Effects of hydroxycamptothecin liposomes on the body weight of Beagle dogs (Mean±SD) mg

2.3 羥基喜樹堿脂質(zhì)體對Beagle犬血液學和血生化各項指標的影響

考察羥基喜樹堿脂質(zhì)體注射液經(jīng)靜脈滴注給藥(0.3、0.6和1.2 mg/kg)對Beagle犬靜脈血液相關(guān)指標的影響，結(jié)果分別見表5～6。由表5～6可知：與陰性對照組相比，1.2 mg/kg羥基喜樹堿脂質(zhì)體引起動物單核細胞(MONO)和網(wǎng)織紅細胞(RETC)顯著降低(P<0.01)，0.6 mg/kg脂質(zhì)體劑量組動物單核細胞(MONO)、網(wǎng)織紅細胞(RETIC)百分數(shù)、白細胞(WBC)、嗜酸粒細胞(EOS)、未染色大粒細胞(LUC)百分數(shù)、淋巴細胞(LYMPH)、嗜堿粒細胞(BASO)等指標明顯降低(P<0.05，P<0.01)；血液生化水平方面，1.2 mg/kg羥基喜樹堿脂質(zhì)體引起犬尿素氮(BUN)顯著升高(P<0.05)。2周恢復(fù)期結(jié)束時，以上異常指標均恢復(fù)正常。

表5 羥基喜樹堿脂質(zhì)體對Beagle犬血液學的影響(Mean±SD)Table 5 Effects of hydroxycamptothecin liposome on hematology of Beagle dogs(Mean ±SD)

表6 羥基喜樹堿脂質(zhì)體對Beagle犬血清生化BUN指標的影響(Mean ±SD)Table 6 Effects of hydroxycamptothecin liposomes on serum biochemical parameter of BUN in Beagle dogs (Mean ±SD) mmol·L-1

2.4 羥基喜樹堿對體溫、心電、尿液和糞便指標的影響

考察羥基喜樹堿脂質(zhì)體經(jīng)靜脈滴注給藥(0.3、0.6和1.2 mg/kg)對Beagle犬體溫、心電、尿液和糞便的影響(數(shù)據(jù)未顯示)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與給藥前相比，1.2 mg/kg羥基喜樹堿脂質(zhì)體高劑量組和羥基喜樹堿注射液組少量動物肉眼可見糞便帶血，但2周恢復(fù)期結(jié)束時已恢復(fù)正常。除此之外，各個給藥組動物的尿液、體溫和心電圖參數(shù)未見明顯異常。

2.5 羥基喜樹堿對臟器系數(shù)的影響

羥基喜樹堿脂質(zhì)體經(jīng)靜脈滴注給藥Beagle犬0.3、0.6和1.2 mg/kg，每日1次，連續(xù)給藥2 d，停藥2 d，連續(xù)滴注4周，在28 d給藥結(jié)束及2周恢復(fù)期結(jié)束時采集Beagle犬肝、肺、腎和腦進行稱質(zhì)量并計算臟器系數(shù)，結(jié)果見表7。由表7可知：與陰性對照組相比，1.2 mg/kg和0.6 mg/kg羥基喜樹堿脂質(zhì)體組動物肝臟器系數(shù)降低及腦臟器系數(shù)增加(P<0.01)；1.2 mg/kg 脂質(zhì)體劑量組引起腎臟器系數(shù)增加(P<0.05)。1.2 mg/kg注射液組動物肺、腦臟器系數(shù)增加(P<0.05，P<0.01)。以上變化在停藥兩周后逐漸恢復(fù)至正常水平。

表7 羥基喜樹堿脂質(zhì)體對Beagle犬主要臟器系數(shù)的影響(Mean±SD)Table 7 Effects of hydroxycamptothecin liposomes on main organ coefficient of Beagle dogs(Mean ±SD) %

2.6 對骨髓細胞的影響

羥基喜樹堿脂質(zhì)體經(jīng)靜脈滴注給予Beagle犬0.3、0.6和1.2 mg/kg，每日1次，連續(xù)給藥2 d，停藥2 d，連續(xù)滴注4周，在28 d給藥結(jié)束時，采集Beagle犬胸骨骨髓制作涂片，進行骨髓細胞分類計數(shù)，結(jié)果見表8。由表8可知：與陰性對照組相比，羥基喜樹堿脂質(zhì)體各給藥組酸堿粒細胞比值明顯下降(P<0.05，P<0.01)，1.2 mg/kg組成熟粒細胞比值明顯降低(P<0.05)。2周恢復(fù)期結(jié)束，以上異常指標均恢復(fù)正常。由此可說明，該藥物對紅細胞和粒細胞有明顯且可逆的抑制作用。

表8 羥基喜樹堿脂質(zhì)體對Beagle犬骨髓細胞的影響(Mean±SD)Table 8 Effects of hydroxycamptothecin liposomes on bone marrow cells of Beagle dogs(Mean±SD) %

2.7 大體病理及組織病理檢查結(jié)果

羥基喜樹堿脂質(zhì)體經(jīng)靜脈滴注給藥(0.3、0.6和1.2 mg/kg)，每日1次，連續(xù)給藥2 d，停藥2 d，連續(xù)滴注4周，在28 d給藥結(jié)束時，對犬剖檢后對所有組織進行肉眼觀察發(fā)現(xiàn)羥基喜樹堿脂質(zhì)體0.6、1.2 mg/kg劑量組以及市售注射液對照組動物的十二指腸、回腸及直腸黏膜面見輕度充血及少量點狀出血。除此之外，未發(fā)現(xiàn)其他明顯異常改變。市售羥基喜樹堿注射液對照組給藥中期死亡1只動物，解剖可見十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結(jié)腸和脾臟有不同程度的出血，推測消化道出血可能是誘發(fā)動物死亡的主要原因。

利用組織病理檢查來考察羥基喜樹堿脂質(zhì)體對睪丸、大腸、胸骨、給藥部位(皮膚)、垂體是否有損傷作用，結(jié)果分別見圖1～4。

由圖1可知：市售羥基喜樹堿注射液1.2 mg/kg高劑量組，少部分曲細精管初級、次級和精子細胞變性、壞死，核結(jié)構(gòu)消失；羥基喜樹堿脂質(zhì)體1.2 mg/kg高劑量組，大部分曲細精管生精細胞變性、壞死，核結(jié)構(gòu)消失。

圖1 睪丸病理組織切片圖(HE×100)Fig.1 Histological changes of testis in Beagle dogs(HE×100)

由圖2 可知：市售羥基喜樹堿注射液1.2 mg/kg高劑量組，大腸上皮壞死，局部肉芽形成，殘存少量的黏膜腺；羥基喜樹堿脂質(zhì)體1.2 mg/kg高劑量組，腸上皮變性，腸腺擴張。

圖2 大腸病理組織切片圖(HE×100)Fig.2 Histological changes of large intestine in Beagle dogs(HE×100)

由圖3可知：胸骨骨髓白細胞均減少，市售羥基喜樹堿注射液1.2 mg/kg高劑量組的骨髓白細胞明顯減少；羥基喜樹堿脂質(zhì)體1.2 mg/kg高劑量組的骨髓白細胞明顯減少。

圖3 胸骨病理組織切片圖(HE×100)Fig.3 Histological changes of sternum in Beagle dogs(HE×100)

由圖4可知：市售羥基喜樹注射液堿1.2 mg/kg高劑量組，腺垂體細胞稀疏，嗜堿細胞和顯色細胞明顯減少；羥基喜樹堿脂質(zhì)體1.2 mg/kg高劑量組，腺垂體細胞稀疏，嗜堿細胞和嫌色細胞明顯減少。由此可知，羥基喜樹堿脂質(zhì)體對以上器官的毒性與市售羥基喜樹堿注射液的毒性表現(xiàn)及程度基本一致，羥基喜樹堿脂質(zhì)體對睪丸的毒性作用強于羥基喜樹堿注射液，其他器官未見明顯的毒性作用。2周恢復(fù)期結(jié)束，所有動物各臟器異常均可恢復(fù)至正常水平。

圖4 腺垂體病理組織切片圖(HE×100)Fig.4 Histological changes of adenohypophysis in Beagle dogs(HE×100)

本研究通過對Beagle犬4周靜脈滴注羥基喜樹堿脂質(zhì)體的長期毒性試驗，得出如下結(jié)論：注射用羥基喜樹堿脂質(zhì)體有明顯的消化道毒性反應(yīng)，主要表現(xiàn)為消化道出血、食欲不振、嘔吐或干嘔、流涎、攝食減少、體質(zhì)量減輕、稀便腹瀉，同時可見明顯的活動減少和萎靡表現(xiàn)。血液學和骨髓檢查提示該藥物對紅細胞和粒細胞有明顯的抑制作用，說明對造血系統(tǒng)有影響。另外，血清生化學檢查顯示該藥物對腎臟有輕度影響。病理組織學檢查顯示其對給藥部位(皮膚)、垂體、大腸、胸骨、睪丸有一定損傷作用。但以上所有毒性表現(xiàn)均可逆，停藥兩周即可恢復(fù)或正在恢復(fù)，前期的毒代動力學研究發(fā)現(xiàn)，在0.3～1.2 mg/kg劑量下連續(xù)靜脈給予Beagle犬4周，羥基喜樹堿脂質(zhì)體在犬血液中未見明顯蓄積現(xiàn)象，充分證實了該藥物的毒性反應(yīng)大多可逆，停藥后恢復(fù)較快。

3 結(jié)論

利用脂質(zhì)體遞送技術(shù)將羥基喜樹堿包裹成脂質(zhì)體，毒性研究結(jié)果顯示：羥基喜樹堿脂質(zhì)體不產(chǎn)生新的嚴重毒副反應(yīng)，毒性靶器官主要為消化道和睪丸，但毒性可逆，停藥即可恢復(fù)；同等劑量的羥基喜樹堿脂質(zhì)體和市售羥基喜樹堿注射液毒性表現(xiàn)及程度相當；羥基喜樹堿脂質(zhì)體對犬的無毒性劑量大約為0.3 mg/kg，與市售羥基喜樹堿注射液相比具有更大的治療效果。這與羥基喜樹堿脂質(zhì)體良好的生物相容性以及脂質(zhì)體載體藥物在體內(nèi)作為儲庫不斷緩慢釋放藥物、延長藥物半衰期具有密切關(guān)系，值得進行深入研究。